הכנת דגימות רשתית למיקרוסקופ אלקטרונים נפח
24 במאי 2024
פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים להכנת דגימות רשתית עבור מיקרוסקופ אלקטרונים נפח, תוך התמקדות בתכונות המבניות של הדקי קולטני אור ברשתית.
אנו מתמקדים בבחינת התכונות המבניות התלת-ממדיות הננומטריות של הדקי פוטורצפטור ברשתית העכבר. המטרה העיקרית שלנו היא לתכנן שיטת הכנת דגימות EM תלת-ממדית המתאימה לנפח קטן של דגימות ביולוגיות, ושחזרנו את המבנה הסופי של פוטורצפטורים ברשתית באמצעות FIB-SEM. באמצעות דגימות EM תלת-ממדיות ברשתית בשיטת OTO, פילחנו ושחזרנו את המבנה התלת-ממדי של ארבעה סוגים של מסופי קולטני אור ולאחר מכן ניתחנו את הקשר בין מרכיביהם.
פרוטוקול וריאציית דגימת הרשתית שלנו ידידותי למשתמש, אינו דורש ציוד שמיעתי ומקצר את זמן עיבוד החיישן. עם זאת, ייתכנו כמה בפרטים של קרום התא, אשר בעתיד, אנו מקווים להמשיך לחקור את הפונקציה של כל רכיב בתוך מסוף הרשתית ואת תפקידו (indistinct)
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול להכנת דגימות רשתית עבור מיקרוסקופיה אלקטרונית נפחית, ובפרט לבחינת המאפיינים המבניים של קצוות קולטני האור ברשתית של עכבר. באמצעות טכניקת מיקרוסקופיה אלקטרונית סורקת עם אלומת יונים ממוקדת (FIB-SEM), שאפו החוקרים לנתח את המבנים התלת-ממדיים בקנה מידה ננומטרי של קצוות קולטני האור.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- ביופיזיקה
- מיקרוסקופיה אלקטרונית
רקע
- שיטה זו מאפשרת בחינה של מבנים תאיים בקנה מידה ננומטרי.
- המחקר מדגיש את החשיבות של הבנת הקצוות של הפוטורצפטורים ברשתית.
- FIB-SEM מיושם הודות ליכולתו לספק תובנות מבניות מפורטות.
- הפרוטוקול תוכנן להיות ידידותי למשתמש ויעיל, דבר החשוב עבור נפחי דגימה קטנים.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקת הכנה אופטימלית של דגימות עבור אנליזה של הרשתית.
- שחזור והבנה של המבנה התלת-ממדי של קצוות קולטני האור (photoreceptor terminals).
- ניתוח הקשר בין הרכיבים של קצוות קולטני האור.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הפלטפורמה שבה נעשה שימוש היא מיקרוסקופיה אלקטרונית נפחית באמצעות FIB-SEM.
- המודל הביולוגי כולל רצועות רשתית שבודדו מעכברים שהורדמו.
- השלבים המפורטים כוללים קיבוע, טיפול באוסמיום טטראוקסיד וחדירת שרף.
- השיטה מדגישה זמני אינקובציה ספציפיים ומבטיחה שימור של מבנים תאיים.
- האתגרים שצוינו כוללים טשטוש פוטנציאלי בפרטי ממברון התא במהלך הדימוי.
תוצאות עיקריות
- המחקר ביצע בהצלחה סגמנטציה ושחזור של מבנים תלת-ממדיים של ארבעה סוגי טרמינלים של פטורצפטורים.
- הממצאים מצביעים על שימור משופר של מבני ממברנת התא בהשוואה לשיטות מסורתיות.
- מסקנות חשובות מדגישות את הפוטנציאל של שיטה זו לחקירה עתידית של פעילות סינפטית.
מסקנות
- מחקר זה מדגים פרוטוקול יעיל להכנת דגימות רשתית המשפר את איכות ההדמיה.
- התובנות שנרכשו עשויות לסייע בהבנת המנגנונים העצביים המעורבים באינטראקציות סינפטיות.
- לשיטה זו השלכות משמעותיות עבור מחקר עתידי בביולוגיה של הרשתית ובנוירופיזיולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הכנת דגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית נפחית (Volume EM) עבור רקמת רשתית מאפשרת ויזואליזציה תלת-ממדית ברזולוציה גבוהה של הארכיטקטורה הנוירונלית, ובכך נותנת מענה ישיר לאתגר של כימות מבנים סינפטיים ברקמות מורכבות. יכולת זו מגבירה את הביטחון החזוי בשלבים מוקדמים של גילוי ותיקוף מטרות, על ידי אספקת הקשר מדויק בקנה מידה ננומטרי עבור קישוריות סינפטית וניתוח מאגרי שלפוחיות. זרימת העבודה המיושנת של הפרוטוקול תומכת בדימות סקילבילי וניתן לשחזור, החיוני עבור תיקי מו"פ בנוירוסיינס תרגומי ובתחום הנוירו-פארמה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מיפוי תלת-ממדי מדויק של קצות הסינפסים של הפוטורצפטורים לצורך הפחתת סיכונים מכניסטיים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי הבהרת הארגון התת-תאי הרלוונטי להעברה סינפטית.
- מסייע בחקירה מונחית-השערות של קישוריות נוירונלית במערכות הרלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין דגימות רשתית עובריות (validated) עבור זרימות עבודה של דימוי בעל תוכן גבוה (high-content imaging) בהמשך התהליך.
- משפר את הדיוק החזרתי (reproducibility) והסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות עיבוד דגימות עקבי.
- מייצר מערכי נתונים תלת-ממדיים (3D) כמותיים המתאימים לניתוח השוואתי של מאפיינים סינפטיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פלטי דימות מבנית לגילוי סממנים ביולוגיים תרגומיים במודלים של ניוון עצבי.
- מאפשרת המשכיות מתובנות מבניות בשלב הגילוי לוולידציה פרה-קלינית של מטרות סינפטיות.
- תומכת בקידום מותאם סיכונים באמצעות אספקת נקודות סיום מורפולוגיות חסונות.
שילוב זרימת עבודה ותהליכי עיבוד (Pipeline)
פרוטוקול הכנת הדגימות הזה משולב ברצף השלב של גילוי ועד למחקר פרה-קליני, ומאפשר ניתוח מבני ברזולוציה גבוהה, החל מבדיקה ראשונית של השערות, דרך זיהוי מולקולות מובילות (lead identification) ועד למחקר תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת נתונים אולטרסטרוקטורליים בתלת-ממד לבחינת היפותזות והבהרה של מסלולים במדעי העצבים של הרשתית.
- סריקה: מספקת דגימות בעלות ניגודיות גבוהה וניתנות לשחזור עבור דימוי כמותי וניתוח השוואתי.
- אנליטיקה: תומכת בסגמנטציה ומדידה של מאגרי שלפוחיות סינפטיות ומבנה הטרמינליה.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים על ידי התאמת נקודות סוף מבניות עם ביומרקרים תפקודיים.
- שימוש חוזר ארגוני: קובעת פרוטוקול סטנדרטי הניתן להסתגל לרקמות נוירונליות אחרות ליישום ברחב הפורטפוליו.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות בתיקוף של מטרות סינפטיות.
- ערך תפעולי: מייעל את הכנת הדגימות באמצעות שלבים ידידותיים למשתמש ודרישות ציוד מינימליות.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת ההחלטות בנוגע להמשך פיתוח (go/no-go) על ידי אספקת נתונים תלת-ממדיים כמותיים ורובסטיים.
- השפעה על פורט폴יו: מאפשר תיעדוף של נכסי נוירו-פארמה מותאם סיכון, בהתבסס על נקודות סיום מבניות מתוקתקות.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בדיסקציה של הרשתית וטיפול בדגימות למיקרוסקופיה אלקטרונית.
- נדרשת גישה למכשור FIB-SEM ולתשתית ניתוח תמונות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין צוותים להבטחת הדירות (reproducibility) בין מחקרים.
- ניתן להתאימו לרקמות עצביות אחרות בעלות נפח קטן באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- פוטנציאל לטשטוש בפרטי הממברנה עשוי להצריך דיוק נוסף עבור יישומים ספציפיים.
