Name: בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:10:00.000+00:00
Duration: 10 min 56 s
Description: חקור בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות ליפידיות בגודל ננו ומיקרומטר. השיטה משלבת שחזור חלבוני ממברנה וכימוס אנזימים ליצירת תאים סינתטיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים מודים לאדיטיה אייר על שיבוט הגן pBAD-PercevalHR ולגיאה שורמן-וולטרס על הסיוע בייצור וטיהור חלבונים. המחקר מומן על ידי תוכנית הכבידה של NWO "בניית תא סינתטי" (BaSyC).

פרוטוקול אנקפסולציה של שלפוחית שומנים עבור רשתות חלבונים מורכבות

<ol><li>Hirschi, S., Ward, T. R., Meier, W. P., Müller, D. J., Fotiadis, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology%3A+bottom-up+assembly+of+molecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology: bottom-up assembly of molecular systems.</a> Chem Rev. 122 (21), 16294-16328 (2022).</li>
<li>Ivanov, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bottom-up+synthesis+of+artificial+cells%3A+recent+highlights+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Chem+Biomol.+Eng%22%5BJournal%5D)">Bottom-up synthesis of artificial cells: recent highlights and future challenges.</a> Annu Rev Chem Biomol. Eng. 12 (1), 287-308 (2021).</li>
<li>Clomburg, J. M., Crumbley, A. M., Gonzalez, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industrial+biomanufacturing%3A+The+future+of+chemical+production%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Industrial biomanufacturing: The future of chemical production.</a> Science. 355 (6320), (2017).</li>
<li>Shi, T., Han, P., You, C., Zhang, Y. -H. P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+synthetic+biology+platform+for+emerging+industrial+biomanufacturing%3A+Bottom-up+pathway+design%5BTitle%5D)+AND+%22Synth+Syst+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An in vitro synthetic biology platform for emerging industrial biomanufacturing: Bottom-up pathway design.</a> Synth Syst Biotechnol. 3 (3), 186-195 (2018).</li>
<li>Wang, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Liver-target+and+glucose-responsive+polymersomes+toward+mimicking+endogenous+insulin+secretion+with+improved+hepatic+glucose+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Liver-target and glucose-responsive polymersomes toward mimicking endogenous insulin secretion with improved hepatic glucose utilization.</a> Adv Funct Mater. 30 (13), 1910168(2020).</li>
<li>Kanter, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-free+production+of+scFv+fusion+proteins%3A+an+efficient+approach+for+personalized+lymphoma+vaccines%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell-free production of scFv fusion proteins: an efficient approach for personalized lymphoma vaccines.</a> Blood. 109 (8), 3393-3399 (2007).</li>
<li>Zeltins, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+and+characterization+of+virus-like+particles%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction and characterization of virus-like particles: a review.</a> Mol Biotechnol. 53 (1), 92-107 (2013).</li>
<li>Jain, K. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+and+personalized+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Princ+Pract%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology and personalized medicine.</a> Med Princ Pract. 22 (3), 209-219 (2013).</li>
<li>Schwille, P., Frohn, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+protein+functions+and+what+they+may+teach+us%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Hidden protein functions and what they may teach us.</a> Trends Cell Biol. 32 (2), 102-109 (2022).</li>
<li>Sachsenmeier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Industry+5.0-The+relevance+and+implications+of+bionics+and+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Engineering%22%5BJournal%5D)">Industry 5.0-The relevance and implications of bionics and synthetic biology.</a> Engineering. 2 (2), 225-229 (2016).</li>
<li>Schmidt, D., Jiang, Q. -X., MacKinnon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phospholipids+and+the+origin+of+cationic+gating+charges+in+voltage+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Phospholipids and the origin of cationic gating charges in voltage sensors.</a> Nature. 444 (7120), 775-779 (2006).</li>
<li>Godoy-Hernandez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+highly+stable+membrane+reconstitution+by+LAiR+enables+the+study+of+physiological+integral+membrane+protein+functions%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Rapid and highly stable membrane reconstitution by LAiR enables the study of physiological integral membrane protein functions.</a> ACS Cent Sci. 9 (3), 494-507 (2023).</li>
<li>Sikkema, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gating+by+ionic+strength+and+safety+check+by+cyclic-di-AMP+in+the+ABC+transporter+OpuA%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Gating by ionic strength and safety check by cyclic-di-AMP in the ABC transporter OpuA.</a> Sci Adv. 6 (47), 7697(2020).</li>
<li>Foucaud, C., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lactose+transport+system+of+Streptococcus+thermophilus.+Functional+reconstitution+of+the+protein+and+characterization+of+the+kinetic+mechanism+of+transport%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Lactose transport system of Streptococcus thermophilus. Functional reconstitution of the protein and characterization of the kinetic mechanism of transport.</a> J Biol Chem. 267 (31), 22087-22094 (1992).</li>
<li>Yoneda, J. S., Sebinelli, H. G., Itri, R., Ciancaglini, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+on+solubilization+and+lipid+reconstitution+of+Na%2CK-ATPase%3A+enzyme+kinetic+and+biophysical+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+Rev%22%5BJournal%5D)">Overview on solubilization and lipid reconstitution of Na,K-ATPase: enzyme kinetic and biophysical characterization.</a> Biophys Rev. 12 (1), 49-64 (2020).</li>
<li>Simidjiev, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-assembly+of+large%2C+ordered+lamellae+from+non-bilayer+lipids+and+integral+membrane+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Self-assembly of large, ordered lamellae from non-bilayer lipids and integral membrane proteins in vitro.</a> Proc Natl Acad Sci. 97 (4), 1473-1476 (2000).</li>
<li>Harris, N. J., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+and+stability+of+membrane+transport+proteins+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Folding and stability of membrane transport proteins in vitro.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 1818 (4), 1055-1066 (2012).</li>
<li>Jackson, M. L., Litman, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rhodopsin-egg+phosphatidylcholine+reconstitution+by+an+octyl+glucoside+dilution+procedure%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Rhodopsin-egg phosphatidylcholine reconstitution by an octyl glucoside dilution procedure.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Biomembr. 812 (2), 369-376 (1985).</li>
<li>Geertsma, E. R., Nik Mahmood, N. A. B., Schuurman-Wolters, G. K., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+reconstitution+of+ABC+transporters+and+assays+of+translocator+function%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Membrane reconstitution of ABC transporters and assays of translocator function.</a> Nat Protoc. 3 (2), 256-266 (2008).</li>
<li>Rigaud, J. -L., Pitard, B., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%3A+application+to+energy-transducing+membrane+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+BBA+-+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes: application to energy-transducing membrane proteins.</a> Biochim Biophys Acta BBA - Bioenerg. 1231 (3), 223-246 (1995).</li>
<li>Szoka, F., Papahadjopoulos, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Procedure+for+preparation+of+liposomes+with+large+internal+aqueous+space+and+high+capture+by+reverse-phase+evaporation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Procedure for preparation of liposomes with large internal aqueous space and high capture by reverse-phase evaporation.</a> Proc Natl Acad Sci. 75 (9), 4194-4198 (1978).</li>
<li>Poolman, B., et al. Synthetic Organelles for Energy Conservation and Delivery of Building Blocks for Lipid Biosynthesis. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1">https://www.researchsquare.com/article/rs-3385355/v1</a> (2023).</li>
<li>Lee, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photosynthetic+artificial+organelles+sustain+and+control+ATP-dependent+reactions+in+a+protocellular+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Photosynthetic artificial organelles sustain and control ATP-dependent reactions in a protocellular system.</a> Nat Biotechnol. 36 (6), 530-535 (2018).</li>
<li>Méléard, P., Bagatolli, L. A., Pott, T. Giant unilamellar vesicle electroformation. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aM%C3%A9l%C3%A9ard%2C+P+%22Methods+in+Enzymology%22">Methods in Enzymology</a>. , Elsevier. 161-176 (2009).</li>
<li>Garten, M., Aimon, S., Bassereau, P., Toombes, G. E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+transmembrane+protein%2C+the+voltage-gated+ion+channel%2C+KvAP%2C+into+giant+unilamellar+vesicles+for+microscopy+and+patch+clamp+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a transmembrane protein, the voltage-gated ion channel, KvAP, into giant unilamellar vesicles for microscopy and patch clamp studies.</a> J. Vis. Exp. (95), e52281(2015).</li>
<li>Doeven, M. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((lateral+mobility+and+function+of+membrane+proteins+incorporated+into+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">lateral mobility and function of membrane proteins incorporated into giant unilamellar vesicles.</a> Biophys J. 88 (2), 1134-1142 (2005).</li>
<li>Pols, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+metabolic+network+for+physicochemical+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">A synthetic metabolic network for physicochemical homeostasis.</a> Nat Commun. 10 (1), 4239(2019).</li>
<li>Bailoni, E., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ATP+recycling+fuels+sustainable+glycerol+3-phosphate+formation+in+synthetic+cells+fed+by+dynamic+dialysis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">ATP recycling fuels sustainable glycerol 3-phosphate formation in synthetic cells fed by dynamic dialysis.</a> ACS Synth Biol. 11 (7), 2348-2360 (2022).</li>
<li>Van Der Heide, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+osmotic+signal+and+osmosensing+mechanism+of+an+ABC+transport+system+for+glycine+betaine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">On the osmotic signal and osmosensing mechanism of an ABC transport system for glycine betaine.</a> EMBO J. 20 (24), 7022-7032 (2001).</li>
<li>Van'T Klooster, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+lipid+requirements+of+the+lysine+transporter+Lyp1+from+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Membrane lipid requirements of the lysine transporter Lyp1 from Saccharomyces cerevisiae.</a> J Mol Biol. 432 (14), 4023-4031 (2020).</li>
<li>Lou, G., Anderluzzi, G., Woods, S., Roberts, C. W., Perrie, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+microfluidic-based+approach+to+formulate+size-tuneable+large+unilamellar+cationic+liposomes%3A+Formulation%2C+cellular+uptake+and+biodistribution+investigations%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharm+Biopharm%22%5BJournal%5D)">A novel microfluidic-based approach to formulate size-tuneable large unilamellar cationic liposomes: Formulation, cellular uptake and biodistribution investigations.</a> Eur J Pharm Biopharm. 143, 51-60 (2019).</li>
<li>Weiss, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sequential+bottom-up+assembly+of+mechanically+stabilized+synthetic+cells+by+microfluidics%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Sequential bottom-up assembly of mechanically stabilized synthetic cells by microfluidics.</a> Nat Mater. 17 (1), 89-96 (2018).</li>
<li>Pols, T., Singh, S., Deelman-Driessen, C., Gaastra, B. F., Poolman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymology+of+the+pathway+for+ATP+production+by+arginine+breakdown%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Enzymology of the pathway for ATP production by arginine breakdown.</a> FEBS J. 288 (1), 293-309 (2021).</li>
<li>Yandrapalli, N., Robinson, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-high+capacity+microfluidic+trapping+of+giant+vesicles+for+high-throughput+membrane+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Ultra-high capacity microfluidic trapping of giant vesicles for high-throughput membrane studies.</a> Lab Chip. 19 (4), 626-633 (2019).</li>
<li>Ganzinger, K. A., et al. Microfluidic trapping of vesicles reveals membrane-tension dependent FtsZ cytoskeletal re-organisation. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459">http://biorxiv.org/lookup/doi/10.1101/791459</a> (2019).</li>
<li>Elias, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+characterization+of+biomimetic+membrane+mechanics+with+an+on-chip+micropipette%5BTitle%5D)+AND+%22Micro+Nano+Eng%22%5BJournal%5D)">Microfluidic characterization of biomimetic membrane mechanics with an on-chip micropipette.</a> Micro Nano Eng. 8, 100064(2020).</li>
<li>Robinson, T., Kuhn, P., Eyer, K., Dittrich, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microfluidic+trapping+of+giant+unilamellar+vesicles+to+study+transport+through+a+membrane+pore%5BTitle%5D)+AND+%22Biomicrofluidics%22%5BJournal%5D)">Microfluidic trapping of giant unilamellar vesicles to study transport through a membrane pore.</a> Biomicrofluidics. 7 (4), 044105(2013).</li>
<li>Cooper, A., Girish, V., Subramaniam, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotic+Pressure+Enables+High-Yield+Assembly+of+Giant+Vesicles+in+Solutions+of+Physiological+Ionic+Strengths%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Osmotic Pressure Enables High-Yield Assembly of Giant Vesicles in Solutions of Physiological Ionic Strengths.</a> Langmuir. 39 (15), 5579-5590 (2023).</li>
<li>Tantama, M., Martínez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+energy+status+in+live+cells+with+a+fluorescent+biosensor+of+the+intracellular+ATP-to-ADP+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio.</a> Nat Commun. 4 (1), 2550(2013).</li>
<li>Setyawati, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+reconstitution+of+dynamically+interacting+integral+membrane+subunits+of+energy-coupling+factor+transporters%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">In vitro reconstitution of dynamically interacting integral membrane subunits of energy-coupling factor transporters.</a> eLife. 9, e64389(2020).</li>
<li>Oropeza-Guzman, E., Ríos-Ramírez, M., Ruiz-Suárez, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leveraging+the+coffee+ring+effect+for+a+defect-free+electroformation+of+giant+unilamellar+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Leveraging the coffee ring effect for a defect-free electroformation of giant unilamellar vesicles.</a> Langmuir. 35 (50), 16528-16535 (2019).</li>
<li>Estes, D. J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroformation+of+giant+liposomes+from+spin-coated+films+of+lipids%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Electroformation of giant liposomes from spin-coated films of lipids.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 42 (2), 115-123 (2005).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרס כלכלי מתחרה.

אנו מציגים פרוטוקול לסינתזה של חלבון (ממברנה) המכיל שלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטרי (proteoLUVs), והמרה של proteoLUVs לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (proteoGUVs). הפרוטוקול צריך להיות ישים להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אחרים 13,19,30,40 ולאנקפסולציה של רשתות מטבוליות אחרות מלבד מסלולי פירוק L-ארגינין וסינתזה של גליצרול 3-פוספט המוצגים כאן.
ההרכבה מחדש של חלבוני הממברנה בליפוזומים מניבה בדרך כלל כיוון אקראי של החלבונים בתוך קרום השומנים. עבור ArcD ו- Glpt, הכיוון אינו משנה, מכיוון שהחלבונים פועלים באופן דו-כיווני והמומסים נעים בהתאם לסימן הפוטנציאל האלקטרוכימי הכולל. עבור חלבונים הפועלים בכיוון אחד, מחצית מהמולקולות לא יהיו זמינות לפעילות כאשר הכיוון שלהן הוא 50/50.
האקסטרוזיה של שלפוחיות דרך מסנן פוליקרבונט מצמצמת את התפלגות הגודל, והשלפוחיות הופכות הומוגניות יותר ככל שגודל הנקבוביות של המסננים קטן יותר. עם זאת, שלפוחיות קטנות יותר מגיעות במחיר של נפח קטן יותר ולכן, מספר קטן מאוד של חלבונים (אנזימים, חלבוני ממברנה) לכל שלפוחית. כדי למזער את החלק של LUVs שיש להם רכיב אחד או יותר חסר, ניתן להתאים את ריכוז החלבונים כפי שמוצג באיור 3A,B, אבל עם שלפוחיות קטנות מאוד השפעות סטוכסטיות הן בלתי נמנעות.
שיטת הנפיחות בעזרת ג'ל מסתמכת על שקיעת שלפוחיות סוניות (SUV) על משטח אגרוז מיובש. במהלך תהליך הייבוש נוצר שיפוע ריכוז של שלפוחיות וריכוז השומנים הוא הגבוה ביותר בשולי המקום. זאת בשל תופעה המכונה אפקט כתם הקפה41,42. כתוצאה מכך, רק אזור קטן בתוך המקום מכיל ריכוז של שומנים המתאימים להיווצרות GUV. כתמי שומנים עגולים לא אחידים גורמים לאזורים גדולים שאינם בשימוש שאינם זמינים לאיחוי שלפוחית; לפיכך, היעילות של היווצרות GUV הופכת נמוכה בגישה זו. כדי להגדיל את התפוקה של GUVs, יש לשאוף לשיקוע שומנים אחיד, אשר יכול להתבצע על ידי ציפוי סחרור42 או מינוף אפקט כתם הקפה41.
הערות נוספות על הפרוטוקול:
יש להקפיד על כך שמספר חלבוני ממברנה (>10) ישוחזרו בממוצע לכל שלפוחית כדי למנוע השפעות סטוכסטיות. לכן, הימנעו מיחס שומנים לחלבון גבוה מ-400:1 w/w. מניחים כיוון אקראי עבור רוב החלבונים.
באופן אידיאלי, נפח חלבוני הממברנה הכולל הוא קטן ככל האפשר ובכל מקרה אינו עולה על 10-20% מנפח הליפוזום. הוספת נפחים גדולים יותר תכניס יותר חומרי ניקוי ורוב הליפוזומים המוכנים עשויים ליזה, מה שיכול להשפיע לרעה על יעילות הבנייה מחדש.
שיווי משקל מראש של המכבש עם הפתרון המתאים חשוב כדי למנוע דילול של הרכיבים במהלך האנקפסולציה. באופן אידיאלי, תמיסת קדם-שיווי משקל צריכה להכיל גם את האנזימים המסיסים, אך הכללת אנזימים עלולה להיות יקרה מדי בשל הנפח הגדול יחסית הדרוש לשיווי משקל מראש של המכבש. לכן, אנו בדרך כלל משמיטים רכיבים אלה ומקבלים דילול של 5% של האנזימים.
יש להוסיף יונופורים לתערובות המכילות פרוטאוליפוזומים מכיוון שהמולקולות הידרופוביות מאוד ועלולות להיספג למשטחים אם אין שלפוחיות. יש להקפיד שנפח הממס שנוסף יהיה נמוך (<1% מנפח התגובה הכולל). הבקרות נעשות כדי לוודא שהממסים אינם משפיעים על הרשתות המטבוליות בשלפוחיות. ריכוזי יונופור של כ -1 מיקרומטר בטוחים בדרך כלל לריכוז שומנים כולל של ~ 3 מ"ג / מ"ל.
יש להקפיד לייבש את הטיפות ביסודיות. אם הטיפות אינן יבשות מספיק, היווצרות GUV פחות יעילה מכיוון ששומנים ייצרו אגרגטים של שומנים ו- MLV עשויים להיווצר כאשר מוסיפים את תמיסת הנפיחות.
גלוקוז משמש כדי להתאים את האוסמולריות של המדיום החיצוני למדיום הפנימי; האחרון מכיל סוכרוז במקום גלוקוז כדי להגדיל את צפיפות השלפוחיות ובכך להקל על שיקוע של GUVs. יתר על כן, גלוקוז בסביבה החיצונית משפר את ניגודיות הפאזה, מה שהופך את השלפוחית גלויה יותר.
אפקטים סטוכסטיים הם הרבה פחות בעיה עם GUVs; אבל כאן, יחס פני השטח לנפח יכול להיות נמוך באופן בלתי מתקבל על הדעת כך שמספר חלבוני הממברנה (למשל, טרנספורטרים) הופך למגביל עבור הרשת המטבולית הפנימית. השיטה המתוארת בפרוטוקול זה אינה מאפשרת שליטה מדויקת על גודל הפרוטאו-GUVs אך רובם נופלים בטווח הגדלים של 5-50 מיקרומטר.
לסיכום, העבודה המוצגת כאן מספקת סקירה מקיפה של בנייה מחדש של חלבון ממברנה ואנקפסולציה של אנזימים בשלפוחיות שומנים בגדלים שונים. אנו מדגימים בניית שלפוחיות פונקציונליות לסינתזה של ATP ואבני בניין מקודמנים פשוטים כגון חומצות אמינו וגליצרול. בנייה מחדש של חלבוני ממברנה ב-GUV נותרה מאתגרת, אך הפרוטוקולים המוצגים כאן סוללים את הדרך להתפתחויות נוספות במחקר הביולוגיה הסינתטית מלמטה למעלה.

תחום הביולוגיה הסינתטית מלמטה למעלה מתמקד בבניית תאים (מינימליים) 1,2 וביוריאקטורים מטבוליים למטרות ביוטכנולוגיות 3,4 או ביו-רפואיות 5,6,7,8. בניית תאים סינתטיים מספקת פלטפורמה ייחודית המאפשרת לחוקרים לחקור חלבונים (ממברנה) בתנאים מוגדרים היטב המחקים את אלה של סביבות טבעיות, ומאפשרת גילוי תכונות מתפתחות ופונקציות ביוכימיות נסתרות של חלבונים ורשתות תגובה9. כצעד ביניים לקראת תא סינתטי המתפקד באופן אוטונומי, מפותחים מודולים הלוכדים תכונות חיוניות של תאים חיים כגון שימור אנרגיה מטבולית, סינתזת חלבונים ושומנים, והומאוסטזיס. מודולים כאלה לא רק לשפר את ההבנה שלנו של החיים, אלא גם יש יישומים פוטנציאליים בתחומי רפואה8 וביוטכנולוגיה10.
חלבונים טרנסממברנליים נמצאים בלב כמעט כל רשת מטבולית מכיוון שהם מעבירים מולקולות לתוך התא או החוצה ממנו, מאותתים ומגיבים לאיכות הסביבה, וממלאים תפקידים ביוסינתטיים רבים. לפיכך, הנדסה של מודולים מטבוליים בתאים סינתטיים דורשת ברוב המקרים הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה אינטגרליים ו / או היקפיים לתוך דו-שכבה קרום המורכבת מליפידים ספציפיים ושלמות גבוהה (חדירות נמוכה). הטיפול בחלבוני ממברנה אלה מאתגר ודורש ידע ספציפי ומיומנויות ניסוייות.
מספר שיטות פותחו כדי לשחזר חלבוני ממברנה בתוך שלפוחיות פוספוליפידים, לרוב במטרה לחקור את הפונקציה11,12, תקנה13, תכונות קינטיות14,15, תלות שומנים15,16, ו / או יציבות17 של חלבון מסוים. שיטות אלה כוללות דילול מהיר של חלבון המסיס בדטרגנטים למצע מימי בנוכחות ליפידים18, סילוק דטרגנטים על ידי דגירה של חלבון מסיס בדטרגנטים עם בועיות שומנים מעורערות דטרגנטים וספיגת הדטרגנטים על חרוזי פוליסטירן19, או הסרת דטרגנטים על ידי דיאליזה או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל20. ממיסים אורגניים שימשו ליצירת בועיות שומנים, למשל, באמצעות היווצרות שלבי שמן-מים21, אך רוב חלבוני הממברנה האינטגרלית מושבתים כאשר הם נחשפים לממיסים כאלה.
במעבדה שלנו, אנו בעיקר משחזרים חלבוני ממברנה בשיטת ספיגת חומרי ניקוי ליצירת שלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs)19. שיטה זו מאפשרת הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה מרובים ואת האנקפסולציה בלומן השלפוחית של אנזימים, מטבוליטים ובדיקות22,23. ניתן להמיר את ה-LUV המכילים חלבון ממברנה לשלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות (GUVs) עם/בלי אנקפסולציה של רכיבים מסיסים במים, באמצעות אלקטרופורמציה24 או נפיחות25 בסיוע ג'ל ותנאים ספציפיים לשמירה על שלמות חלבוני הממברנה26.
מאמר זה מציג פרוטוקול להרכבה מחדש ב-LUV של רשת מטבולית מחוץ לשיווי משקל המחדשת ATP באמצעות פירוק L-ארגינין ל-L-אורניתין27. היווצרות ATP קשורה לייצור גליצרול-3-פוספט (G3P), אבן בניין חשובה לסינתזה של פוספוליפידים22,28. המסלול המטבולי מורכב משני חלבוני ממברנה אינטגרליים, ארגינין/אורניתין (ArcD) ואנטיפורטר G3P/Pi (GlpT). נוסף על כך, שלושה אנזימים מסיסים (ArcA, ArcB, ArcC) נדרשים למחזור ATP, ו-GlpK משמש להמרת גליצרול לגליצרול 3-פוספט, באמצעות ATP מפירוק L-ארגינין, ראו איור 1 לסקירה סכמטית של המסלול. פרוטוקול זה מייצג נקודת התחלה טובה לבנייה עתידית של רשתות תגובה מורכבות עוד יותר - לסינתזה של שומנים או חלבונים או לחלוקת תאים. הרכב השומנים של השלפוחיות תומך בפעילות של מגוון רחב של חלבוני ממברנה אינטגרליים והותאם להובלת מולקולות מגוונות לתוך או מחוץ לשלפוחיות 27,29,30.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig01v2.jpg"> איור 1: סקירה כללית של המסלול לייצור ATP ולסינתזה והפרשה של גליצרול 3-פוספט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בקיצור, חלבוני ממברנה מטוהרים (מסיסים בדודציל-β-D-מלטוזיד, DDM) מתווספים לבועיות שומנים מוכנות מראש שהתערערו עם טריטון X-100, המאפשר החדרת החלבונים לממברנה. מולקולות הדטרגנט מוסרות לאחר מכן (לאט) על ידי תוספת של חרוזי פוליסטירן פעילים, וכתוצאה מכך נוצרות פרוטאוליפוזומים אטומים היטב. לאחר מכן ניתן להוסיף רכיבים מסיסים לשלפוחיות ולעטוף אותם באמצעות מחזורי הקפאה-הפשרה, אשר לוכדים את המולקולות בתהליך של איחוי ממברנה. השלפוחיות המתקבלות הטרוגניות מאוד ורבות מהן מולטילמלריות. לאחר מכן הם מושחלים דרך מסנן פוליקרבונט עם גודל נקבוביות של 400, 200 או 100 ננומטר, אשר מניב שלפוחיות בגודל אחיד יותר; ככל שהנקבוביות קטנות יותר, כך השלפוחיות הומוגניות וחד-לאומיות יותר, אך במחיר של נפח פנימי קטן יותר. חלבונים שאינם מאוגדים ומולקולות קטנות מוסרים מהתמיסה החיצונית על ידי כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ניתן להמיר את ה-proteoLUVs לבועיות בגודל מיקרומטר על ידי נפיחות בעזרת ג'ל, ו-proteoGUV אלה נאספים ונלכדים בשבב מיקרופלואידי לצורך אפיון מיקרוסקופי ומניפולציה. איור 2 מציג סקירה סכמטית של הפרוטוקול המלא.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig02v2.jpg"> איור 2: סקירה כללית של פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר (LUV) ומיקרומטר (GUV). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
פרוטוקולי ההרכבה מחדש והאנקפסולציה עובדים היטב והפונקציונליות של החלבונים נשמרת, אך הפרוטיאו-לובים והפרוטאוגו-גובים הם הטרוגניים בגודלם. גישות מיקרופלואידיות31,32 מאפשרות היווצרות שלפוחיות בגודל מיקרומטרי שהן הומוגניות יותר בגודלן, אך הרכבה מחדש פונקציונלית של חלבוני ממברנה אינה אפשרית בדרך כלל מכיוון שממס שיורי בדו-שכבה משבית את החלבונים. גודלם של הפרוטאולובים נע בין 100 ל-400 ננומטר, ובריכוזים נמוכים של אנזימים, האנקפסולציה עלולה להוביל לבועיות עם מסלולים מטבוליים לא שלמים (השפעות סטוכסטיות; ראו איור 3). LUVs אידיאליים לבניית מודולים מטבוליים ספציפיים, כפי שמוצג כאן לייצור ATP ואבני בניין כמו G3P. proteoLUVs כאלה יכולים להיות עטופים באופן פוטנציאלי ב- GUV ולשמש כתאים דמויי אברונים עבור שלפוחיות המאכסן.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig03v2.jpg"> איור 3: מספר המולקולות לשלפוחית בקוטר של 100, 200 או 400 ננומטר. (A) כאשר החלבונים העטוף (אנזימים, גשושיות) נמצאים בטווח של 1-10 מיקרומטר. (B) הבנייה מחדש נעשית ב-1 עד 1,000, 1 עד 10,000, ו-1 עד 100,000 חלבוני ממברנה לכל ליפיד (mol/mol). אנו יוצאים מנקודת הנחה שהמולקולות עטופות בריכוזים שצוינו ומשולבות בממברנה ביחסי חלבון-שומנים אלה. עבור אנזימים מסוימים, ראינו כי הם נקשרים לממברנות, אשר יכול להגדיל את הריכוז לכאורה שלהם שלפוחיות. קיצור: LPR = יחס שומנים-חלבונים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>Agarose</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9414-25g</td><td></td></tr><tr><td>Amicon מסנן חיתוך</td><td>Sigma Aldrich</td><td>Milipore יחידות סינון צנטריפוגלי Amicon Ultra&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>BioBeads</td><td>BioRad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>CHCl3</td><td>Macron כימיקלים עדינים</td><td>MFCD00000826</td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז</td><td>למדיום-D</td><td></td><td></td></tr><tr><td>(+)-סוכרוז</td><td>למדיום-DDM</td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>גליקון</td><td>D97002 -C</td><td></td></tr><tr><td>דיאתיל אתר</td><td>Biosolve</td><td>52805</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>276855-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti</td><td>850375P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPE</td><td>Avanti</td><td>850725P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti</td><td>840475P-1g</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Formedium&nbsp;</td><td>DTT005</td><td></td></tr><tr><td>EtOH</td><td>J.T.Baker Avantor</td><td>MFCD00003568</td><td></td></tr><tr><td>Extruder</td><td>Avestin Inc</td><td>LF-1</td><td></td></tr><tr><td>פלואורמטר</td><td>Jasco</td><td>ספקטרופלואורומטר FP-8300</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>BOOM</td><td>51171608</td><td></td></tr><tr><td>עמוד זרימת כוח הכבידה</td><td>Bio-Rad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון 100 ומיקרו; L</td><td>המילטון</td><td>7656-01</td><td></td></tr><tr><td>מזרק המילטון 1000 ומיקרו; L</td><td>Hamilton</td><td>81320</td><td></td></tr><tr><td>מתקן LCP כף יד</td><td>ארט רובינס מכשירים</td><td>620-411-00</td><td></td></tr><tr><td>כף יד סוניקטור</td><td>Hielscher טכנולוגיית אולטרסאונד</td><td>UP50H</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>BOOM</td><td>x76021889.1000</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Roth</td><td>X998.4-250g</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Supelco</td><td>1.05099.1000</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>BOOM</td><td>76028270.1</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Supelco</td><td>1.04873.1000</td><td></td></tr><tr><td>Kimwipe</td><td>Kimtech Science</td><td>7552</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה צינור בז גדול</td> צנטריפוגה <td>אפנדורף</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>L-ארגינין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A5006-100G</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אור</td><td>Leica</td><td>DM LS2</td><td></td></tr><tr><td>L-Ornithine</td><td>Roth</td><td>T204.1</td><td></td></tr><tr><td>LSM סריקת לייזר מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>Zeiss</td><td>LSM 710 ConfoCor 3</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M2670-1KG</td><td></td></tr><tr><td>שבב מיקרופלואידי</td><td>תוצרת בית&nbsp;</td>DOI <td>מבוסס PDMS</td><td>: https://doi.org/10.1039/C8LC01275J</td></tr><tr><td>Na-ADP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2754-1G</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Supelco</td><td>1.06404.1000</td><td></td></tr><tr><td>ספקטרומטר Nanodrop</td><td>Isogen Life Science</td><td>ND-1000 ספקטרופוטומטר NanoDrop</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Supelco</td><td>1.06498.1000</td><td></td></tr><tr><td>מחטים ל-GUVs</td><td>Henke-Ject</td><td>14-14575</td><td>27 גרם x 3/4 אינץ' 0.4 x 20 מ"מ</td></tr><tr><td>מחטים למיקרופלואידיקה</td><td>Henke-Ject</td><td>14-15538</td><td>18 G x 1 1/2 '' 1.2 x 40 מ"מ</td></tr><tr><td>Ni2+ Sepharose</td><td>Cytiva</td><td>17526802</td><td></td></tr><tr><td>ניגריצין</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7143-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Nutator</td><td>VWR</td><td>83007-210</td><td></td></tr><tr><td>מד</td> <td>אוסמולליותGonotec Salmenkipp</td><td>Osmomat 3000 נקודת הקפאה בסיסית אוסמומטר</td><td></td></tr><tr><td>פלזמה</td><td>מנקה פלזמה תחריט</td><td>PE-Avenger</td><td></td></tr><tr><td>מסנן פוליקרבונט</td><td>Cytiva Whatman</td><td>Nuclepor Track-Etch ממברנה מוצר: 10417104</td><td>0.4 & מיקרו; </td></tr><tr><td>m צינור אולטרה-צנטריפוגה פוליקרבונט</td><td>בקמן קולטר</td><td>355647</td><td></td></tr><tr><td>פירנין</td><td>אקרוס אורגניקס</td><td>H1529-1G</td><td></td></tr><tr><td>קובטה קוורץ (שחור)</td><td>Hellma Analytics</td><td>108B-10-40</td><td></td></tr><tr><td>Sephadex G-75 שרף&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>17-0050-01</td><td></td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Sonics Sonics & חומרים INC</td><td>סוניקס תא</td><td></td>ויברה</tr><tr><td>מסנן מזרק</td><td>Sarstedt</td><td>Filtropur S פלוס 0.2</td><td>0.2 & מיקרו; m</td></tr><tr><td>משאבת מזרק</td><td>מכשיר הרווארד</td><td>A-42467</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה שולחנית</td> צנטריפוגה <td>אפנדורף</td><td>5418</td><td></td></tr><tr><td>מרווח טפלון</td><td>תוצרת בית&nbsp;</td><td>מבוסס טפלון</td><td>45 x 26 x 1.5 או 45 x 26 x 3 או 20 x 20 x 3 מ"מ</td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A1086.1000</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8787-100 מ"ל</td> אולטרה צנטריפוגה <td></td></tr><tr><td></td><td>בקמן קולטר</td><td>אופטימה Max-E</td><td></td></tr><tr><td>מנורת UV</td><td>ספקטרולין</td><td>ENB-280C/FE</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS ספקטרומטר</td><td>Jasco</td><td>V730 ספקטרופוטומטר</td><td></td></tr><tr><td>Valinomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V0627-10MG</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי שדה רחב</td><td>Zeiss</td><td>AxioObserver</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-קזאין</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>C5890-500g</td><td></td></tr></tbody></table>

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

Construction of Out&#45;of&#45;Equilibrium Metabolic Networks in Nano&#45; and Micrometer&#45;Sized Vesicles

אנו מציגים שיטה לשלב בשלפוחיות רשתות חלבונים מורכבות, המערבות חלבוני ממברנה אינטגרליים, אנזימים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות, תוך שימוש ברכיבים מטוהרים. שיטה זו רלוונטית לתכנון ובנייה של ביוריאקטורים ולחקר רשתות תגובה מטבולית מורכבות מחוץ לשיווי משקל. אנו מתחילים בבנייה מחדש של חלבוני ממברנה (מרובים) לשלפוחיות חד-למלריות גדולות (LUVs) על פי פרוטוקול שפותח בעבר. לאחר מכן אנו עוטפים תערובת של אנזימים מטוהרים, מטבוליטים וחיישנים מבוססי פלואורסצנטיות (חלבונים פלואורסצנטיים או צבעים) באמצעות הקפאה-הפשרה-אקסטרוזיה ומסירים רכיבים שאינם משולבים באמצעות צנטריפוגה ו/או כרומטוגרפיה של אי הכללת גודל. ביצועי הרשתות המטבוליות נמדדים בזמן אמת על ידי ניטור יחס ATP/ADP, ריכוז מטבוליטים, pH פנימי או פרמטרים אחרים על ידי קריאת פלואורסצנטיות. ניתן להמיר את השלפוחיות המכילות חלבון ממברנה בקוטר 100-400 ננומטר לשלפוחיות ענקיות (GUV), באמצעות הליכים קיימים אך מותאמים. הגישה מאפשרת הכללת רכיבים מסיסים (אנזימים, מטבוליטים, חיישנים) בשלפוחיות בגודל מיקרומטרי, ובכך להגדיל את נפח הביוריאקטורים בסדרי גודל. הרשת המטבולית המכילה GUV לכודים בהתקנים מיקרופלואידים לניתוח במיקרוסקופ אופטי.

הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה מסיסים בליפוזומים דורשת ערעור היציבות של שלפוחיות מוכנות. תוספת של כמויות נמוכות של Triton X-100 גורמת בתחילה לעלייה בספיגה של 540 ננומטר (A540) עקב עלייה בפיזור האור על-ידי נפיחות השלפוחיות (איור 4). הערך המרבי A540 הוא הנקודה שבה הליפוזומים רוויים בחומר ניקוי (Rsat), ולאחר מכן כל תוספת נוספת של טריטון X-100 תגרום למסיסות חלקית של השלפוחיות. ב-Rsol, הליפוזומים מסיסים לחלוטין (איור 4). לצורך הרכבה מחדש של חלבוני ממברנה, אנו משתמשים בדרך כלל בשלפוחיות שהתערערו ל-60% מעבר ל-Rsat (מסומן בחץ).
חלבון הממברנה המשוחזר ArcD משמש להובלת L-ארגינין לתוך ו-L-אורניתין אל מחוץ לשלפוחיות ומשמש יחד עם האנזימים הכמוסים ArcA, ArcB ו-ArcC כדי למחזר ATP מ-ADP ופוספט אנאורגני. GlpT הוא אנטיפורטר גליצרול 3-פוספט/פוספט שיחד עם GlpK נחוץ לסינתזה (והפרשה) של גליצרול 3-פוספט מגליצרול בתוספת ATP המיוצר על ידי פירוק L-ארגינין. התוספת של 5 mM L-arginine ב-t = 0 לפרוטאוליפוזומים גורמת לעלייה תלולה ביחס של פלואורסצנטיות PercevalHR ב-500 ו-430 ננומטר עירור39, אשר משקף את יחס ATP/ADP בתוך השלפוחיות (איור 5). עם הוספת גליצרול, ה-ATP משמש לסינתזה של גליצרול 3-פוספט, מה שמביא להורדת יחס ATP/ADP28. פירוק L-ארגינין מוביל גם לשינויים ב-pH, אותם ניתן לכמת באמצעות פירנין או pHluorin27.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig05v2.jpg"> איור 5: מיחזור ATP על-ידי מסלול פירוק L-ארגינין. LUVs ב 2.7 מ"ג של שומנים / מ"ל ממוקמים בקובט ואת היחס של פלואורסצנטיות ב 500 ננומטר ו 430 ננומטר נרשם. 5 mM של L-arginine מתווסף ב t = 0. יחס F500/F430 הוא מדד ליחס ATP/ADP בתוך השלפוחיות. קיצור: LUVs = שלפוחיות חד-לאומיות גדולות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ניתן להשתמש ב-LUV המייצרים ATP גם ליצירת GUVs. התייבשות של פרוטאו-LUV מיובשים על ג'ל אגרוז LGT גורמת להיווצרות שלפוחיות בגודל מיקרומטר (איור 6). היווצרות פרוטאו-GUV בתוך כתמי LUV מיובשים תלויה במידה רבה בריכוז המקומי של שומנים ובמידת ההתייבשות. באזורים מסוימים יש טלאים גדולים של GUVs, בעוד שבמקומות אחרים באותה טיפה, לא ניתן ליצור GUV או מעטים. היווצרות GUV באמצעות נפיחות בסיוע LGT גורמת למגוון גדלים של GUV, בדרך כלל ממיקרומטרים בודדים ועד יותר מ-50 מיקרומטר.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig06v2.jpg"> איור 6: תמונות DIC של proteoGUV שנוצרו על-ידי נפיחות בעזרת ג'ל. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצורים: DIC = ניגודיות הפרעה דיפרנציאלית; GUVs = שלפוחיות ענק-unilammellar. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ה-GUV נקצרים ונלכדים במכשיר מיקרופלואיד פסיבי מבוסס PDMS מבוסס β-קזאין (איור 7). המכשיר מתוכנן כך שניתן ללכוד ולנתח שלפוחיות רבות בניסוי אחד, והמכשיר משמש לשליטה בסביבה החיצונית (קצב זרימה, הרכב חיץ וכו ') 34. גם כאשר התפוקה של פרוטאו-GUV נמוכה, הזרימה המתמדת של GUV דרך השבב המיקרופלואידי מאפשרת איסוף שלפוחיות רבות. ברגע שנלכדים מספיק GUV, המערכת נשטפת במאגר מאוזן אוסמוטית כדי להסיר רכיבים חיצוניים כגון חלבונים מסיסים, מולקולות קטנות וגשושיות פלואורסצנטיות. לאחר מכן מוחלף מאגר הכביסה בתמיסת מצע בעלת אוסמולליות שווה המכילה 50 mM KPi (pH 7.0), כמויות משתנות של גלוקוז (כדי להתאים את האוסמוליות), ומצעים כגון 10 mM L-arginine. ניסוי בסדרת זמן נעשה על מספר מלכודות של השבב המיקרופלואידי ותמונות נלקחות כל 90 שניות (עירור של 405 ננומטר ו- 488 ננומטר כאשר משתמשים ב- PercevalHR). יתר על כן, תמונת שדה בהיר נלקחת בכל נקודת זמן. היחס בין עוצמות הפליטה לאחר עירור ב-488 ו-405 ננומטר הוא מדד ליחס ADP/ATP בשלפוחיות.
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66627/66627fig07.jpg"> איור 7: לכידת שלפוחיות באמצעות השבב המיקרופלואידי. (A) לכידה של השלפוחיות, המלווה ביכולת לשלוט בסביבה החיצונית ובקצב הזרימה. (B) ProteoGUV לכודים במכשיר מיקרופלואידי ומעוררים באמצעות לייזר 405 ננומטר (ירוק) ולייזר 488 (אדום). הפליטה לשני הערוצים נמדדת ב-&gt;500 ננומטר. תמונת השדה הבהיר מאפשרת הדמיה של השלפוחיות ללא פלואורסצנטיות. סרגל קנה מידה = 25 מיקרומטר. קיצור: GUVs = שלפוחיות ענקיות-חד-לאומיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66627/66627fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אנו מציגים פרוטוקול להרכבה מחדש של חלבוני ממברנה ועטיפת אנזימים ורכיבים מסיסים אחרים במים בשלפוחיות שומנים בגודל תת-מיקרומטר ומיקרומטר.

We present a method to incorporate into vesicles complex protein networks, involving integral membrane proteins, enzymes, and fluorescence-based sensors, ...

בהולנד, קונסורציום BaSyC שואף לבנות תאים סינתטיים מרכיבים מולקולריים. קונסורציום BaSyC מורכב מקבוצות מחקר החל מביולוגיה מולקולרית ועד כימיה, פיזיקה ומדעים חישוביים. מטרת קונסורציום זה היא ליצור מערכת המשכפלת את עצמה המסוגלת לצמיחה אוטונומית, להעברת מידע ולחלוקה.וכיום אנו מתמקדים בבניית רשתות מולקולריות המשולבות לקראת מערכות מולקולריות מורכבות יותר. התפתחויות אחרונות בביולוגיה סינתטית כוללות הנדסה של מודולים לתפקודים תאיים, שילובם ברשתות מורכבות ליישומים באבחון, טיפול, אימונולוגיה סינתטית וחומרים אדפטיביים. התקדמות זו מקיפה קבוצות באירופה, אמריקה ואסיה, ומקדמת גישות מלמעלה למטה ומלמטה למעלה לבניית תאים סינתטיים.הטכנולוגיות הנוכחיות בתחום שלנו כוללות שיטות הנדסיות ואבולוציוניות לבנייה ואופטימיזציה של רשתות מטבוליות. אנו משתמשים בבינה מלאכותית לברירה מולקולרית ובטכניקות ביוכימיות וביופיזיקליות מתקדמות לבידוד רכיבים ויצירת רשתות. אנו משתמשים גם בבנייה מחדש של הממברנה, אנקפסולציה פיזית והדמיה באמצעות ספקטרוסקופיה פלואורסצנטית ומיקרוסקופ.עם שילוב המודולים, מספר חלבוני הממברנה והאנזימים גדל מאוד, מה שמציב אילוצים על טכנולוגיות הבנייה מחדש והאנקפסולציה שלנו. אנקפסולציה סטוכסטית הופכת לבעיה עם בועיות בגודל תת-מיקרוני, והיעילות של יצירת בועיות בגודל מיקרומטר פוחתת כאשר חלבונים מרובים של קרום נוצרים מחדש בקרום השומנים. בחרונינגן, פיתחנו רשתות מטבוליות לייצור ATP ושמירה על מצב מחוץ לשיווי משקל באמצעות הזנת מצע וייצוא מוצרים.בנוסף, קישרנו בין מיחזור ATP לסינתזה והפרשה של מבשרי שומנים, מה שמאפשר לשלפוחיות משניות לייצר שומנים, וזו התקדמות משמעותית בתחום שלנו.

construction-out-equilibrium-metabolic-networks-nano-micrometer-sized

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.

Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

הפרוטוקול המוצג מתאר את הניתוח של הובלה מתווכת חלבון ממברנה ברמת הטרנספורטר היחיד באמצעות שכבות דו-שכבתיות נטולות שומנים נטולות ממס המשתרעות על פני נקבוביות. זה מושג על ידי יצירת שבבי מערך ננו-נקבוביות המיוצרים בתפזורת, בשילוב עם איסוף וניתוח נתונים מקבילים ביותר, המאפשרים הקמה עתידית של הקרנות אפקטור חלבון ממברנה.

תחבורת ממברנה תהליכים נותחה על ידי מערכת שבב nanopore מקבילה מאוד ברזולוצית חלבון יחידה

חלבונים רבים מבצעים את תפקידם כאשר הם מחוברים למשטחי הממברנה. ניתן לדמות בעקיפין את הקישור של חלבונים חיצוניים על ממברנות ננו-דיסק על ידי מיקרוסקופ אלקטרונים הולכה. אנו מראים כי הערימה האופיינית (רולו) של ננו-דיסקים הנגרמת על ידי הכתם השלילי נתרן פוספוטונגסטט נמנעת על ידי קשירה של חלבון חיצוני.

השיטה לחזות ולנתח חלבוני אינטראקצית ממברנה ידי הילוכים מיקרוסקופים אלקטרונים

חלבונים רבים בתא לחוש, זירוז עקמומיות ממברנה. אנו מתארים שיטה למשוך ממברנה צינוריות מן השומנים שלפוחית את האינטראקציה של חלבונים או כל מולקולה עקמומיות-פעיל עם ממברנות מעוקל חוץ גופית בתוך.

משיכת ממברנה צינוריות מן שלפוחית Unilamellar ענק

נתמכת solid, נטול חלבון, כפול פוספוליפיד bilayer ממברנות (DLBM) יכולה להיהפך מורכב ודינמי, השומנים nanotube רשתות, יכול לשמש מלמטה למעלה 2D, דגמי רשתית תוך-פלזמית.

היווצרות ספונטנית ו שחלוף של השומנים מלאכותי Nanotube רשתות כמודל מלמטה למעלה על רשתית תוך-פלזמית

פרוטוקול זה מתאר תהליך לייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים באמצעות תנועתיות קינזין גולשת בשילוב עם שלפוחיות ליפידים חד-שכבתיות ענקיות.

ייצור רשתות ננו-צינוריות ליפידים מרובות רכיבים באמצעות בדיקת תנועתיות Kinesin Gliding

בממשק של ממיסים אורגניים ומימית, מותאם המותאם לאלסטין וחלבונים בעלי מבנה מולקולרי מורכבים כגון שלפוחיות, סיבים ומדבקות מופעלות על ידי פרמטרים סביבתיים. פרוטוקולי ההרכבה המתוארים מניבים תאים מבוססי חלבון ממברנה (PMBCs) עם מאפיינים שניתן לסמוך עליהם, המאפשרים כימוס של מטענים שונים.

בימוי האסיפה של אלסטין כמו חלבונים לתוך הגדרת מבנים Supraולקולריים מוגדרים מחוץ לגופית

בכתב יד זה, אנו מדגימים את הטכניקות הניסיוניות לתמצת את השלד הציטוסקולרי F-actin לשלפוחיות ליפידים חד-עיניות ענקיות (הנקראות גם ליפוזומים), ואת השיטה ליצירת שכבת F-actin הביולוגית של קליפת המוח בעלון הפנימי של קרום הליפוזום.

במבחנה שחזור של שלד אקטין ציטוסקלטון בתוך שלפוחית אונילמלרית ענקית

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הרכבת ליפוזומים בסיוע אוקטאנול (OLA), טכניקה מיקרופלואידית ליצירת ליפוזומים תואמים ביולוגית. OLA מייצרת ליפוזומים חד-מפוזרים בגודל מיקרון עם אנקפסולציה יעילה, המאפשרת ניסויים מיידיים על שבב. פרוטוקול זה צפוי להתאים במיוחד לביולוגיה סינתטית ולמחקר תאים סינתטיים.

הרכבת ליפוזום בסיוע אוקטאנול על שבב לביו-הנדסה

מאמר זה מציג בנייה מחדש פשוטה של סיר אחד של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק מופרדות פאזה. ניתן להכליל את השיטה וליישם אותה על אנקפסולציה או כליאה של מגוון רחב של ביומולקולות.

במבחנה בנייה מחדש של רשתות שלד ציטו בתוך שלפוחיות ענק חד-שלדיות מופרדות (GUVs)

חקור בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות ליפידיות בגודל ננו ומיקרומטר. השיטה משלבת שחזור חלבוני ממברנה וכימוס אנזימים ליצירת תאים סינתטיים.

בניית רשתות מטבוליות מחוץ לשיווי משקל בשלפוחיות בגודל ננו ומיקרומטר

גלה סרטונים נוספים