Name: כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: למד כיצד לכמת בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מהירה ואמינה של פעילות מיקרוגליאלית במודל של היפוקמפוס עכברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

אנו מודים לרגינה פיסקה על הסיוע הטכני בבידוד תאי מיקרוגליה ולד"ר קאיו אנדרטה פיגיירדו על עזרתו ברכישת תמונות מיקרוסקופיה באיור משלים S1. אנו מודים למתקן FACS של MDC על התמיכה הטכנית שלהם. כתב יד זה מציג באופן חלקי את הנתונים המייצגים שהוגשו לכתב העת מוח, התנהגות וחסינות בשנת 2024. איור 1A, איור 2A ואיור משלים S3A נוצרו באמצעות BioRender.com.

בדיקות מבוססות ציטומטריה של זרימה עבור בליעה מיקרוגליאלית של חומרים סינפטיים

<ol><li>Wolf, S. A., Boddeke, H. W., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+in+physiology+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Physiol%22%5BJournal%5D)">Microglia in physiology and Disease.</a> Annu Rev Physiol. 79, 619-643 (2017).</li>
<li>Hanisch, U. K., Kettenmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia%3A+active+sensor+and+versatile+effector+cells+in+the+normal+and+pathologic+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia: active sensor and versatile effector cells in the normal and pathologic brain.</a> Nat Neurosci. 10 (11), 1387-1394 (2007).</li>
<li>Tremblay, M. È, Lowery, R. L., Majewska, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+interactions+with+synapses+are+modulated+by+visual+experience%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Microglial interactions with synapses are modulated by visual experience.</a> PLoS Biol. 8 (11), e1000527(2010).</li>
<li>Paolicelli, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+by+microglia+is+necessary+for+normal+brain+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development.</a> Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+contribute+to+circuit+defects+in+Mecp2+null+mice+independent+of+microglia-specific+loss+of+Mecp2+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Microglia contribute to circuit defects in Mecp2 null mice independent of microglia-specific loss of Mecp2 expression.</a> eLife. 5, e15224(2016).</li>
<li>Schafer, D. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+sculpt+postnatal+neural+circuits+in+an+activity+and+complement-dependent+manner%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Microglia sculpt postnatal neural circuits in an activity and complement-dependent manner.</a> Neuron. 74 (4), 691-705 (2012).</li>
<li>Filipello, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+microglial+innate+immune+receptor+TREM2+is+required+for+synapse+elimination+and+normal+brain+connectivity%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">The microglial innate immune receptor TREM2 is required for synapse elimination and normal brain connectivity.</a> Immunity. 48 (5), 979-991 (2018).</li>
<li>Salter, M. W., Stevens, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+as+central+players+in+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge as central players in brain disease.</a> Nat Med. 23 (9), 1018-1027 (2017).</li>
<li>Hong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complement+and+microglia+mediate+early+synapse+loss+in+Alzheimer+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Complement and microglia mediate early synapse loss in Alzheimer mouse models.</a> Science. 352 (6286), New York, N.Y. 712-716 (2016).</li>
<li>Di Liberto, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurons+under+T+cell+attack+coordinate+phagocyte-mediated+synaptic+stripping%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Neurons under T cell attack coordinate phagocyte-mediated synaptic stripping.</a> Cell. 175 (2), e19 458-471 (2018).</li>
<li>Bisht, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dark+microglia%3A+A+new+phenotype+predominantly+associated+with+pathological+states%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Dark microglia: A new phenotype predominantly associated with pathological states.</a> Glia. 64 (5), 826-839 (2016).</li>
<li>Weerasinghe-Mudiyanselage, P. D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+plasticity+of+the+hippocampus+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Structural plasticity of the hippocampus in neurodegenerative diseases.</a> Int J Mol Sci. 23 (6), 3349(2022).</li>
<li>Aw, E., Zhang, Y., Carroll, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+responses+to+peripheral+type+1+interferon%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Microglial responses to peripheral type 1 interferon.</a> J Neuroinflammation. 17 (1), 340(2020).</li>
<li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+synaptic+proteins+in+microglia+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Detection of synaptic proteins in microglia by flow cytometry.</a> Front Mol Neurosci. 13, 149(2020).</li>
<li>Norris, G. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+integrity+and+complement+control+synaptic+material+clearance+by+microglia+after+CNS+injury%5BTitle%5D)+AND+%22JEM%22%5BJournal%5D)">Neuronal integrity and complement control synaptic material clearance by microglia after CNS injury.</a> JEM. 215 (7), 1789-1801 (2018).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 7944(2020).</li>
<li>Jaszczyk, A., Stankiewicz, A. M., Juszczak, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissection+of+mouse+hippocampus+with+its+dorsal%2C+intermediate+and+ventral+subdivisions+combined+with+molecular+validation%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Sci%22%5BJournal%5D)">Dissection of mouse hippocampus with its dorsal, intermediate and ventral subdivisions combined with molecular validation.</a> Brain Sci. 12 (6), 799(2022).</li>
<li>Fixable viability dyes for flow cytometry. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/life-science/cell-analysis/flow-cytometry/flow-cytometry-assays-reagents/cell-viability-assays-flow-cytometry/fixable-viability-dyes-flow-cytometry.html</a> (2024).</li>
<li>SynPER synaptic protein extraction reagent. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P BZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QAvD_BwE&ef_id=Cjw KCAiAi6uvBhADEiwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC 3VJNgrPEm1I64E2PBZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QA vD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!606658601747!e!! g!!syn per!13368767883!123500396056&cid=bid_pca _ppf_r01_co_cp1359_pjt0000_bid00000_0se_gaw_bt _pur_con&gad_source=1#/87793">https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/87793?gclid=CjwKCAiAi6uvBhADE_iwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC3VJNgrPEm1I64E2P BZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QAvD_BwE&ef_id=Cjw KCAiAi6uvBhADEiwAWiyRdigrNHuDkIAVVsaW8OaC 3VJNgrPEm1I64E2PBZA8X_A_0ipFr_suIxoCDm8QA vD_BwE:G:s&s_kwcid=AL!3652!3!606658601747!e!! g!!syn per!13368767883!123500396056&cid=bid_pca _ppf_r01_co_cp1359_pjt0000_bid00000_0se_gaw_bt _pur_con&gad_source=1#/87793</a> (2024).</li>
<li>Wu, A., Yu, B., Komiyama, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasticity+in+olfactory+bulb+circuits%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurol%22%5BJournal%5D)">Plasticity in olfactory bulb circuits.</a> Curr Opin Neurol. 64, 17-23 (2020).</li>
<li>pHrodo indicators for pH determination. Thermo Fisher Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html">https://www.thermofisher.com/de/de/home/brands/molecular-probes/key-molecular-probes-products/phrodo-indicators.html</a> (2024).</li>
<li>Rangaraju, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+phagocytic+properties+of+CD45low+microglia+and+CD45high+brain+mononuclear+phagocytes-activation+and+age-related+effects%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differential phagocytic properties of CD45low microglia and CD45high brain mononuclear phagocytes-activation and age-related effects.</a> Front Immunol. 9, 405(2018).</li>
<li>Weinhard, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+remodel+synapses+by+presynaptic+trogocytosis+and+spine+head+filopodia+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Microglia remodel synapses by presynaptic trogocytosis and spine head filopodia induction.</a> Nat Commun. 9 (1), 1228(2018).</li>
<li>Morizawa, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+pruning+through+glial+synapse+engulfment+upon+motor+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Synaptic pruning through glial synapse engulfment upon motor learning.</a> Nat Neurosci. 25 (11), 1458-1469 (2022).</li>
<li>Morini, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strategies+and+tools+for+studying+microglial-mediated+synapse+elimination+and+refinement%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Strategies and tools for studying microglial-mediated synapse elimination and refinement.</a> Front. Immunol. 12, 640937(2021).</li>
<li>Maecker, H. T., Trotter, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+controls%2C+instrument+setup%2C+and+the+determination+of+positivity%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry.+Part+A%3A+J.+Int+Soc+Anal+Cytol%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry controls, instrument setup, and the determination of positivity.</a> Cytometry. Part A: J. Int Soc Anal Cytol. 69 (9), 1037-1042 (2006).</li>
<li>Easthope, E. Strategies for intracellular flow cytometry success. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/">https://www.biocompare.com/Editorial-Articles/582159-Strategies-for-Intracellular-Flow-Cytometry-Success/</a> (2022).</li>
<li>Paduano, F. Isotype control antibodies, Key points. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used,the%20primary%20antibody%20and%20fluorophore">https://www.antibodies.com/primary-antibodies/isotype-control-antibodies#:~:text=Isotype%20controls%20should%20be%20used,the%20primary%20antibody%20and%20fluorophore</a> (2024).</li>
<li>Flow cytometry intracellular staining controls. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html">https://www.bio-rad-antibodies.com/flow-cytometry-intracellular-controls.html</a> (2024).</li>
<li>Dissing-Olesen, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FEAST%3A+A+flow+cytometry-based+toolkit+for+interrogating+microglial+engulfment+of+synaptic+and+myelin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">FEAST: A flow cytometry-based toolkit for interrogating microglial engulfment of synaptic and myelin proteins.</a> Nat Commun. 14, 6015(2023).</li>
<li>Jurga, A. M., Paleczna, M., Kuter, K. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Overview+of+general+and+discriminating+markers+of+differential+microglia+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Overview of general and discriminating markers of differential microglia phenotypes.</a> Front Cell Neurosci. 14, 198(2020).</li>
<li>van Wageningen, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+microglial+TMEM119+and+P2RY12+immunoreactivity+in+multiple+sclerosis+white+and+grey+matter+lesions+is+dependent+on+their+inflammatory+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neuropathol+Commun%22%5BJournal%5D)">Regulation of microglial TMEM119 and P2RY12 immunoreactivity in multiple sclerosis white and grey matter lesions is dependent on their inflammatory environment.</a> Acta Neuropathol Commun. 7 (1), 206(2019).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

עידון סינפטי באמצעות אינטראקציה מיקרוגליה-סינפסה הוא תחום מחקר מסקרן בתחום הנוירואימונולוגיה, המציע תובנות מבטיחות על תפקידם של מיקרוגליה בהפרעות נוירודגנרטיביות ונוירו-התפתחותיות. בשנת 2011; Paolicelli et al. סיפקו ראיות לנוכחות של חומר סינפטי בתוך מיקרוגליה, ושפכו אור על מעורבותם בתהליך הבליעה הסינפטי4. מחקר מסקרן אחר השתמש בדימות בהילוך מהיר ובמודל תרבית פרוסות מוח אורגנוטיפיות ex vivo ודיווח כי תאי מיקרוגליה עוסקים בתהליך פגוציטי המכונה טרוגוציטוזה, שבו הם בולעים מבנים פרה-סינפטיים ולא את המבנה הסינפטי כולו23. פרסום עדכני מאוד המשתמש במודל עכבר מהונדס חדש המאפשר מדידה של פאגוציטוזה ברקמה שלמה הראה גיזום על ידי ברגמן-גליה in vivo עם למידה מוטורית24. לפיכך, יש מספיק ראיות המצביעות על מעורבותם של תאי גלייה בבליעה סינפטית, כולל מיקרוגליה. עם זאת, המידה שבה פונקציה מיקרוגליאלית זו משפיעה על התהליך הדינמי והסלקטיבי של גיזום סינפטי דורשת ראיות נוספות.
אף על פי כן, כימות הבליעה המיקרוגליאלית של סינפסות משמש אינדיקטור רב ערך ומספק תובנה חלקית לגבי הדינמיקה המורכבת של אינטראקציות מיקרוגליה-סינפסה, במיוחד עידון סינפטי. סקירה מקיפה סיכמה את הפרוטוקולים הנוכחיים המשמשים לחקר בליעת מיקרוגליה של סינפסות25. ברצוננו להדגיש כי הפרוטוקולים שלנו מותאמים על בסיס פרוטוקולים קיימים שכבר נמצאים בשימוש. השיטות המוצגות במחקר זה מספקות כימות מהיר ובתפוקה גבוהה של בליעת מיקרוגליאות של סינפסות באזורי מוח מנותחים שונים. בהתאם לאזור המוח, ניתוח של לפחות 10,000 תאי מיקרוגליאה ביומיים לכל היותר אפשרי עבור שתי המתודולוגיות, מה שהופך אותם בעלי ערך לבדיקת מודלים עכבריים מרובים במקביל.
אנו מכירים בכך שהכימות של מיקרוגליה vGLUT1+ כולל הן בליעת in vivo והן בטווח קצר ex vivo עד לשלב הקיבוע. לכן, אנו מציעים כי הבדיקה שלנו מציגה דרך מהירה ואמינה לכמת חומר סינפטי בתוך מיקרוגליה כצעד ראשוני לפני אימות in vivo באמצעות גישות כגון IHC.
חסרון נוסף של ניתוח ציטומטריית זרימה הוא הזמינות המוגבלת של נוגדנים לסמנים סינפטיים, במיוחד עבור סינפסות מעכבות. זה מאתגר למצוא זמינים מסחרית, נוגדנים מצומדים ישירות המראים אות בהיר עבור סמנים אלה. בהתחשב בזמן האופטימיזציה הנרחב הנדרש לבדיקת נוגדנים שונים המכוונים לסמנים סינפטיים, חשוב לשתף את ההליכים הממוטבים היטב עם הקהילה המדעית עבור צביעה תוך תאית עם נוגדנים שונים, כפי שאנו עושים כאן במחקר זה.
בנוגע לניתוח נתונים במחקר זה, השתמשנו בפקדי איזוטיפ כבקרות שליליות טכניות כדי להסביר קשירה לא ספציפית של נוגדן vGLUT1, שכן הם מספקים אומדן לקשירה לא ספציפית של נוגדן בדגימה תוך אופטימיזציה של בדיקות מבוססות ציטומטריה של זרימה26. עם זאת, בקרות איזוטיפ עברו אופטימיזציה בעיקר לזיהוי אות הרקע הלא ספציפי מהליכי צביעת פני השטח ואינן אופטימליות לבקרות צביעה תוך תאיות27,28. לכן, אין להסתמך עליהם כדי להבחין בין האוכלוסייה השלילית לחיובית בעת ביצוע צביעה תוך תאית, הכוללת שלבי קיבוע וחלחול שיכולים להשפיע על זיהוי אנטיגן, אוטופלואורסנציה ובהירות פלואורופור29. הליכי צביעה תוך-תאיים כאלה מחייבים שימוש בבקרות פנימיות ביולוגיות מתאימות כדי להגדיר את אוכלוסיית התאים החיובית המוכתמת עבור סמן תוך-תאי29. לכן, בהתחשב בכך שאנו משתמשים בפרוטוקול צביעה תוך-תאי, השתמשנו בבקרה שלילית ביולוגית פנימית (מקרופאגים של הטחול) והגדרנו את הגבול בין האוכלוסייה החיובית לשלילית על פי מקרופאגים של הטחול שבודדו מאותם עכברים. הבחנו בין האוכלוסייה החיובית שמעל השער, שבה אין אירועים חיוביים vGLUT1, לבין המקרופאגים בטחול שמשמשים כבקרה ביולוגית שלילית (איור 1).
שתי השיטות המוצגות במחקר זה מציעות פוטנציאל גדול לניתוח ראשוני של בליעת מיקרוגליה של סינפסות באופן מהיר ובתפוקה גבוהה, תוך ניתוח מעל 10,000 תאים מאזורי מוח קטנים וזה לא בר השגה עם טכניקות מיקרוסקופיה סטנדרטיות. לכן, שיטות אלה מציעות יתרון משמעותי על פני שיטות עבודה וזמן רב יותר ועוד, לספק ניתוח מקיף יותר של בליעה סינפטית על ידי מתן אפשרות ניתוח של מספר גדול יותר של מיקרוגליה. בנוסף, שיטת המבחנה המוצגת במחקר זה שימושית במיוחד לבדיקת ההשפעה של טיפולים שונים על בליעת המיקרוגליאה של הסינפסות. הוא מאפשר כימות ישיר של השפעת הטיפול על תאי מיקרוגליה ללא הגורמים המבלבלים הקשורים לסוגי תאים אחרים. בנוסף, הוא משמש כגישה עקיפה להוכחת השפעה פוטנציאלית של מיקרו-סביבה או סוגי תאים אחרים על תהליך הבליעה הסינפטית. לכן, אנו מסיקים כי שיטות אלה, במיוחד כאשר נעשה שימוש במקביל, מציעים חלופות אינטואיטיביות ויתרון לניתוח של בליעת מיקרוגליאה של חומרים סינפטיים.
עם זאת, ניתוח של מיקרוגליה מבודדת טרייה על ידי בדיקות phagocytic מבוסס FACS ex vivo עשוי להוות כמה חסרונות. ראשית, חיוני להשתמש בפרוטוקולים ממוטבים היטב המייצרים תאי מיקרוגליה מבודדים טריים מהמוח הבוגר תוך הימנעות מהפעלת ex vivo ותגובת לחץ של מיקרוגליה. Dissing-Olesen et al. שילבו את השימוש במעכבי שעתוק ותרגום כדי להתגבר על בעיה זו על ידי שימוש בהליך דיסוציאציה של רקמות ב 37 oC30. Mattei et al., לעומת זאת, הציגו פרוטוקול דיסוציאציה של רקמות מכניות קרות כדי להימנע מגרימת ביטוי ex vivo של גנים הקשורים ללחץ16 והתאמנו פרוטוקול זה בחלק הראשון כדי למנוע הפעלה ex vivo של תגובת מיקרוגליה הקשורה ללחץ לפני צביעת vGLUT1 תוך תאית. השתמשנו בפרוטוקול דיסוציאציה אנזימטית של רקמות בחלק השני לפני בדיקת בליעת סינפטוזום במבחנה , בהתחשב בתפוקה הגבוהה יותר של מיקרוגליה לאחר דיסוציאציה של רקמות מבוססות פפאין (הנתונים לא מוצגים). מיקרוגליה נשארת באופן בלתי נמנע בטמפרטורה של 37 מעלותצלזיוס בתנאי תרבית כאשר היא מודגרת עם סינפטוזומים, ודגירה בטמפרטורה של 37 מעלותצלזיוס אכן יכולה לגרום לשינויים במיקרוגליה כחסרונות נפוצים של כל בדיקות המבחנה והליכי תרבית התא. לכן, אנו מציעים להשתמש בשני הפרוטוקולים המוצגים במקביל כדי להגיע למסקנה רחבה יותר במונחים של בליעת מיקרוגליאה של סינפסות.
יתר על כן, חשוב להגדיר בקפידה את אסטרטגיית gating לבחירת מיקרוגליה CD11b++/CD45+ על ידי התחשבות בנוכחותם של תאים חיסוניים אחרים בפרנכימה במוח המבטאים גם סמנים אלה31. חשוב מכך, כאשר בוחרים סמנים המיועדים ספציפית למיקרוגליה (למשל, TMEM119, P2RY12), חשוב לקחת בחשבון שהם יכולים לעבור שינויים ברמות הביטוי שלהם במהלך מצבים פתולוגיים ודלקתיים32 , ויש לשקול שינויים כאלה לפני הקמת פאנל FACS לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות. לבסוף, חשוב להדגיש שאף אחת מהשיטות שנדונו קודם לכן, כולל גישות ה-IHC והמיקרוסקופיה in vivo , אינה יכולה לבדה ללכוד את הגיזום הפעיל והסלקטיבי של סינפסות על ידי מיקרוגליה. שיטות אלה אינן מסוגלות להבחין בין גיזום פעיל על ידי מיקרוגליה לבין נבלות פסיבית של פסולת סינפטית בתוך פרנכימה במוח. לכן, כאשר מעריכים ודנים בנתונים, חובה להבחין בבירור בין מושגים מובחנים אלה.

מיקרוגליה הם תאי החיסון השוכנים של מערכת העצבים המרכזית (CNS)1. הם סורקים כל הזמן את המיקרו-סביבה שלהם ומספקים מעקב 1,2. יתר על כן, לעתים קרובות הם מתקשרים עם סינפסות ומתווכים כוונון עדין של הפעילות הסינפטית3. לפיכך, הם התגלו כשחקן מפתח בתהליך של עידון סינפטי.
תפקידם של תאי מיקרוגליה בעידון סינפטי באמצעות בליעת סינפסות הוכח על ידי קבוצות מחקר שונות 3,4,5,6,7. שיבושים בתהליך זה יכולים לתרום לפתולוגיה של הפרעות נוירו-התפתחותיות וניווניות כגון סכיזופרניה ואלצהיימר8. עידון סינפטי חריג על ידי מיקרוגליה כבר זוהה במודלים שונים של הפרעות נוירולוגיות 5,9,10. לכן, זיהוי מנגנונים מובחנים העומדים בבסיס בליעת הסינפסות במיקרוגליה הוא בעל חשיבות עליונה להבנת הפתופיזיולוגיה של הפרעות נוירו-התפתחותיות וניווניות8.
התמקדות בבליעה מיקרוגליאלית של סינפסות טומנת בחובה פוטנציאל גדול הן להתערבות בהתקדמות המחלה והן להשגת תובנות לגבי המנגנונים הבסיסיים של הפרעות נוירו-התפתחותיות וניווניות. כדי להקל על חקירות כאלה, יש צורך בגישות מהירות ובעלות תפוקה גבוהה. הגישות המתודולוגיות הנוכחיות כוללות בדיקות in vivo, ex vivo ו- in vitro המאפשרות זיהוי של חומר סינפטי בתוך מיקרוגליה. באופן כללי, הזיהוי של בליעת מיקרוגליה של סינפסות מסתמך במידה רבה על אימונוהיסטוכימיה (IHC) וגישות מבוססות מיקרוסקופיה 5,6,11, שהן עתירות עבודה ומראות מגבלות בניתוח מספר רב של מיקרוגליה.
בהתחשב במגבלות טכניות אלה, חקירת מתודולוגיות חלופיות היא הכרחית. כדי להתגבר על כך, ביצענו אופטימיזציה של גישה מבוססת ציטומטריית זרימה, המאפשרת ניתוח יעיל, בלתי משוחד ובתפוקה גבוהה של בליעת מיקרוגליה של סינפסות. בחרנו בהיפוקמפוס כאזור העניין העיקרי בשל הרמה הגבוהה של עיצוב מחדש סינפטי ופלסטיות12, אך ניתן להתאים את הפרוטוקול לאזורי מוח שונים. בעוד ציטומטריית זרימה כבר שימשה במחקרים קודמים כדי לזהות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות 13,14,15, אנו מספקים כאן מתודולוגיה שלב אחר שלב המשתמשת בנוגדן vGLUT1 מצומד פלואורופור הזמין כיום מסחרית. יתר על כן, אנו מספקים גישה משלימה במבחנה לסינון בתפוקה גבוהה של בליעת מיקרוגליאה של חומר סינפטי באמצעות סינפטוזומים גולמיים.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל Dounce Homogenizer</td><td>Active Motif</td><td>Cat# 40401</td><td></td></tr><tr><td>5 מ"ל צינורות</td><td>Eppendorf</td><td>Cat# 0030119452</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD11b</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Cat# 25-0112-82</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45</td><td>BD</td><td>Cat# 559864</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6C</td><td>BD</td><td>Cat# 553104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ly6G</td><td>BD</td><td>Cat# 551460</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BCA</td><td>פירס</td><td>חתול # 23227</td><td></td></tr><tr><td>צינורות C</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-096-334</td><td></td></tr><tr><td>CD11b MicroBeads</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-093-634</td><td></td></tr><tr><td>CD16 / CD32 נוגדן</td><td>תרמו פישר חתול מדעי</td><td># 14-0161-82</td><td></td></tr><tr><td>ערכת ציטופיקס / ציטופרם</td><td>BD</td><td>Cat# 554714</td><td></td></tr><tr><td>מדיום הנשר המותאם של Dulbecco (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 41966029</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&acute; s פוספט חוצץ מלח&nbsp; (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>Cat# 14190144</td><td></td></tr><tr><td>Falcon מבחנות פוליסטירן עגולות&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 08-771-23</td><td></td></tr><tr><td>צבע כדאיות ניתן לתיקון</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# L34969</td><td></td></tr><tr><td>Hibernate A בינוני</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# A1247501</td><td></td></tr><tr><td>עמודות LS</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>מערכת דיסוציאציה פפאין</td><td>Worthington</td><td>Cat# LK003150</td><td></td></tr><tr><td>Percoll</td><td>Th.Geyer</td><td>Cat# 17-0891-02</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# 11339283</td><td></td></tr><tr><td>pHrodoRed</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Cat# P36600</td><td></td></tr><tr><td>מעכב פרוטאז</td><td>Roche</td><td>Cat# 5892970001</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ליזה של תאי דם אדומים</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>Cat# 11814389001</td><td></td></tr><tr><td>Steritop E-GP מערכת סינון סטרילית</td><td>Merck</td><td># SEGPT0038</td><td></td></tr><tr><td>SynPer Solution</td><td>ThermoFisher</td><td>Cat# 87793</td><td></td></tr><tr><td>vGLUT1 נוגדן</td><td>Miltenyi Biotech</td><td>Cat# 130-120-764</td><td></td></tr></tbody></table>

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

Quantification of Microglial Engulfment of Synaptic Material Using Flow Cytometry

מיקרוגליה ממלאת תפקיד מרכזי בעידון סינפטי במוח. ניתוח של בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוני להבנת תהליך זה; עם זאת, השיטות הקיימות כיום לזיהוי בליעה מיקרוגליאלית של סינפסות, כגון אימונוהיסטוכימיה (IHC) והדמיה, הן מייגעות וגוזלות זמן. כדי להתמודד עם אתגר זה, אנו מציגים כאן בדיקות in vitro ו - in vivo* המאפשרות כימות מהיר ובתפוקה גבוהה של בליעת מיקרוגליה של סינפסות באמצעות ציטומטריית זרימה.
בגישת in vivo* , ביצענו צביעת vGLUT1 תוך-תאית בעקבות בידוד תאים טרי ממוחות עכברים בוגרים כדי לכמת בליעה של סינפסות vGLUT1+ על ידי מיקרוגליה. בבדיקת בליעת סינפטוזום במבחנה , השתמשנו בתאים שזה עתה בודדו ממוח העכבר הבוגר כדי לכמת את הבליעה של סינפטוזומים בעלי תווית אדומה של pHrodo על-ידי מיקרוגליה. פרוטוקולים אלה יחד מספקים גישה חסכונית בזמן לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות ומייצגים חלופות מבטיחות לשיטות מבוססות ניתוח תמונה עתירות עבודה. על ידי ייעול הניתוח, בדיקות אלה יכולות לתרום להבנה טובה יותר של תפקיד תאי המיקרוגליה בעידון סינפטי במודלים שונים של מחלות.

בפרויקט זה, ביצענו אופטימיזציה והצגנו שני פרוטוקולים למדידה in vivo* ובליעת סינפסות במבחנה על ידי מיקרוגליה. בפרוטוקול הראשון, התמקדנו בבליעת in vivo* של סינפסות חיוביות vGLUT1. כנקודת מוצא, השתמשנו בפרוטוקול14 שפורסם בעבר. עם זאת, נוגדני FACS המשמשים בפרוטוקול זה הופסקו והוספנו שלבי אופטימיזציה רבים וכן שיטה חדשנית לבידוד מיקרוגליה16. לכן כדאי לשתף את הקהילה המדעית בפרוטוקול המוצג כאן כעדכון מקיף לפרוטוקולים שכבר פורסמו.
כדי לכמת את בליעת המיקרוגליה של סינפסות, השתמשנו בעכברים זכרים C57BL/6N בגילאי 11-14 שבועות. ההיפוקמפוס נבחר כאזור העניין העיקרי בשל הרמה הגבוהה של שיפוץ סינפטי ופלסטיות12. ניתחנו את עוצמת הפלואורסצנטיות (MFI) של vGLUT1-PE (vGLUT1-PE) בהיפוקמפוס של עכברי C57BL/6N. מקרופאגים של טחול שמקורם באותם בעלי חיים שימשו כבקרה ביולוגית שלילית לכל ניסוי. בחנו את הנוגדן vGLUT1 על-ידי הדגמת אות פלואורסצנטי vGLUT1-PE גבוה יותר מתאי מיקרוגליה בהיפוקמפוס בהשוואה לבקרת האיזוטיפ ולמקרופאגים של הטחול (איור 1B-E)
יתר על כן, השווינו את בליעת המיקרוגליה של סינפסות במוח הקטן כמו גם בפקעת הריח (כהתייחסות נוספת לפלסטיות סינפטית גבוהה)20. מצאנו אות פלואורסצנטי vGLUT1 גבוה יותר במיקרוגליה מפקעת הריח, ואות נמוך יותר במוח הקטן בהשוואה להיפוקמפוס (איור 1F). עוצמת האות הנמוכה ביותר זוהתה במקרופאגים של הטחול, ושימשה כבקרה שלילית פנימית (איור 1E). בנוסף, השתמשנו בעכברי Vglut-IRES-Cre/ChR2-YFP כדי לבדוק את התגובה החיסונית של נוגדן vGLUT1 שלנו. YFP מבוטא על-ידי תאי עצב גלוטמטרגיים של עכברים אלה, מה שמצביע על כך שאוכלוסיית ה-YFP החיובית צריכה לכלול גם חלק חיובי vGLUT1. באמצעות פרוטוקול צביעה זה, זיהינו 98.7% מהאוכלוסייה החיובית ל-YFP כחיוביים ל-vGLUT1, מה שמאמת את יעילות הנוגדן שלנו (איור משלים S3).
בסך הכל, תוצאות אלה מאמתות את היעילות של נוגדן vGLUT1 ואת פרוטוקול הצביעה המוצג. אנו מראים כי פרוטוקול זה והנוגדן יכולים לשמש בביטחון לכימות בליעת invivo* של סינפסות בתפוקה גבוהה ומהירה בהשוואה לגישות ניסיוניות אחרות.
במעבר לשיטת המבחנה , בודדנו תאי מיקרוגליה בוגרים ודגרנו עליהם באמצעות סינפטוזומים שבודדו לאחרונה עם תווית אדומה של pHrodo שבודדו מאותן חיות כדי לכמת את הבליעה החוץ-גופית שלהם (איור 2A). תייגנו סינפטוזומים עם pHrodo אדום, אשר באופן טבעי מגביר את האות הפלואורסצנטי ב- pH21 החומצי שמסביב. בודדנו סינפטוזומים וחשפנו אותם לערכי pH שונים (pH = 4 ו- pH = 11). לאחר שאישרנו את העלייה באות הפלואורסצנטי ב-pH נמוך כניסוי הוכחת עיקרון (איור 2B), דגרנו על הסינפטוזומים האלה עם מיקרוגליה שזה עתה בודדה במשך 1.5-2 שעות. כבקרה, דגרנו על מיקרוגליה עם סינפטוזומים ללא תווית. לאחר מכן, ניתחנו את אות הפלואורסצנטיות pHrodo Red-PE ממיקרוגליה CD11b++/CD45+ וצפינו בפלואורסצנטיות PE חיובית, שהייתה דומה לזו שהתקבלה מסינפטוזומים ב-pH=4 (איור 2C). לפיכך, שיטה זו מספקת ניתוח מהיר ובתפוקה גבוהה של בליעת מבחנה של סינפטוזומים וניתן להרחיב אותה לפלאקים עמילואידיים או לבליעה של מטרות פוטנציאליות אחרות בעקבות שלבי אופטימיזציה נדרשים. ואכן, Rangaraju et al. כימתו את הבליעה של עמילואיד בטא על ידי מיקרוגליה באמצעות גישה דומה מבוססת ציטומטריה זרימה22. לסיכום, שתי שיטות אלה מספקות כימות חזק, יעיל ובתפוקה גבוהה של בליעת מיקרוגליה של סינפסות הן in vivo* והן in vitro.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig01v4.jpg"> איור 1: ניתוח של בליעת מיקרוגליאה של סינפסות vGLUT1+ in vivo*. (A) המחשה גרפית של תהליך העבודה הניסיוני המתאר שלבים של צביעת vGLUT1 תוך תאית. (B) אסטרטגיית Gating להגדרת אוכלוסיית תאים יחידה/CD11b++/CD45+/ בת קיימא מההיפוקמפוס. אוכלוסייה זו שימשה לניתוח vGLUT1-MFI וכן לכימות אחוז מיקרוגליה vGLUT1+ בהיפוקמפוס. השער המוצג עם המלבן האדום מציין את שבר התא vGLUT1+ במדגם הכולל. (C) ההיסטוגרמה מציינת עוצמת פלואורסצנטיות vGLUT1-PE. (D) השער המוצג עם המלבן האדום אינו מציין שבר תא חיובי המציג תגובתיות חיסונית של איזוטיפ-PE. ההיסטוגרמה מציינת את עוצמת הפלואורסצנטיות של איזוטיפ-PE. (E) השער המוצג עם המלבן האדום אינו מציין שבר תאים חיובי המציג תגובתיות חיסונית vGLUT1-PE במקרופאגים של הטחול. ההיסטוגרמה מציינת עוצמת פלואורסצנטיות vGLUT1-PE. השער המצוין בהיסטוגרמה מתחיל ברמה, שבה vGLUT1-MFI מהטחול מסתיים (~ 104) ומשמש לניתוח החלק החיובי vGLUT1 בדגימות המוח. (F) ההיסטוגרמה השכובה מראה השוואה של עוצמת פלואורסצנטיות PE של מקרופאגים בטחול (אפור) ותאי מיקרוגליה מההיפוקמפוס (אדום), המוח הקטן (סגול) ופקעת הריח (תכלת). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66639/66639fig02.jpg"> איור 2: אנליזה של בליעת מיקרוגליאה של סינפסות סינפטוזומים במבחנה. (A) המחשה גרפית של תהליך העבודה הניסיוני המתארת שלבים של בדיקת בליעת סינפטוזום במבחנה. (B) סינפטוזומים המודגרים בשני ערכי pH שונים מראים אות פלואורסצנטי נמוך של pHrodo Red-PE ב-pH=11 ופלואורסצנטיות גבוהה של pHrodoRed-PE ב-pH=4. (C) אוכלוסיית תאים בודדים/CD11b++/CD45+ שימשה לניתוח עוצמת הפלואורסצנטיות של pHrodo Red-PE. מיקרוגליה מודגרת עם סינפטוזומים לא מוכתמים שימשו כבקרה שלילית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: רשימת המאגרים והריאגנטים המשמשים בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_table%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
איור משלים S1: תמונה מייצגת של תאי מיקרוגליה בוגרים שזה עתה בודדו. התמונה התקבלה באמצעות מיקרוסקופ אור עם מטרה של פי 20 בעקבות פרוטוקול דיסוציאציה של רקמות מבוסס פפאין ובידוד מבוסס MACS של מיקרוגליה CD11b+. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים S2: תרשימי FACS מייצגים המדגימים את אסטרטגיית הגאטינג להגדרת מקרופאגים בטחול. הטחול שימש כבקרה שלילית בניסויים לכל ריצת ניסוי בעת בדיקת בליעת מיקרוגליאה של סינפסות בהיפוקמפוס. חלקות FACS שניתנו לעיל מגדירות את מקרופאגים הטחול כאוכלוסייה CD11b++/CD45++/בת קיימא. אוכלוסייה זו שימשה לקביעת סף לכימות מיקרוגליה vGLUT1+ בדגימות המוח השוכנות מעל שער סף זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-2.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S3: תרשימי FACS מייצגים המדגימים את אסטרטגיית gating לבדיקת יעילות נוגדן vGLUT1. (A) המחשה גרפית של זרימת העבודה הניסיונית המתארת שלבים של צביעת vGLUT1. נוירונים גלוטמטרגיים YFP+ שימשו לבדיקת התגובה החיסונית של נוגדן vGLUT1. (B) אסטרטגיית Gating להגדרת אוכלוסיית YFP+ מההיפוקמפוס של עכברי Vglut-IRES-Cre//ChR2-YFP ששימשו כבקרה חיובית לבדיקת היעילות של נוגדן vGLUT1 FACS. חלק YFP+ היה מגודר כדי לציין סינפסות גלוטמטרגיות. באוכלוסייה זו נותחה התגובה החיסונית של נוגדן vGLUT1 כדי לבדוק את התגובה החיסונית של הנוגדן. בהשוואה לבקרת האיזוטיפ (C); 97.9% ממקטע התאים החיובי ל-YFP מזוהה כ-(D) vGLUT1-חיובי. (E) ההיסטוגרמה השכובה מציינת את ההשוואה של פלואורסצנטיות PE בין האיזוטיפ לבין נוגדן vGLUT1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66639/66639_SuppFigure-3.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן אנו מציגים שני פרוטוקולים לכימות בליעת מיקרוגליאה של סינפסות חיוביות vGLUT1 וסינפטוזומים גולמיים מסומנים באדום pHRodo באמצעות ציטומטריית זרימה.

Microglia play a pivotal role in synaptic refinement in the brain. Analysis of microglial engulfment of synapses is essential for comprehending this ...

המחקר שלנו מתמקד בפסיכונוירואימונולוגיה ואנו חוקרים את השילוב של מערכת החיסון עם המוח והמוח. אני מתעניין במיוחד בפענוח תת-קבוצות של חולים בהתבסס על מצבם החיסוני כדי למצוא טיפולים מותאמים עבורם. ההתפתחויות האחרונות בתחום שלנו כוללות, למשל, פיתוח ליגנדות PET, אך כוללות גם טכנולוגיות מתקדמות כגון ריצוף RNA, ריצוף RNA של תא בודד וריצוף RNA מרחבי לפענוח טיפולים מבוססי חיסון.הפרוטוקול שלנו מתמודד עם האתגר של כימות בליעת תאי מיקרוגליאה של חומר סינפטי, שהוא חיוני להבנת התפקיד בתפקוד המוח, כמו גם בפתולוגיה של מחלות. הפרוטוקול שלנו מציע כימות מהיר ואמין של חומר סינפטי שנבלע על ידי מיקרוגליה, ולכן מספק תובנות לגבי הפעילות הפונקציונלית של מיקרוגליה. הפרוטוקול שלנו יעודד קבוצות מחקר אחרות לכלול בדיקות פונקציונליות יותר במחקר שלהן, כגון מוטוסינפטוזומים שנבלעו, וזה יוביל להבנה טובה ומקיפה יותר של תפקיד תאי המיקרוגליה באינטראקציות נוירואימוניות.

quantification-microglial-engulfment-synaptic-material-using-flow

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

סרטון זה מדגים ציטומטריית זרימה למדידת ספיגת מיקרוגליה של חלקיקים פלואורסצנטיים לאחר מסירה תוך ויטריאלית בעין עכבר. ציטומטריית זרימה מזהה תאים חיים המבטאים CD11b ומבדילה תאי מיקרוגליה פגוציטיים המציגים פלואורסצנטיות ירוקה מתאים מיאלואידים אחרים, כולל מונוציטים המבטאים Ly6C ונויטרופילים המבטאים Ly6G.

מדידת ספיגה מיקרוגליאלית של חלקיקים פלואורסצנטיים המועברים תוך ויטראלית באמצעות ציטומטריית זרימה

מיקרוגליה הם התאים חיסוניים תושב של מערכת העצבים המרכזית (CNS) עם קיבולת גבוהה לphagocytose או לבלוע את חומר בסביבה תאית שלהם. הנה, assay החלים רחב, אמין, וכמותי מאוד להדמיה ומדידת היבלעות בתיווך מיקרוגליה של רכיבים סינפטיים מתואר.

Assay היבלעות: פרוטוקול להעריך אינטראקציות בין מערכת העצבים המרכזית וPhagocytes נוירונים

phagocytosis microglial הוא קריטי לשמירה על הומאוסטזיס רקמות ותפקוד לקוי phagocytic הייתה מעורב פתולוגיה. עם זאת, להערכת תפקוד microglia in vivo מבחינה טכנית מאתגרת. פתחנו טכניקה פשוטה אך חזקה לניטור בדיוק וכימות פוטנציאל phagocytic של microglia בסביבה פיזיולוגית.

להערכת תפקוד רשתית microglial Phagocytic<em&gt; In vivo</em&gt; שימוש cytometry זרימה מבוסס Assay

פרוטוקול זה מספק ניתוח של subplopulations macrophage במערכת העצבים המרכזית עכבר מבוגר על ידי cytometry הזרימה והוא מועיל לחקר סמנים מרובים לידי ביטוי על ידי תאים אלה.

ניתוח של microglia ומונוציטים הנגזרות מקרופאגים ממערכת העצבים המרכזית על ידי cytometry זרימה

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

פרוטוקול זה משלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד כדי לבודד ולאפיין מצבי תאי מיקרוגליה במוח הקטן של מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. הוא משתמש בדיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה פרקול וצביעה חיסונית כדי לחשוף הטרוגניות של מיקרוגליה ולשפר את ההבנה של תפקידיהם בהתפתחות המוח הקטן ובמחלות.

זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

צבעים FM כבר סיוע שלא יסולא בפז בהבנת הדינמיקה הסינפטי. FMS אחריהן בדרך כלל במהלך תנאי גירוי שונים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. עם זאת, photoconversion של צבעים FM משולב עם מיקרוסקופ אלקטרונים מאפשר הדמיה של בריכות נפרדות שלפוחית ​​סינפטית, בין הרכיבים ultrastructure אחרות, boutons הסינפטי.

לימוד בריכות שלפוחיות Synaptic באמצעות photoconversion של צבעים Styryl

ציטומטריית זרימה היא כלי רב עוצמה המאפשר בידוד וחקר של אוכלוסיות תאים ספציפיות. פרוטוקול זה מתאר את השלבים לבידוד תאים המבטאים LacZ מרקמות שבלול של עכברים טרנסגניים ניאונטליים. תאי שבלול מופרדים סומנו באמצעות סובסטרטים המשורשרים לפלואורופור של β-galactosidase לפני ההפרדה באמצעות ציטומטריית זרימה.

בידוד LacZ-להביע תאים פנימית עכבר רקמות האוזן באמצעות זרימת cytometry

דו"ח זה מתאר את השימוש הדמיה תא חי וטכניקות photobleach לקבוע את הבעת פני, מסלולי תחבורה קינטיקה סחר exogenously GFP-מתוייגים הביע pH רגיש, חלבונים על הממברנה של נוירונים.

דיפוזיה Exocytosis לרוחב של חלבונים בממברנה של נוירונים בתרבית הוערכה באמצעות שחזור פלואורסצנציה Fluorescence מסופקים Photobleaching

שפע של קולטני הנוירוטרנסמיטר אשכולות על סינפסות מאוד משפיע כוח סינפטי. שיטה זו מכמת קולטני הנוירוטרנסמיטר fluorescently שכותרתו בשלושה ממדים עם רזולוציה אחת סינפסה...

כימות אוטומטי של הקרינה סינפטית<em&gt; ג elegans</em

למד כיצד לכמת בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה. פרוטוקול זה מאפשר מדידה מהירה ואמינה של פעילות מיקרוגליאלית במודל של היפוקמפוס עכברי.

כימות בליעה מיקרוגליאלית של חומר סינפטי באמצעות ציטומטריית זרימה

גלה סרטונים נוספים