כימות פעילות מערכת ההפרשה של Yersinia pseudotuberculosis Type III לאחר רעב לברזל וצמיחה אנאירובית
31 במאי 2024
חיידקים מאכלסים רקמות מארחות המשתנות בזמינות הביולוגית של חמצן וברזל, אך רוב הגישות לחקר חיידקים משתמשות במדיה מאווררת ועשירה. פרוטוקול זה מתאר תרבית של הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis תחת ריכוזי ברזל ומתח חמצן משתנים, וכימות הפעילות של מערכת ההפרשה של Yersinia Type III, שהיא גורם אלימות חשוב.
פתוגנים חיידקיים משתמשים בגורמי אלימות כדי ליישב נישות שונות בתוך האורגניזם המארח. אנו עובדים כדי להבין כיצד פתוגנים חיידקיים חשים רמזים סביבתיים ספציפיים ברקמות המארח כדי לווסת את ביטוי גורמי האלימות. הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis משתמש בגורם האלימות של מערכת ההפרשה מסוג 3 כדי להזריק חלבוני אפקטור לתאי המארח.
מערכת ההפרשה מסוג 3 מאפשרת לחיידקים לחתור תחת מנגנוני ההגנה של המארח וליישב רקמות מארח. עם זאת, הביטוי של מערכת ההפרשה של ירסיניה סוג III הוא מכביד מבחינה מטבולית, ולכן הביטוי של גנים של מערכת ההפרשה מסוג 3 מווסת בקפדנות בתגובה לרמזים סביבתיים כמו טמפרטורה. הפרסומים הקודמים שלנו הראו כי ביטוי מערכת ההפרשה של Yersinia Type III נשלט על ידי זמינות ברזל ומתח חמצן באמצעות גורם שעתוק הנקרא ISCR.
ממצאים אלה משמעותיים מכיוון שירסניה מתיישבת ברקמות מארח המשתנות בתכולת הברזל ובמתח החמצן שלהן. לדוגמה, לומן המעי מכיל מספיק ברזל לצמיחת ירסיניה אך יש לו מתח חמצן נמוך. לעומת זאת, לרקמות כמו הדם יש זמינות ברזל נמוכה מאוד אך מתח חמצן גבוה יותר.
השיטה שלנו מאפשרת לנו לגדל ירסיניה בתנאי תרבית המשתנים בכמות הברזל והחמצן הזמינים, כדי לחקור כיצד רמזים סביבתיים אלה משפיעים על ביטוי מערכת ההפרשה מסוג 3. שיטה זו תעזור לנו לקבוע את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו זמינות הברזל והחמצן שולטת בביטוי של מערכת ההפרשה מסוג 3, ותעזור לנו להבין כיצד היא שולטת בתוצאה של זיהום ירסיניה. כדי להתחיל, פס את Yersinia Pseudo tuberculosis על צלחות אגר מרק ליזוגני.
דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. לאחר שנוצרות מושבות גלויות, חסנו מושבה מבודדת אחת לארבעה מיליליטר של מדיה M9. תרבית אותו למשך הלילה ב-26 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד.
מניחים קובטה המכילה את התרבית בספקטרומטר, ולאחר מכן מדללים את התרבית ב-14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית ללא תוספת ברזל כדי להשיג ערך OD600 של 0.1. מניחים את הצלוחיות בשייקר של 26 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך שמונה שעות. לאחר השלמת הדגירה, השתמש בתרבות כדי להתחיל שלוש תרבויות טריות; שניים לצמיחה אנאירובית ואחד לצמיחה אירובית.
לתרבית אירובית, יש לדלל את התרבית לערך OD600 של 0.1 ב-14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית ללא תוספת ברזל. לאחר מכן, תרבית עם אוורור ב -26 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לתרבות אנאירובית, יש לדלל את התרבית ב -14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית בצורת כלאט לשני צינורות זכוכית שטופים בחומצה.
בצינור הראשון, הוסף ברזל גופרתי מעוקר פילטר לריכוז סופי של מיליגרם אחד לליטר. בצינור השני מוסיפים ברזל גופרתי לריכוז סופי של 0.01 מיליגרם לליטר. דגרו את שני הצינורות בתא אנאירובי בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
לאחר מכן, גרמו לפעילות מערכת ההפרשה מסוג 3 על ידי העברת התרביות האנאירוביות ל-37 מעלות צלזיוס, והמשך הדגירה במשך ארבע שעות. לאחר מכן, יש לדלל את תרביות הגידול האירובי לערך OD600 של 0.2 על ידי הוספת 14 מיליליטר של מדיה M9 כלאטית לשתי צלוחיות שטופות בחומצה. הוסף ברזל גופרתי בריכוזים הסופיים הנדרשים לצלוחיות.
דגרו את שתי הצלוחיות עם אוורור ב-26 מעלות צלזיוס ב-250 סל"ד למשך שעתיים. לאחר שעתיים, העבירו את התרביות ל-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד למשך ארבע שעות כדי לגרום לפעילות מערכת הפרשה מסוג 3. לאחר השראת מערכת ההפרשה מסוג שלוש בפסאודוטוברקולוזיס של ירסיניה, העבירו נפחים מנורמלים של תרבית זו שהודגרו לצינורות של 15 מיליליטר.
הוסף ארבעה מיקרוליטרים של אלבומין בסרום בקר לכל צינור כבקרת משקעים חלבון. צנטריפוגה את התרבויות ב -3, 200 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מסננים את הסופרנטנט לצינור טרי של 15 מיליליטר באמצעות מסנן PVDF 0.22 מיקרון המחובר למזרק.
לאחר מכן, הוסף חומצה טריכלורואצטית השווה ל-10% מנפח העל. מערבל את הצינורות במרץ למשך דקה אחת. דגרו את הצינורות על קרח בחדר קר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר מכל דגימה לצינור של שני מיליליטר, ואז צנטריפוגה ב -21, 000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט באמצעות חיבור ואקום. חזור על פיפטינג של שני מיליליטר של דגימה לאותו צינור, צנטריפוגה, ושאף את הסופרנטנט.
אחד את תגובות המשקעים לצינור יחיד של שני מיליליטר. שטפו את הכדורים עם מיליליטר אחד של 100% אצטון קר כקרח ואחריו צנטריפוגה ושאיפת סופרנטנט. לאחר הסרת הסופרנטנט בפעם האחרונה, יבש את הגלולה על הספסל למשך שעה.
החלבון המשקע אמור להיראות כמו אובך לאורך צד הצינור. לאחר מכן, השעו מחדש כל כדור ב-50 מיקרוליטר של תמיסת F-S-B-DTT. מערבולת היטב למשך דקה אחת.
לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות על גוש חום בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה לזמן קצר במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר. טען 15 מיקרוליטר מכל דגימה אנאירובית ו-10 מיקרוליטר מכל דגימה אירובית לג'ל SDS-PAGE של 12.5% לניתוח.
לאחר השלמת ריצת הג'ל, השתמש בצביעת כסף כדי לדמיין חלבונים על הג'ל. כדי להתחיל, הנח ג'ל SDS-PAGE המכיל דגימות אירוביות מופרדות של Yersinia pseudotuberculosis במערכת הדמיה. בתוכנה, בחר את הרצועות המייצגות את חלבון אפקטור מערכת ההפרשה מסוג שלוש, YopE, על פני כל הבארות.
הגדר את רצועת ה-YopE ההתייחסות לדגימה המתאימה. ייצא את ערכי הכימות היחסיים המחושבים על ידי תוכנה עבור כל רצועות ה-YopE. לאחר מכן, בחר את כל רצועות ה-BSA בכל הבארות.
ודא שרצועת ה-BSA הייחוס תואמת את הדגימה של רצועת ה-YopE הייחוס. ייצא את ערכי הכימות היחסיים עבור כל רצועות ה- BSA. חלקו את ערך ה-YopE בערך ה-BSA עבור כל תנאי כדי להפיק תוצאות מנורמלות.
ג'ל SDS-PAGE מוכתם בכסף גילה כי בדגימות האנאירוביות, פי 38 יותר YopE היה נוכח בדגימות הברזל הנמוכות בהשוואה לדגימות הברזל הגבוהות. בדגימות האירוביות, חלבונים אלה הופרשו בכמויות כמעט דומות.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן כיצד הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis מווסת את גורם virulent-ness שלו, מערכת הפרשה מסוג III, בתגובה לרמזים סביבתיים כגון זמינות ברזל ומתח חמצן. המחקר מדגיש את העומס המטבולי הכרוך בביטוי של גורם וירולנתי זה ואת המנגנונים המעורבים בוויסותו.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- פתוגנזה
- אינטראקציות מאחס-פתוגן
רקע
- פתוגנים חיידקיים משתמשים בגורמי virulent כדי לקולוניז את רקמות המארח.
- מערכת הפרשה מסוג III היא חיונית להזרקת חלבוני אפקטור לתאי מארח.
- ביטוי של גורמי virulence מוסדר על ידי תנאים סביבתיים.
- זמינות ברזל ומתח חמצן משפיעים באופן משמעותי על הביטוי של מערכת הפרשה מסוג III ב-Yersinia pseudotuberculosis.
מטרת המחקר
- להבנה כיצד Yersinia pseudotuberculosis מזהה רמזים סביבתיים.
- לחקירת הבקרה של מערכת הפרשה מסוג III תחת תנאים משתנים.
- לבחינת ההשלכות המטבוליות של ביטוי גורמי virulentnce.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- גידול של Yersinia pseudotuberculosis תחת ריכוזי ברזל שונים.
- התאמת מתח החמצן במהלך צמיחת החיידקים.
- כימות הפעילות של מערכת הפרשה מסוג III.
- ניתוח המנגנונים הרגולטוריים המעורבים בביטוי גורמי virulent.
תוצאות עיקריות
- Yersinia pseudotuberculosis מווסת את מערכת הפרשתו מסוג III בהתבסס על רמות ברזל וחמצן.
- הביטוי של מערכת ההפרשה מסוג III הוא יקר מבחינה מטבולית ומבוקר באופן הדוק.
- רמזים סביבתיים משפיעים באופן משמעותי על virulent של הפתוגן.
- הממצאים תורמים להבנת ההסתגלות הבקטריאלית בסביבות מאכסן.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי המנגנונים הרגולטוריים של גורמי virulent של חיידקים.
- הבנת מנגנונים אלה יכולה לסייע בגיבוש אסטרטגיות למאבק בזיהומים חיידקיים.
- מחקרים עתידיים עשויים לבחון גורמים סביבתיים נוספים המשפיעים על ה-virulence.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית מרכזית
הערכה כמותית של פעילות ה-T3SS של Yersinia pseudotuberculosis תחת הרעבה לברזל וצמיחה אנאירובית מספקת מסגרת חסונה לחקירת ויסות העוצמה הפתוגנית (virulence) של הפתוגן בתנאים הרלוונטיים למארח. גישה זו מאפשרת הפחתת סיכונים מכניסטית של מטרות אנטי-מיקרוביאליות על ידי קישור רמזים סביבתיים להפרשת חלבוני אפקטור, ובכך מספקת מידע ישיר לאסטרטגיות של אימות מטרות וסריקה בשלבים מוקדמים. השיטה תומכת בביטחון חיזוי עבור קמפיינים לגילוי תרופות אנטי-מיקרוביאליות המתמקדים בעיכוב ה-T3SS.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של מנגנוני הבקרה של T3SS בתגובה לברזל וחמצן, ובכך מבהיר את השליטה במסלול virulence.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי כימות הפרשת אפקטורים תחת תנאים סביבתיים מוגדרים.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים לשימוש ב-T3SS כמטרה אנטי-מיקרוביאלית.
- מספק פלטפורמה להערכה מונחית-היפותזה של מודולציה של גורמי virulence.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספק פרוטוקולים סטנדרטיים להשראה ולכימות של פעילות T3SS in vitro.
- מאפשר מדידה הדירה של חלבוני אפקטור מופרשים באמצעות SDS-PAGE וצביעת כסף.
- תומך בהכנת מערך הבדיקה לסריקת תרכובות המכוונות לתפקוד ה-T3SS.
- מאפשר נרמול והשוואה כמותית בין תנאים ניסיוניים שונים.
מחקר תרגומי ו-Preclinical
- מתאים את התנאים in vitro לסביבות ברזל וחמצן הרלוונטיות למאכסן הנפגשות במהלך זיהום.
- מסייע להמשכיות תרגומית באמצעות מידול התאמת הפתוגן לנישות של רקמות יונקים.
- מאפשר קידום מותאם סיכונים של מועמדים המכוונים ל-T3SS בהתבסס על תוצאות פונקציונליות.
- מספק מסגרת הניתנת להתאמה לפתוגנים אחרים בעלי מערכות ספיגת ברזל חסונות.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף הגילוי, החל ממחקרים מכניסטיים מוקדמים, דרך פיתוח בדיקות ועד לתיקוף פרה-קליני של אסטרטגיות נגד וירולנציה.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערות על ויסות סביבתי של T3SS וביטוי גורמי virulent.
- סריקה: מספקת קריאות כמותיות וניתנות לשחזור של הפרשת אפקטורים תחת תנאים מוגדרים.
- אנליטיקה: מאפשרת נורמליזציה והשוואה סטטיסטית של הפרשת חלבונים על פני מדרגי ברזל וחמצן.
- מחקר תרגומי: מדמה את התנהגות הפתוגן בסביבות דמויות מאחס, ובכך מסייעת בבחירת מועמדים לשלב הפרה-קליני.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע פרוטוקול בר-שימוש להערכת פעילות T3SS בפתוגנים שונים בעלי דופן גרם-שלילית.
השפעה תפעולית ועסקית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ב-T3SS כיעד תרופתי על ידי קישור רמזים סביבתיים לפלט תפקודי.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של כימות האפקטורים ותנאי הבדיקה לצורך השוואה בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות של go/no-go עבור תוכניות המכוונות ל-T3SS באמצעות אספקת נתונים כמותיים אמינים.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכונים של מועמדים לאנטי-וירולנטיות על בסיס ראיות מכניסטיות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול חיידקים תחת תנאי ברזל וחמצן מבוקרים.
- דורש גישה לכלים מזכוכית שעברו שטיפה בחומצה, למצעים קלטיים (chelated) ולתשתית לכימות חלבונים.
- מצריך סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת דגימות וכימות.
- ניתן להתאמה לפתוגנים אחרים בעלי מערכות ספיגת ברזל דומות, בכפוף לאופטימיזציה.
- תלוי בנורמליזציה מדויקת ובניתוח סטטיסטי של פלטי חלבוני האפקטור (effector protein).
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:06
Yersinia pseudotuberculosis Culture Under Varying Oxygen Tension and Iron Levels
4:51
Trichloroacetic Acid Precipitation of T3SS Effector Proteins from Yersinia pseudotuberculosis Culture
7:19
Relative Quantification of T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Cultured in Varying Iron Levels and Oxygen Tension
8:14
Representative Results
