כימות פעילות מערכת ההפרשה של Yersinia pseudotuberculosis Type III לאחר רעב לברזל וצמיחה אנאירובית
May 31st, 2024
חיידקים מאכלסים רקמות מארחות המשתנות בזמינות הביולוגית של חמצן וברזל, אך רוב הגישות לחקר חיידקים משתמשות במדיה מאווררת ועשירה. פרוטוקול זה מתאר תרבית של הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis תחת ריכוזי ברזל ומתח חמצן משתנים, וכימות הפעילות של מערכת ההפרשה של Yersinia Type III, שהיא גורם אלימות חשוב.
פתוגנים חיידקיים משתמשים בגורמי אלימות כדי ליישב נישות שונות בתוך האורגניזם המארח. אנו עובדים כדי להבין כיצד פתוגנים חיידקיים חשים רמזים סביבתיים ספציפיים ברקמות המארח כדי לווסת את ביטוי גורמי האלימות. הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis משתמש בגורם האלימות של מערכת ההפרשה מסוג 3 כדי להזריק חלבוני אפקטור לתאי המארח.
מערכת ההפרשה מסוג 3 מאפשרת לחיידקים לחתור תחת מנגנוני ההגנה של המארח וליישב רקמות מארח. עם זאת, הביטוי של מערכת ההפרשה של ירסיניה סוג III הוא מכביד מבחינה מטבולית, ולכן הביטוי של גנים של מערכת ההפרשה מסוג 3 מווסת בקפדנות בתגובה לרמזים סביבתיים כמו טמפרטורה. הפרסומים הקודמים שלנו הראו כי ביטוי מערכת ההפרשה של Yersinia Type III נשלט על ידי זמינות ברזל ומתח חמצן באמצעות גורם שעתוק הנקרא ISCR.
ממצאים אלה משמעותיים מכיוון שירסניה מתיישבת ברקמות מארח המשתנות בתכולת הברזל ובמתח החמצן שלהן. לדוגמה, לומן המעי מכיל מספיק ברזל לצמיחת ירסיניה אך יש לו מתח חמצן נמוך. לעומת זאת, לרקמות כמו הדם יש זמינות ברזל נמוכה מאוד אך מתח חמצן גבוה יותר.
השיטה שלנו מאפשרת לנו לגדל ירסיניה בתנאי תרבית המשתנים בכמות הברזל והחמצן הזמינים, כדי לחקור כיצד רמזים סביבתיים אלה משפיעים על ביטוי מערכת ההפרשה מסוג 3. שיטה זו תעזור לנו לקבוע את המנגנון המולקולרי שבאמצעותו זמינות הברזל והחמצן שולטת בביטוי של מערכת ההפרשה מסוג 3, ותעזור לנו להבין כיצד היא שולטת בתוצאה של זיהום ירסיניה. כדי להתחיל, פס את Yersinia Pseudo tuberculosis על צלחות אגר מרק ליזוגני.
דגרו את הצלחות בטמפרטורת החדר למשך 48 שעות. לאחר שנוצרות מושבות גלויות, חסנו מושבה מבודדת אחת לארבעה מיליליטר של מדיה M9. תרבית אותו למשך הלילה ב-26 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד.
מניחים קובטה המכילה את התרבית בספקטרומטר, ולאחר מכן מדללים את התרבית ב-14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית ללא תוספת ברזל כדי להשיג ערך OD600 של 0.1. מניחים את הצלוחיות בשייקר של 26 מעלות צלזיוס ודוגרים במשך שמונה שעות. לאחר השלמת הדגירה, השתמש בתרבות כדי להתחיל שלוש תרבויות טריות; שניים לצמיחה אנאירובית ואחד לצמיחה אירובית.
לתרבית אירובית, יש לדלל את התרבית לערך OD600 של 0.1 ב-14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית ללא תוספת ברזל. לאחר מכן, תרבית עם אוורור ב -26 מעלות צלזיוס למשך 12 שעות. לתרבות אנאירובית, יש לדלל את התרבית ב -14 מיליליטר של מדיה M9 סטרילית בצורת כלאט לשני צינורות זכוכית שטופים בחומצה.
בצינור הראשון, הוסף ברזל גופרתי מעוקר פילטר לריכוז סופי של מיליגרם אחד לליטר. בצינור השני מוסיפים ברזל גופרתי לריכוז סופי של 0.01 מיליגרם לליטר. דגרו את שני הצינורות בתא אנאירובי בטמפרטורת החדר למשך 12 שעות.
לאחר מכן, גרמו לפעילות מערכת ההפרשה מסוג 3 על ידי העברת התרביות האנאירוביות ל-37 מעלות צלזיוס, והמשך הדגירה במשך ארבע שעות. לאחר מכן, יש לדלל את תרביות הגידול האירובי לערך OD600 של 0.2 על ידי הוספת 14 מיליליטר של מדיה M9 כלאטית לשתי צלוחיות שטופות בחומצה. הוסף ברזל גופרתי בריכוזים הסופיים הנדרשים לצלוחיות.
דגרו את שתי הצלוחיות עם אוורור ב-26 מעלות צלזיוס ב-250 סל"ד למשך שעתיים. לאחר שעתיים, העבירו את התרביות ל-37 מעלות צלזיוס עם אוורור ב-250 סל"ד למשך ארבע שעות כדי לגרום לפעילות מערכת הפרשה מסוג 3. לאחר השראת מערכת ההפרשה מסוג שלוש בפסאודוטוברקולוזיס של ירסיניה, העבירו נפחים מנורמלים של תרבית זו שהודגרו לצינורות של 15 מיליליטר.
הוסף ארבעה מיקרוליטרים של אלבומין בסרום בקר לכל צינור כבקרת משקעים חלבון. צנטריפוגה את התרבויות ב -3, 200 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מסננים את הסופרנטנט לצינור טרי של 15 מיליליטר באמצעות מסנן PVDF 0.22 מיקרון המחובר למזרק.
לאחר מכן, הוסף חומצה טריכלורואצטית השווה ל-10% מנפח העל. מערבל את הצינורות במרץ למשך דקה אחת. דגרו את הצינורות על קרח בחדר קר בטמפרטורה של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה.
לאחר מכן, הוסף שני מיליליטר מכל דגימה לצינור של שני מיליליטר, ואז צנטריפוגה ב -21, 000 גרם למשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס. שאפו את הסופרנטנט באמצעות חיבור ואקום. חזור על פיפטינג של שני מיליליטר של דגימה לאותו צינור, צנטריפוגה, ושאף את הסופרנטנט.
אחד את תגובות המשקעים לצינור יחיד של שני מיליליטר. שטפו את הכדורים עם מיליליטר אחד של 100% אצטון קר כקרח ואחריו צנטריפוגה ושאיפת סופרנטנט. לאחר הסרת הסופרנטנט בפעם האחרונה, יבש את הגלולה על הספסל למשך שעה.
החלבון המשקע אמור להיראות כמו אובך לאורך צד הצינור. לאחר מכן, השעו מחדש כל כדור ב-50 מיקרוליטר של תמיסת F-S-B-DTT. מערבולת היטב למשך דקה אחת.
לאחר מכן, הרתיחו את הדגימות על גוש חום בחום של 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות. לאחר מכן, צנטריפוגה לזמן קצר במהירות מקסימלית בטמפרטורת החדר. טען 15 מיקרוליטר מכל דגימה אנאירובית ו-10 מיקרוליטר מכל דגימה אירובית לג'ל SDS-PAGE של 12.5% לניתוח.
לאחר השלמת ריצת הג'ל, השתמש בצביעת כסף כדי לדמיין חלבונים על הג'ל. כדי להתחיל, הנח ג'ל SDS-PAGE המכיל דגימות אירוביות מופרדות של Yersinia pseudotuberculosis במערכת הדמיה. בתוכנה, בחר את הרצועות המייצגות את חלבון אפקטור מערכת ההפרשה מסוג שלוש, YopE, על פני כל הבארות.
הגדר את רצועת ה-YopE ההתייחסות לדגימה המתאימה. ייצא את ערכי הכימות היחסיים המחושבים על ידי תוכנה עבור כל רצועות ה-YopE. לאחר מכן, בחר את כל רצועות ה-BSA בכל הבארות.
ודא שרצועת ה-BSA הייחוס תואמת את הדגימה של רצועת ה-YopE הייחוס. ייצא את ערכי הכימות היחסיים עבור כל רצועות ה- BSA. חלקו את ערך ה-YopE בערך ה-BSA עבור כל תנאי כדי להפיק תוצאות מנורמלות.
ג'ל SDS-PAGE מוכתם בכסף גילה כי בדגימות האנאירוביות, פי 38 יותר YopE היה נוכח בדגימות הברזל הנמוכות בהשוואה לדגימות הברזל הגבוהות. בדגימות האירוביות, חלבונים אלה הופרשו בכמויות כמעט דומות.
סקירה
מחקר זה חוקר כיצד הפתוגן האנושי Yersinia pseudotuberculosis מווסת את גורם הוירולנטיות שלו, מערכת השחרור מסוג III, בתגובה לרמזים סביבתיים כגון זמינות ברזל ומתח חמצן. המחקר מדגיש את הנטל המטבולי של ביטוי גורם הוירולנטיות הזה והמנגנונים המעורבים בוויסותו.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מיקרוביולוגיה
- פתוגנזה
- אִינטראָקציות מארח-פתוגן
רקע
- פתוגנים חיידקיים משתמשים בגורמי וירולנטיות כדי להתיישב ברקמות המארח.
- מערכת השחרור מסוג III חיונית להזרקת חלבוני אפקטור לתאי המארח.
- ביטוי של גורמי וירולנטיות מוסדר על ידי תנאים סביבתיים.
- זמינות ברזל ומתח חמצן משפיעים משמעותית על ביטוי מערכת השחרור מסוג III ב-Yersinia pseudotuberculosis.
מטרת המחקר
- להבין כיצד Yersinia pseudotuberculosis חשה רמזים סביבתיים.
- לחקור את ויסות מערכת השחרור מסוג III בתנאים משתנים.
- לחקור את ההשלכות המטבוליות של ביטוי גורמי וירולנטיות.
שיטות שבהן נעשה שימוש
- גידול Yersinia pseudotuberculosis בריכוזי ברזל שונים.
- התאמת מתח חמצן במהלך גידול חיידקי.
- כימות פעילות מערכת השחרור מסוג III.
- ניתוח המנגנונים הרגולטוריים המעורבים בביטוי גורמי וירולנטיות.
תוצאות עיקריות
- Yersinia pseudotuberculosis מסדיר את מערכת השחרור מסוג III שלה על בסיס רמות ברזל וחמצן.
- ביטוי מערכת השחרור מסוג III הוא מטבולית יקר ומבוקר בחוזקה.
- רמזים סביבתיים משפיעים באופן משמעותי על הוירולנטיות של הפתוגן.
- הממצאים תורמים להבנת ההסתגלות החיידקית בסביבות המארח.
מסקנות
- המחקר מספק תובנות לגבי המנגנונים הרגולטוריים של גורמי הוירולנטיות החיידקיים.
- הבנת מנגנונים אלו יכולה להמחיש אסטרטגיות למאבק בזיהומים חיידקיים.
- מחקר עתידי עשוי לחקור גורמים סביבתיים נוספים המשפיעים על הוירולנטיות.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Quantitative assessment of Yersinia pseudotuberculosis T3SS activity under iron starvation and anaerobic growth provides a robust framework for interrogating pathogen virulence regulation in host-relevant conditions. This approach enables mechanistic de-risking of antimicrobial targets by linking environmental cues to effector protein secretion, directly informing early-stage target validation and screening strategies. The method supports predictive confidence for antimicrobial discovery campaigns focused on T3SS inhibition.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of T3SS regulatory mechanisms in response to iron and oxygen, clarifying virulence pathway control.
- Supports functional target validation by quantifying effector secretion under defined environmental conditions.
- Facilitates mechanistic de-risking for T3SS as an antimicrobial target.
- Provides a platform for hypothesis-driven evaluation of virulence factor modulation.
Screening & Assay Development
- Delivers standardized protocols for inducing and quantifying T3SS activity in vitro.
- Enables reproducible measurement of secreted effector proteins using SDS-PAGE and silver staining.
- Supports assay readiness for compound screening targeting T3SS function.
- Allows normalization and quantitative comparison across experimental conditions.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro conditions with host-relevant iron and oxygen environments encountered during infection.
- Facilitates translational continuity by modeling pathogen adaptation to mammalian tissue niches.
- Enables risk-adjusted advancement of T3SS-targeted candidates based on functional readouts.
- Provides a framework adaptable to other pathogens with robust iron uptake systems.
Pipeline & Workflow Integration
This method integrates into the discovery continuum from early mechanistic studies through assay development and preclinical validation for anti-virulence strategies.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on environmental regulation of T3SS and virulence factor expression.
- Screening: Provides quantitative, reproducible readouts for effector secretion under defined conditions.
- Analytics: Enables normalization and statistical comparison of protein secretion across iron and oxygen gradients.
- Translational Research: Models pathogen behavior in host-like environments, informing preclinical candidate selection.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable protocol for evaluating T3SS activity in diverse Gram-negative pathogens.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in T3SS as a drug target by linking environmental cues to functional output.
- Operational Value: Standardizes effector quantification and assay conditions for cross-study comparability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for T3SS-targeted programs by providing robust, quantitative data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of anti-virulence candidates based on mechanistic evidence.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bacterial culturing under controlled iron and oxygen conditions.
- Needs access to acid-washed glassware, chelated media, and protein quantification infrastructure.
- Demands cross-team standardization of sample preparation and quantification protocols.
- Adaptable to other pathogens with similar iron uptake systems, pending optimization.
- Dependent on accurate normalization and statistical analysis of effector protein outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:06
Yersinia pseudotuberculosis Culture Under Varying Oxygen Tension and Iron Levels
4:51
Trichloroacetic Acid Precipitation of T3SS Effector Proteins from Yersinia pseudotuberculosis Culture
7:19
Relative Quantification of T3SS Activity in Yersinia pseudotuberculosis Cultured in Varying Iron Levels and Oxygen Tension
8:14
Representative Results
