Name: כימות פעילות מערכת ההפרשה של Yersinia pseudotuberculosis Type III לאחר רעב לברזל וצמיחה אנאירובית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-31T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: חקור את מנגנוני הרגולציה של מערכת ההפרשה מסוג III ב-Yersinia pseudotuberculosis בתגובה לרמות ברזל וחמצן. שיטה זו מאפשרת הבנת הסתגלות חיידקית לסביבת המארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>פעילות T3SS ב-Yersinia pseudotuberculosis תחת דלדול ברזל ומתח אנאירובי

<ol><li>Deng, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly%2C+structure%2C+function+regulation+of+type+III+secretion+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Assembly, structure, function regulation of type III secretion systems.</a> Nat Rev Microbiol. 15 (6), 323-337 (2017).</li>
<li>Springer International Publishing. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Bacterial+Type+III+Protein+Secretion+Systems%22">Bacterial Type III Protein Secretion Systems</a>. 427, Springer International Publishing. Cham. (2020).</li>
<li>Schubert, K. A., Xu, Y., Shao, F., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+type+III+secretion+system+as+a+tool+for+studying+cytosolic+innate+immune+surveillance%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia type III secretion system as a tool for studying cytosolic innate immune surveillance.</a> Annu Rev Microbiol. 74, 221-245 (2020).</li>
<li>Cassat, J. E., Skaar, E. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+in+infection+and+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Host+Microbe%22%5BJournal%5D)">Iron in infection and immunity.</a> Cell Host Microbe. 13 (5), 509-519 (2013).</li>
<li>Singhal, R., Shah, Y. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oxygen+battle+in+the+gut%3A+Hypoxia+and+hypoxia-inducible+factors+in+metabolic+and+inflammatory+responses+in+the+intestine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Oxygen battle in the gut: Hypoxia and hypoxia-inducible factors in metabolic and inflammatory responses in the intestine.</a> J Biol Chem. 295 (30), 10493-10505 (2020).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465 (7296), 355-358 (2010).</li>
<li>Rakin, A., Schneider, L., Podladchikova, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hunger+for+iron%3A+the+alternative+siderophore+iron+scavenging+systems+in+highly+virulent+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infect+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Hunger for iron: the alternative siderophore iron scavenging systems in highly virulent Yersinia.</a> Front Cell Infect Microbiol. 2, (2012).</li>
<li>Lesic, B., Carniel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Horizontal+Transfer+of+the+high-pathogenicity+island+of+Yersinia+pseudotuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Horizontal Transfer of the high-pathogenicity island of Yersinia pseudotuberculosis.</a> J Bacteriol. 187 (10), 3352-3358 (2005).</li>
<li>Green, E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fis+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+virulence+and+protects+against+reactive+oxygen+species+produced+by+phagocytic+cells+during+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Fis is essential for Yersinia pseudotuberculosis virulence and protects against reactive oxygen species produced by phagocytic cells during infection.</a> PLOS Pathog. 12 (9), e1005898(2016).</li>
<li>Cornelis, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yersinia+Ysc-Yop+%26%2334%3BType+III%26%2334%3B+weaponry%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Yersinia Ysc-Yop &#34;Type III&#34; weaponry.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 3 (10), 742-753 (2002).</li>
<li>Cheng, L. W., Anderson, D. M., Schneewind, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+independent+type+III+secretion+mechanisms+for+YopE+in+Yersinia+enterocolitica%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Two independent type III secretion mechanisms for YopE in Yersinia enterocolitica.</a> Mol Microbiol. 24 (4), 757-765 (1997).</li>
<li>Straley, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+low-Ca2%2B+response+virulence+regulon+of+human-pathogenic+yersiniae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbial+Pathog%22%5BJournal%5D)">The low-Ca2+ response virulence regulon of human-pathogenic yersiniae.</a> Microbial Pathog. 10 (2), 87-91 (1991).</li>
<li>Balada-Llasat, J. -M., Mecsas, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+has+a+tropism+for+B+and+T+cell+zones+of+lymph+nodes+that+is+independent+of+the+type+III+secretion+system%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Yersinia has a tropism for B and T cell zones of lymph nodes that is independent of the type III secretion system.</a> PLoS Pathog. 2 (9), e86(2006).</li>
<li>Adams, W., Morgan, J., Kwuan, L., Auerbuch, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yersinia+pseudotuberculosis+YopD+mutants+that+genetically+separate+effector+protein+translocation+from+host+membrane+disruption%3A+YopD+central+region+promotes+Yop+translocation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Yersinia pseudotuberculosis YopD mutants that genetically separate effector protein translocation from host membrane disruption: YopD central region promotes Yop translocation.</a> Mol Microbiol. 96 (4), 764-778 (2015).</li>
<li>Hooker-Romero, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+availability+and+oxygen+tension+regulate+the+Yersinia+Ysc+type+III+secretion+system+to+enable+disseminated+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Pathog%22%5BJournal%5D)">Iron availability and oxygen tension regulate the Yersinia Ysc type III secretion system to enable disseminated infection.</a> PLOS Pathog. 15 (12), e1008001(2019).</li>
<li>Balderas, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+scale+analysis+reveals+IscR+directly+and+indirectly+regulates+virulence+factor+genes+in+pathogenic+Yersinia%5BTitle%5D)+AND+%22mBio%22%5BJournal%5D)">Genome scale analysis reveals IscR directly and indirectly regulates virulence factor genes in pathogenic Yersinia.</a> mBio. 12 (3), e00633-00721 (2021).</li>
<li>Bearden, S. W., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Yfe+system+of+Yersinia+pestis+transports+iron+and+manganese+and+is+required+for+full+virulence+of+plague%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Microbiol%22%5BJournal%5D)">The Yfe system of Yersinia pestis transports iron and manganese and is required for full virulence of plague.</a> Mol Microbiol. 32 (2), 403-414 (1999).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%3A+Global+analysis+of+iron+assimilation+and+fur+regulation+in+Yersinia+pestis%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol+Lett%22%5BJournal%5D)">Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis: Global analysis of iron assimilation and fur regulation in Yersinia pestis.</a> FEMS Microbiol Lett. 258 (1), 9-17 (2006).</li>
<li>Wijerathne, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+new+class+of+%5B2Fe-2S%5D+protein+that+functions+in+bacterial+iron+homeostasis%2C+requires+a+structural+anion+binding+site%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">a new class of [2Fe-2S] protein that functions in bacterial iron homeostasis, requires a structural anion binding site.</a> Biochemistry. 57 (38), 5533-5543 (2018).</li>
<li>Bearden, S. W., Staggs, T. M., Perry, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ABC+transporter+system+of+Yersinia+pestis+allows+utilization+of+chelated+iron+by+Escherichia+coli+SAB11%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">An ABC transporter system of Yersinia pestis allows utilization of chelated iron by Escherichia coli SAB11.</a> J Bacteriol. 180 (5), 1135-1147 (1998).</li>
<li>Miller, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IscR+is+essential+for+Yersinia+pseudotuberculosis+type+III+secretion+and+virulence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Pathog%22%5BJournal%5D)">IscR is essential for Yersinia pseudotuberculosis type III secretion and virulence.</a> PLoS Pathog. 10 (6), e1004194(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>מזרק קצה Luer-Lok 10 מ"ל</td><td>BD</td><td>301029</td><td></td></tr><tr><td>מאגר ריצה 10x SDS&nbsp;</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>0.25 M בסיס Tris, 1.92 M גליצין, 1% SDS בנפח 1 ליטר</td></tr><tr><td>12.5% SDS-Page ג'ל</td><td>תוצרת</td><td></td><td></td>בית</tr><tr><td>15 מ"ל צינורות תרבית</td><td>Falcon</td><td>352059</td><td>ללילה ראשוני&nbsp;</td></tr><tr><td>15 מ"ל שפופרות פלקון</td><td>Falcom</td><td>352196</td><td>לאיסוף סופרנטנטים</td></tr><tr><td>250 מ"ל בקבוק תרבית</td><td>Belco</td><td>251000250</td><td></td></tr><tr><td>500 מ"ל מערכת סינון</td><td>קורנינג</td><td>431097</td><td></td></tr><tr><td>6 N תמיסת חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>7732185</td><td></td></tr><tr><td>אצטון</td><td>פישר כימי</td><td>A949-4</td><td>4 L</td></tr><tr><td>ביו ראד ChemiDoc MP הדמיה מספר</td><td></td><td>דגם: מכסה מנוע אוניברסלי III</td><td></td></tr><tr><td>בורוסיליקט צינורות תרבית זכוכית</td><td>פישרברנד</td><td>14-961-34</td><td>לתרבות אנאירובית</td></tr><tr><td>Chelex 100 שרף</td><td>ביו ראד</td><td>142-1253</td><td></td></tr><tr><td>Chelex M9 +0.9% גלוקוז מדיה</td><td>תוצרת בית</td><td></td><td>6 גרם/ליטר Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 גרם/ליטר NH4Cl, 1% חומצות קסאמינו, <חזק>0.9% דקסטרוז</חזק>, 0.0005% תיאמין, 5 גרם/ליטר שרף Chelex 100. מערבבים מדיה במשך 18 שעות בטמפרטורת החדר, מסננים באמצעות יחידת סינון קורנינג של 500 מ"ל, ואז מוסיפים MgSO4 עבור 1 מ"מ MgSO4 final</td></tr><tr><td>Buffer Final Sample Buffer (FSB)</td> <td>תוצרת</td><td></td> בית <td>0.1 M Tris-HCl, 4% SDS, 20% גליצרול, 0.2% של ברומופנול</td></tr><tr><td>כחול FSB: פתרון DTT</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>FSB+0.2M DTT</td></tr><tr><td>Image Lab Software</td><td>Bio Rad</td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/product/image-lab-software?ID=KRE6P5E8Z</td><td>Software</td></tr><tr><td>Isotemp Heat Block</td><td>Fisher Scientific</td><td>88860021</td><td></td></tr><tr><td>LB Agar Plates</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>10 גרם טריפטון, 5 גרם תמצית שמרים, 10 גרם NaCl, 15 גרם אגר בנפח כולל של 1 ליטר. חיטוי</td></tr><tr><td>M9 + 0.2% גלוקוז מדיה</td><td>תוצרת</td><td></td> בית <td>6 גרם/ליטר Na2HPO4, 3 g/L KH2PO4, 0.5 g/L NaCl, 1 g/L NH4Cl, 1 מ"מ MgSO<תת>4, 1 מ"ג/ליטר FeSO47H2O, 1% חומצות קסאמינו, <חזקות>0.2% דקסטרוז</חזק>, 0.0005% תיאמין&nbsp;</td></tr><tr><td>Millex-GP PES 0.22um מסנן מצורף למזרק</td><td>Millipore</td><td>SLGPR33RS</td><td>עבור FeSO47H2O</td></tr><tr><td>סינון Millex-GV PVDF 0.22um מסנן מצורף למזרק</td><td>Millipore</td><td>SLGVR33RS</td><td>לסינון supernatant</td></tr><tr><td>דיוק פלוס חלבון לא מוכתם סטנדרטי</td><td>Bio Rad</td><td>1610363</td><td></td></tr><tr><td>SDS-PAGE ג'ל מכשיר</td><td>ביו ראד</td> מספר <td>דגם: מיני PROTEAN Tetra תא</td><td></td></tr><tr><td>ערכת צביעת כסף SilverXpress&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>LC6100</td><td></td></tr><tr><td>The BellyDancer Shaker</td><td>IBI Scientific</td><td>BDRAA1155</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת חומצה טריכלורואצטית 6.1N</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0699</td><td></td></tr><tr><td>ויניל תא אנאירובי</td><td>Coy Lab מוצרים</td><td></td><td>https://coylab.com/products/anaerobic-chambers/vinyl-anaerobic-chambers/#details</td></tr><tr><td>qPCR רצפי פריימר&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA קדימה - CAC AGT CAG CAG ACC TTA TCT T</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yfeA הפוך - GGC AGA CGG GAC ATC TTT AAT A</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfd קדימה - ccagcatcagccccatacag</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bfd הפוך - tggcttgtcggatgcacttc</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE קדימה - CCATAAACCGGTGGTGAC</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>yopE הפוך - CTTGGCATTGAGTGATACTG</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

כימות פעילות מערכת ההפרשה של yersinia pseudotuberculosis type iii לאחר רעב לברזל וצמיחה אנאירובית

Quantifying Yersinia pseudotuberculosis Type III Secretion System Activity Following Iron Starvation and Anaerobic Growth

שיטה זו מאפשרת השוואה יחסית של יופים מופרשים על פני תנאים שונים ביחס למצב ייחוס מעניין. זרימת העבודה הניסיונית הכוללת מתוארת באיור 1. טבלה 1 מתארת ייצוג של האופן שבו נורמליזציה של תרבית תאים תתרחש בדרך כלל במקרה של כל מצב תרבית ונפח ה-TCA שיתווסף לכל סופרנטנט. כאן, תוצאות מייצגות מוצגות באמצעות Wildtype (WT) Y. pseudotuberculosis IP2666pIB1 וכן שני מוטציות קונגניות, ΔyscNU ו-ΔyopE. המוטציה ΔyopE משמשת כבקרה חסרת YopE, בעוד שהמוטנט ΔyscNU משמש כבקרה שלילית מלאה של T3SS מכיוון שהוא אינו מסוגל להרכיב T3SSפונקציונלי 13,14. תמונה מייצגת של ג'ל 12.5% SDS-PAGE מוכתם בכסף המכיל את החלבונים המופרשים מתוארת באיור 2. כפי שתואר לעיל, כל דגימה הכילה BSA מובהק כבקרה על יעילות משקעי החלבון. בניתוח הנתונים, יש להתייחס למערכי נתונים אנאירוביים ואירוביים כמערכי נתונים עצמאיים מכיוון שכל אחד מהם נורמל בנפרד. בדגימות האנאירוביות, ~פי 38 יותר YopE היה נוכח בדגימות הברזל הנמוכות ביחס לדגימות הברזל הגבוהות, בהתאם לתוצאות קודמות15,16. בדגימות האירוביות נצפתה כמות דומה של YopE מופרש בדגימות ברזל נמוכות וגבוהות, בהתאם לתוצאות קודמות16. בדרך כלל, לפחות שלושה שכפולים ביולוגיים של כל מצב משמשים לקביעת מובהקות סטטיסטית.
כדי לאשר שפרוטוקול זה מביא לרעב הולם של ברזל, נערך ניתוח qPCR על גנים המגיבים לברזל yfeA ו-bfd בזן הבר בכל התנאים. YfeA הוא חלבון הקישור הפריפלזמי של מערכת הובלת ABC האחראית על הובלת ברזל, בעוד ש-Bfd הוא פרדוקסין הקשור לבקטריופריטין המעורב בגיוס מאגרי ברזל 17,18,19,20. RNA בודד כפי שתואר קודם לכן21, וכצפוי, yfeA ו-bfd היו מווסתים באופן משמעותי בתנאים מדוללי ברזל ביחס לתנאים מלאי ברזל, הן אירובית והן אנאירובית, כפי שמוצג באיור 3. בנוסף, כימתנו את רמות ה-mRNA של yopE במצב יציב באמצעות qPCR כדי לאשר שהתוצאות שנצפו עבור YopE יחסי ברמת החלבון היו עקביות עם רמות התעתיק של yopE (ראה איור 3).
לבסוף, מכיוון שחיידקים נוטים לליזינג בתנאי תרבות מלחיצים, היה חשוב להראות שהשלבים בפרוטוקול זה אינם גורמים לליזה חיידקית שעלולה לבלבל את התוצאות. כדי לאשר זאת, דגימות סופרנטנט שהושקעו על ידי TCA היו נתונות לכתמים מערביים ונבדקו עבור YopE ו-RpoA, תת-יחידה של RNA פולימראז וחלבון ציטופלזמי. כפי שמוצג באיור 4, בעוד שדפוס הביטוי של YopE עקב אחר זה שמוצג באיור 3, לא הייתה עדות לנוכחות RpoA בסופרנטנטים דגימיים, מה שמצביע על כך שלא הייתה ליזה נצפית שתשחרר RpoA ציטופלזמי לתוך הסופרנטנט.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig01.jpg"> 
איור 1: זרימת עבודה ניסיונית לגידול Yersinia pseudotuberculosis תחת זמינות משתנה של ברזל וחמצן. ייצוג גרפי של שלבי הטיפוח. שימו לב שיש להשתמש בכלי זכוכית שטופים בחומצה החל מהיום הרביעי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig02.jpg"> 
איור 2: תוצאות של ג'ל 12.5% SDS-PAGE מוכתם בכסף של חלבון משקע TCA מתרבית-על. סופרנטנטים תרבית משקעים הועמסו על ג'ל SDS-PAGE 12.5% ומוכתמים בכסף. (A) פרופיל הפרשה של זני WT, ΔyscNU ו-ΔyopE שגדלו בצורה אנאירובית. ערכים יחסיים מייצגים של YopE מנורמלים לדגימת WT אנאירובית גדושה בברזל. (B) פרופיל הפרשה של זני WT, ΔyscNU ו-ΔyopE שגדלו באופן אירובי. ערכים יחסיים מייצגים של YopE מנורמלים לדגימת הברזל האירובית WT. חיצים לבנים מציינים YopE (~23 kDa). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig03.jpg"> 
איור 3: רמות mRNA יחסיות של גנים המגיבים לברזל מדגימות רעב לברזל. RNA בודד מ-WT Y. pseudotuberculosis שתורבת בתנאים המתוארים באיור 1. qPCR שימש למדידת הביטוי היחסי של רמות yfeA, bfd ו-yopE מנורמלות ל-16S rRNA בתנאים אנאירוביים (A-C) ואירוביים (D-F). ****p &lt; 0.0001 כפי שנקבע על ידי מבחן t לא מזווג. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66642/66642fig04.jpg"> 
איור 4: היעדר RpoA ציטופלזמי בדגימות סופרנטנט מדגים את היעדר ליזה של תאים בתנאי תרבית. 5 מיקרוליטר של סופרנטנטים משקעים של דגימות אנאירוביות (A) ו-(B) אירוביות מאיור 3 הופעלו על ג'ל SDS-PAGE של 12.5% יחד עם בקרת גלולה. חלבונים הועברו לקרום PVDF לצורך כתמים מערביים. הממברנה נחתכה, והחצי העליון נבדק ל-RpoA באמצעות נוגדן נגד RpoA, והחצי התחתון נבדק ל-YopE באמצעות נוגדן נגד YopE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66642/66642fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="4">(א)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">אנאירובית</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תנאי</td>
			<td>OD</td>
			<td>נפח לאיסוף (מ"ל)</td>
			<td>נפח של 6.1 N TCA נוסף לסאפ (מ"ל)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT ברזל נמוך</td>
			<td>0.5</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT ברזל גבוה</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>0.3</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">(ב)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td colspan="4">אירובי</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תנאי</td>
			<td>OD</td>
			<td>נפח לאיסוף (מ"ל)</td>
			<td>נפח של 6.1N TCA נוסף לסאפ (מ"ל)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT ברזל נמוך</td>
			<td>0.9</td>
			<td>6</td>
			<td>0.6</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WT ברזל גבוה</td>
			<td>1.4</td>
			<td>3.857</td>
			<td>0.386</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: זרימת עבודה מייצגת של איסוף מדגמים. ביום החמישי, (A) לאחר השלמת הדגירה של 4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס עבור הדגימות האנאירוביות, נאספו 6 מ"ל מהדגימה עם ערך ה-OD600 הנמוך ביותר ושאר נפחי הדגימה נורמלו בהתאם. לאחר סינון הסופרנטנט, נוסף 6.1 N TCA. (B) לאחר השלמת הדגירה האירובית (שעתיים ב-26 מעלות צלזיוס ו-4 שעות ב-37 מעלות צלזיוס), נאספו 6 מ"ל מהדגימה עם ערך ה-OD600 הנמוך ביותר, ושאר נפחי הדגימה נורמלו בהתאם. לאחר סינון הסופרנטנט, נוסף 6.1 N TCA.

כימות פעילות מערכת ההפרשה של Yersinia pseudotuberculosis Type III לאחר רעב לברזל וצמיחה אנאירובית

A key virulence mechanism for many Gram-negative pathogens is the type III secretion system (T3SS), a needle-like appendage that translocates cytotoxic or ...

quantifying-yersinia-pseudotuberculosis-type-iii-secretion-system

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

בסרטון הזה, אנו מתארים הליך הביטוי של effectors סוג החיידק השלישי שמרים זיהוי של מפעיל-Induced פנוטיפים עיכוב צמיחה. פנוטיפים אלו ניתן לנצל לאחר מכן להבהיר פונקציות מפעיל ויעדים.

זיהוי של פנוטיפים עיכוב גדילה מושרה על ידי הבעת effectors סוג חיידקית השלישי שמרים

מקור: Gupta, S., et al. בידוד ואפיון שלפוחיות חוץ-תאיות המיוצרות על ידי מיקובקטריות מוגבלות בברזל. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את ההליך לתרבית Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל כדי לגרום ללחץ ברזל ולקדם הפרשת סידרופורים התומכים בהישרדות חיידקים.

גידול Mycobacterium tuberculosis בתנאים מוגבלים בברזל

התחל עם תרביות של מיני Yersinia גראם-שליליים ו-Enterobacteriaceae שאינם Yersinia שליליים.בעזרת חיסוני מחט סטריליים, נקדו את התרביות הן על Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin המסורתי או CIN agar והן על אגר CIN שונה.דגרו על הצלחות כדי לקדם צמיחת חיידקים.הן אגרות CIN מסורתיות והן מהונדסות תומכות בצמיחה של Yersinia ו-Enterobacteriaceae שאינן Yersinia המתסיסות מניטול לייצור תוצרי לוואי חומציים.ייצור חומצה מוריד את ה-pH וגורם לשינוי צבע, וכתוצאה מכך מורפולוגיה אופיינית של מושבה אדומה.אגר CIN שונה מכיל...

בידוד דיפרנציאלי משופר של מיני Yersinia באמצעות אגר Cefsulodin-Irgasan-Novobiocin שונה

סרטון זה מדגים בדיקת פוספטאז אלקליין אלקליין עוברית המופרשת באמצעות תאי כתב אינטרפרון-α/β HEK-Blue כדי לכמת את האינטרפרונים מסוג I (IFNs) המשתחררים בעקבות גירוי של תאים דנדריטיים פלסמציטואידים על ידי תאי T CD4+ נגועים ב- HIV-1.

כימות של אינטרפרונים ביו-אקטיביים מסוג I באמצעות בדיקת כתב אלקליין אלקליין מופרש

כאן אנו מתארים שיטה להמחשת אברון החיידקים האונקוגני המכונה מערכת הפרשת Cag Type IV (Cag-T4SS).  אנו מוצאים כי ה-Cag-T4SS מיוצר באופן דיפרנציאלי על פני השטח של הליקובקטר פילורי בתגובה לתנאים משתנים של זמינות ברזל.

רזולוציה גבוהה מיקרוסקופית אלקטרונים של הליקובקטר פילורי CAG Pili סוג IV הפרשת המערכת הופק במשתנים תנאים של זמינות הברזל

טרנסלוקציה של אפקטור לתאי מארח באמצעות מערכת הפרשה מסוג III היא אסטרטגיית אלימות נפוצה בקרב חיידקים גרם שליליים. יושם מבחן מבוסס היתוך אפקטור בטא-לקטמאז לניתוח כמותי של טרנסלוקציה. בתאים נגועים בירסיניה, ההמרה של מדווח FRET על ידי הבטא-לקטמאז מנוטרת באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר.

ניתוח של<em&gt; Enterocolitica Yersinia</em&gt; מפעיל טרנסלוקציה לתאי מארח שימוש בטא לקטמאז מפעיל Fusions

β חלבוני ממברנה חיצונית (OMPs) משרתים פונקציות רבות בתוך הממברנות החיצוניות של חיידקים גראם-שליליים, מיטוכונדריה וכלורופלסטים. כאן, אנו מקווים להקל על צוואר בקבוק ידוע במחקרים מבניים על ידי הצגת פרוטוקולים לייצור OMPs של β חביות בכמויות מספיקות לקביעת מבנה על ידי קריסטלוגרפיה של קרני רנטגן או ספקטרוסקופיה NMR.

מתוך בונה קריסטלים - לקראת מבנה קביעת β-חבית החיצון ממברנה חלבונים

שחפת של פטרת מראה הפקה מוגברת ושחרור של ושלפוחיות של מסחטות בתגובה לתנאי ברזל נמוך. עבודה זו מפרטת פרוטוקול ליצירת תנאי ברזל נמוך ושיטות לטיהור ואפיון של שלפוחיות ומסחטות בקטריאליים שפורסמו בתגובה למחסור בברזל.

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

אנו מתארים כאן שיטה לצמיחה של זיבה Neisseria במדיום נוזלי מוגבל מתכת כדי להקל על ביטוי של גנים ספיגת מתכת. כמו כן, אנו מגדירים במטה ניסויים לאפיון הפנוטיפ של גונקוצ'י שגדל בתנאים אלה. שיטות אלה ניתן להתאים כדי להיות מתאים לאפיון של גנים התגובה מתכת בחיידקים אחרים.

מתכת-צמיחה מוגבלת של הגגורסריה של ניציבטיים לאפיון של גנים מתכתיים מגיבים ורכישת מתכות מהמארח ליגנדס

פרוטוקול זה מספק ניתוחים איכותיים וכמותיים של סך כל הסידרופורים, פיוברדין ופיוצ'לין מ - Pseudomonas aeruginosa.

ניתוח איכותני וכמותי של ייצור סידרופור מ Pseudomonas aeruginosa

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקות זיהום כדי לחקור היצמדות לשיגלה , פלישה ושכפול תוך תאי באמצעות קווי תאי אפיתל במבחנה .

ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

חקור את מנגנוני הרגולציה של מערכת ההפרשה מסוג III ב-Yersinia pseudotuberculosis בתגובה לרמות ברזל וחמצן. שיטה זו מאפשרת הבנת הסתגלות חיידקית לסביבת המארח.

כימות פעילות מערכת ההפרשה של Yersinia pseudotuberculosis Type III לאחר רעב לברזל וצמיחה אנאירובית

גלה סרטונים נוספים