Name: חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-15T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 1 s
Description: חקור את תהליך הפרופטוזה במדולובלסטומה באמצעות ניתוח גנומיקה של תא בודד וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לזהות אוכלוסיות תאים עמידות לטיפול ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן ילדים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי ממשלת נסיכות מונקו, כמו גם על ידי "Le Groupement des Entreprises Monégasques dans la Lutte contre le cancer" (GEMLUC) וקרן פלביאן, שסיפקה את האמצעים לרכישת BD FACS Melody.

המחקר הנוכחי נערך באמצעות קווי תאים מסוג DAOY wild-type (WT) medulloblastoma, אשר גודלו בתרבית ב 37 ° C עם 5% CO2 בתווך DMEM בתוספת 8% FBS. קו התאים שנמחק xCT נשמר באותם תנאים, עם ניסויים שבוצעו במדיה בתוספת 1 mM N-אצטיל-ציסטאין (NAC). התאים נבדקו באופן קבוע למיקופלסמה באמצעות ערכה מסחרית לזיהוי מיקופלסמה (ראו טבלת חומרים) וגודלו בתרבית עד המעברהעשירי .
1. קציר וזריעת התאים
הערה: כל השלבים מבוצעים בטכניקות אספטיות סטריליות במכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה. תאי DAOY medulloblastoma הם דבקים, כלומר ניתן להשליך את כל התאים שאינם מחוברים על ידי שטיפה עם מלוחים חוצצי פוספט (PBS) ללא Ca2+ ו- Mg2+.
<ol><li>לוקחים את צלחת הציר (צלחת פטרי, בקוטר 100 מ"מ) עם התאים ומסירים את התאים הצפים והמדיום מהצלחת באמצעות אספירטור.</li>
	<li>הוסף 5-10 מ"ל של PBS לצלחת, לשטוף את התחתית עם תנועות מעגליות של המנה, ולאחר מכן להסיר את PBS מהצלחת באמצעות אספירטור.</li>
	<li>מוסיפים 1 מ"ל טריפסין (דילול פי 10) לצלחת. דוגרים על הצלחת עד שהקשה עדינה על הצלחת משחררת את התאים. קח 10 מ"ל של מדיום תרבית DMEM בתוספת 8% FBS ולקצור באופן מכני את התאים מהצלחת.</li>
	<li>העבר את מתלה התא לתוך צינור 15 מ"ל.</li>
	<li>קח 500 μL של השעיית התא ולשים אותו cuvette לספירה. ספור את מספר התאים לכל מ"ל של השעיית תאים. במחקר זה נעשה שימוש במונה תאים אוטומטי (ראו טבלת חומרים).</li>
	<li>חשב את הנפח הדרוש כדי לקחת מתרחיף התא כדי להכיל 1,00,000 תאים.</li>
	<li>קח צלחת 6 באר והוסף את הנפח המחושב של תרחיף התא לתוך כל באר, ולאחר מכן להוסיף מדיה תרבית DMEM בתוספת 8% FBS ל 2 מ"ל בכל באר.</li>
</ol>2. טיפול בתאים
הערה: הבקרה והטיפולים מתבצעים בשיטת טריפליקט. הקבוצות הן כדלקמן: בקרה (DMSO), 1 מיקרומטר של ארסטין, 0.3 מיקרומטר של RSL3, 250 מיקרומטר של FAC, 2 מיקרומטר של Ferrostatin 1, 1 מיקרומטר של ארסטין + 2 מיקרומטר של Ferrostatin 1, 0.3 של μM RSL3 + 2 μM של Ferrostatin 1, 250 μM של FAC + 2 μM של Ferrostatin 1. לצורך הניסוי דרושות ארבע לוחיות בנות 6 בארות, כפי שמצוין בטבלה 1). הפרטים המסחריים של כל הריאגנטים הדרושים מפורטים בטבלת החומרים.
<ol><li>24 שעות לאחר הזריעה, להוסיף את הטיפול המתאים לבאר עם התאים.</li>
	<li>השאירו את הכלים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 באינקובטור.</li>
</ol>3. צביעת הידרופרוקסידים ליפידים של התאים המטופלים עם בדיקת BODIPY 581/591 C11
הערה: תמיסת המניות של הבדיקה הספציפית להידרופראוקסיד שומנים מוכנה ב- DMSO בריכוז של 1 mM. Aliquots של פתרון המניות מאוחסנים ב -20 °C בצינורות לא שקופים. עבור צביעה, להכין פתרון עבודה 2 מיקרומטר של הבדיקה במדיה DMEM בתוספת 8% FBS.
<ol><li>6 שעות לאחר הטיפול, להתבונן בתאים תחת מיקרוסקופ אור (עיגול התא צריך להיות גלוי).</li>
	<li>מוציאים את הכלים מהאינקובטור ומניחים אותם במכסה מנוע זרימה למינרית של תרבית רקמה. בעזרת שואב הסר את המדיה ואת התאים הצפים (המתים).</li>
	<li>הוסף בעדינות 2 מ"ל של PBS לכל באר, שטוף את התחתית בתנועות מעגליות של לוחות 6 בארות, ולאחר מכן להסיר את PBS מן הבארות באמצעות שאיפה.</li>
	<li>הוסף 2 מ"ל של פתרון העבודה של הבדיקה (ריכוז סופי של 2 מיקרומטר ב- DMEM בתוספת FBS).</li>
	<li>השאירו את המנה באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2 למשך 30 דקות בחושך (ניתן לעטוף את הצלחות ברדיד אלומיניום).</li>
</ol>4. ניתוח ציטומטריית זרימה של תכולת הידרופרוקסיד שומנים בתאים המטופלים
הערה: כל השלבים הבאים מבוצעים בחושך (אין אורות במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית).
<ol><li>מוציאים את הכלים מהאינקובטור ומניחים אותם בתוך מכסה מנוע זרימה למינרי של תרבית רקמות. בעזרת אספירטור, הסירו את תמיסת הצביעה.</li>
	<li>הוסף בעדינות 2 מ"ל של PBS לכל באר, שטוף את התחתית בתנועות מעגליות של לוחות 6 בארות, ולאחר מכן להסיר את PBS מן הבארות באמצעות שאיפה.</li>
	<li>חזרו על שלב השטיפה פעם נוספת ושאפו את כל שאריות ה-PBS מהבאר באמצעות אספירטור.</li>
	<li>הוסיפו 150 μL של מגיב דיסוציאציה תאי זמין מסחרית (ראו טבלת חומרים) בתחתית כל באר ודגרו על הצלחת עד שהקשה עדינה של הצלחת תשחרר את התאים. קח 250 μL של חיץ FACS (PBS, 2 mM EDTA, 0.5% BSA) וקצור באופן מכני את התאים מהבארות.</li>
	<li>העבר את התאים לצינור FACS המתאים (שסומן בעבר) באמצעות מכסה המסנן. מניחים את הצינור עם התאים על קרח בחושך עד לביצוע הניתוח (הניתוח צריך להתבצע תוך שעה לאחר הצביעה). הערה: ההגדרה והכיול של מכונת FACS תלויים בהתקן שבו נעשה שימוש (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>צור ניסוי חדש ותן לו שם (Ferroptosis ב DAOY - hydroperoxides שומנים).</li>
	<li>בתכנון הניסוי, בחר את הלייזר (488 ננומטר) ואת המסנן (FITC).</li>
	<li>בנתוני תצוגה, בחר את גודל התא המתאים (>12 מיקרומטר), הגדר את מתחי PMT (אוכלוסיית התא אמורה להופיע ברביע הראשון של תרשים הנקודות SSC-H/FSC-H) ושער את תרשים הנקודות.</li>
	<li>הוסף תרשים חדש - היסטוגרמה, עם FITC-A על ציר y וסולם לוגריתמי.</li>
	<li>מערבלים את הדגימות בצינור FACS, מניחים אותן במכונת FACS וטוענים את הדגימה. הקלט 10,000 אירועי FSC singlet ותן שם לקובץ (לדוגמה, DAOY WT CTL 6h). יצא את הקובץ כ- .fcs.</li>
</ol>5. צביעת פרופידיום יודיד (PI) של התאים המתים בעת הטיפול
הערה: תכנון הניסוי זהה לחלוטין לזה של מדידת הידרופראוקסיד שומנים (ראה שלב 1 ושלב 2).
<ol><li>24 שעות לאחר הזריעה, מוציאים את הכלים מהאינקובטור ומניחים אותם במכסה המנוע של הזרימה הלמינרית.</li>
	<li>לאסוף את המדיה (עם תאים מתים) בצינור 15 מ"ל.</li>
	<li>הוסף 1 מ"ל של PBS לכל באר, לשטוף את התחתית עם תנועות מעגליות של צלחות 6 באר, ולאחר מכן לאסוף את PBS לתוך הצינור עם המדיה המתאימה.</li>
	<li>מוסיפים 200 מיקרוליטר טריפסין (דילול 10x) בתחתית כל באר ודגרים על הצלחת עד שהקשה עדינה של הצלחת משחררת את התאים. השתמש במדיה המתאימה + PBS כדי לקצור את התאים מהבארות.</li>
	<li>צנטריפוגה את מתלה התא ב 180 x גרם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. הסר את supernatant באמצעות אספירטור.</li>
	<li>השהה מחדש את גלולת התא ב 300 μL של חיץ FACS והניחו אותו על קרח עד לניתוח.</li>
	<li>ממש לפני הניתוח, הוסף תמיסת PI (ראה טבלת חומרים) לריכוז סופי של 2 מיקרוגרם/מ"ל.</li>
</ol>6. ניתוח ציטומטריית זרימה של תאים מתים 24 שעות לאחר הטיפול
הערה: ההגדרות והכיול של התקן FACS מתבצעים כפי שצוין קודם לכן (ראה שלב 4).
<ol><li>צור ניסוי חדש ותן לו שם (Ferroptosis in DAOY - מוות תאי).</li>
	<li>בתכנון הניסוי, בחר את הלייזר (488 ננומטר) ואת המסנן (PE).</li>
	<li>בנתוני תצוגה, בחר את גודל התא המתאים (>12 מיקרומטר), הגדר את מתחי PMT (אוכלוסיית התא צריכה להופיע ברביע הראשון של תרשים הנקודות SSC-H/FSC-H) ושער את תרשים הנקודה.</li>
	<li>הוסף תרשים חדש - היסטוגרמה, עם PE-A על ציר y וסולם לוגריתמי.</li>
	<li>מערבלים את הדגימות בצינור FACS, מניחים אותן במכונת FACS וטוענים את הדגימה.</li>
	<li>הקלט 10,000 אירועי FSC singlet ותן שם לקובץ (לדוגמה, DAOY WT CTL 6h). יצא את הקובץ כ- .fcs.</li>
</ol>7. ניתוח ציטומטריית זרימה של תכולת הידרופרוקסיד שומנים בתאי DAOY xCT-/-
הערה: תאי xCT-/- נוצרו כפי שתואר קודם לכן24.
<ol><li>עבור הניסוי הזה, זרעו את התאים כפי שמצוין בשלב 2, אבל במקום הטיפול, השלימו את המדיה עם 1 mM NAC למשך הלילה.</li>
	<li>למחרת, שמרו על NAC בקבוצה אחת והוציאו אותו מהשנייה.</li>
	<li>בצע את ניתוח ציטומטריית זרימה של תוכן hydroperoxide שומנים בדיוק באותו אופן כמתואר בשלב 6.</li>
</ol>8. ניתוח תוצאות ציטומטר הזרימה
<ol><li>פתח את מסמך ה- .fcs בתוכנת FlowJo (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>לחץ פעמיים על הקובץ הבודד כדי לפתוח את כל האירועים (לא רק סינגלים של FCS) שנרשמו במדגם הבודד (SSC-A / FSC-A dot plot). מכיוון שההגדרות הן כאלה שהגטינג שנעשה במכונה לא נשמר, יש צורך לעשות את השער שוב ולתת שם לאוכלוסייה (למשל, DAOY WT).</li>
	<li>לחץ פעמיים על האוכלוסייה המגודרת כדי לפתוח חלון נוסף עם ההיסטוגרמה.</li>
	<li>שנה את ציר Y למסנן הפלואורסצנטי שבו נעשה שימוש (Comp-FITC/PE-A).</li>
	<li>שנה את ציר X למודאלי (נרמל כל שיא למצב שלו, כלומר, ל- % ממספר התאים המרבי שנמצא בסל מסוים).</li>
	<li>העתק את ההיסטוגרמה לעורך הפריסה. חזור על פעולה זו עבור כל הדגימות, ובכל פעם שהיסטוגרמות חדשות מודבקות בעורך הפריסה, גרור אותה מעל הקודמת כך שההיסטוגרמות יהיו בשכבת-על (חצי הסטה).</li>
</ol>

ניתוח FACS של הידרופרוקסידים ליפידים בתאי מדולובלסטומה פרופטוטיים

<ol><li>Dixon, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ferroptosis%3A+An+iron-dependent+form+of+nonapoptotic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Ferroptosis: An iron-dependent form of nonapoptotic cell death.</a> Cell. 149, 1060-1072 (2012).</li>
<li>Yang, W. S., Stockwell, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+lethal+screening+identifies+compounds+activating+iron-dependent%2C+nonapoptotic+cell+death+in+oncogenic-ras-harboring+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic lethal screening identifies compounds activating iron-dependent, nonapoptotic cell death in oncogenic-ras-harboring cancer cells.</a> Chem Biol. 15 (30), 234-245 (2008).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Meister, A., Anderson, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutathione%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Glutathione.</a> Annu Rev Biochem. 52, 711-760 (1983).</li>
<li>Lewerenzm, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cystine%2Fglutamate+antiporter+system+xc-+in+health+and+disease%3A+From+molecular+mechanisms+to+novel+therapeutic+opportunities%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxid+Redox+Signal%22%5BJournal%5D)">The cystine/glutamate antiporter system xc- in health and disease: From molecular mechanisms to novel therapeutic opportunities.</a> Antioxid Redox Signal. 18 (5), 522-555 (2013).</li>
<li>Yang, W. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+ferroptotic+cancer+cell+death+by+GPX4%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of ferroptotic cancer cell death by GPX4.</a> Cell. 156, 317-331 (2014).</li>
<li>Bersuker, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CoQ+oxidoreductase+FSP1+acts+parallel+to+GPX4+to+inhibit+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The CoQ oxidoreductase FSP1 acts parallel to GPX4 to inhibit ferroptosis.</a> Nature. 575, 688-692 (2019).</li>
<li>Doll, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FSP1+is+a+glutathione-independent+ferroptosis+suppressor%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">FSP1 is a glutathione-independent ferroptosis suppressor.</a> Nature. 575, 693-698 (2019).</li>
<li>Hu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blockade+of+GCH1%2FBH4+axis+activates+ferritinophagy+to+mitigate+the+resistance+of+colorectal+cancer+to+erastin-induced+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Blockade of GCH1/BH4 axis activates ferritinophagy to mitigate the resistance of colorectal cancer to erastin-induced ferroptosis.</a> Front Cell Dev Biol. 10, (2022).</li>
<li>Lei, G., Zhuang, L., Gan, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+ferroptosis+as+a+vulnerability+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Targeting ferroptosis as a vulnerability in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 22, 381-396 (2022).</li>
<li>Viswanathan, V. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dependency+of+a+therapy-resistant+state+of+cancer+cells+on+a+lipid+peroxidase+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Dependency of a therapy-resistant state of cancer cells on a lipid peroxidase pathway.</a> Nature. 547, 453-457 (2017).</li>
<li>Lee, J., You, J. H., Kim, M. S., Roh, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epigenetic+reprogramming+of+epithelial-mesenchymal+transition+promotes+ferroptosis+of+head+and+neck+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Epigenetic reprogramming of epithelial-mesenchymal transition promotes ferroptosis of head and neck cancer.</a> Redox Biol. 37, 101697(2020).</li>
<li>Hangauer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug-tolerant+persister+cancer+cells+are+vulnerable+to+GPX4+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Drug-tolerant persister cancer cells are vulnerable to GPX4 inhibition.</a> Nature. 551, 247-250 (2017).</li>
<li>Zhang Tuo, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thrombin+induces+ACSL4-dependent+ferroptosis+during+cerebral+ischemia%2Freperfusion%5BTitle%5D)+AND+%22Signal+Transduct+Target+Ther%22%5BJournal%5D)">Thrombin induces ACSL4-dependent ferroptosis during cerebral ischemia/reperfusion.</a> Signal Transduct Target Ther. 7, 59(2022).</li>
<li>Sun, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+ferroptosis+and+emerging+links+to+the+pathology+of+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Aging+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of ferroptosis and emerging links to the pathology of neurodegenerative diseases.</a> Front Aging Neurosci. 14, (2022).</li>
<li>Zhuo, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+role+of+ferroptosis+in+glioblastoma%3A+Therapeutic+opportunities+and+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Mol+Biosci%22%5BJournal%5D)">Emerging role of ferroptosis in glioblastoma: Therapeutic opportunities and challenges.</a> Front Mol Biosci. 9, (2022).</li>
<li>Bisaro, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+analysis+of+extracellular+vesicles+from+medullospheres+reveals+a+role+for+iron+in+the+cancer+progression+of+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Ther%22%5BJournal%5D)">Proteomic analysis of extracellular vesicles from medullospheres reveals a role for iron in the cancer progression of medulloblastoma.</a> Mol Cell Ther. 3, 8(2015).</li>
<li>Schonberg, D. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preferential+iron+trafficking+characterizes+glioblastoma+stem-like+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Preferential iron trafficking characterizes glioblastoma stem-like cells.</a> Cancer Cell. 28 (4), 441-455 (2015).</li>
<li>Werbowetski-Ogilvie, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((From+sorting+to+sequencing+in+the+molecular+era%3A+the+evolution+of+the+cancer+stem+cell+model+in+medulloblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">From sorting to sequencing in the molecular era: the evolution of the cancer stem cell model in medulloblastoma.</a> FEBS J. 289 (7), 1765-1778 (2022).</li>
<li>Dixon, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pharmacological+inhibition+of+cystine-glutamate+exchange+induces+endoplasmic+reticulum+stress+and+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Pharmacological inhibition of cystine-glutamate exchange induces endoplasmic reticulum stress and ferroptosis.</a> Elife. 3, e02523(2014).</li>
<li>Bauckman, K. A., Haller, E., Flores, I., Nanjundan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iron+modulates+cell+survival+in+a+Ras-+and+MAPK-dependent+manner+in+ovarian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Iron modulates cell survival in a Ras- and MAPK-dependent manner in ovarian cells.</a> Cell Death Dis. 4, e592(2013).</li>
<li>Drummen, G. P. C., Van Liebergen, L. C., Op den Kamp, J. A. F., Post, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C11-BODIPY581%2F591%2C+an+oxidation-sensitive+fluorescent+lipid+peroxidation+probe%3A+%28Micro%29spectroscopic+characterization+and+validation+of+methodology%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">C11-BODIPY581/591, an oxidation-sensitive fluorescent lipid peroxidation probe: (Micro)spectroscopic characterization and validation of methodology.</a> Free Radic Biol Med. 33 (4), 473-490 (2002).</li>
<li>Miotto, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Insight+into+the+mechanism+of+ferroptosis+inhibition+by+ferrostatin-1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">Insight into the mechanism of ferroptosis inhibition by ferrostatin-1.</a> Redox Biol. 28, 101328(2020).</li>
<li>Daher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+ablation+of+the+cystine+transporter+xCT+in+PDAC+cells+inhibits+mTORC1%2C+growth%2C+survival%2C+and+tumor+formation+via+nutrient+and+oxidative+stresses%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Genetic ablation of the cystine transporter xCT in PDAC cells inhibits mTORC1, growth, survival, and tumor formation via nutrient and oxidative stresses.</a> Cancer Res. 79 (15), 3877-3890 (2019).</li>
<li>Shimada, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+survey+of+cell+death+mechanisms+reveals+metabolic+regulation+of+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Global survey of cell death mechanisms reveals metabolic regulation of ferroptosis.</a> Nat Chem Biol. 12, 497-503 (2016).</li>
<li>Yang, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Peroxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids+by+lipoxygenases+drives+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Peroxidation of polyunsaturated fatty acids by lipoxygenases drives ferroptosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (34), E4966-E4975 (2016).</li>
<li>Gaschler, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FINO2+initiates+ferroptosis+through+GPX4+inactivation+and+iron+oxidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">FINO2 initiates ferroptosis through GPX4 inactivation and iron oxidation.</a> Nat Chem Biol. 14, 507-515 (2018).</li>
<li>Bogacz, M., Krauth-Siegel, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tryparedoxin+peroxidase-deficiency+commits+trypanosomes+to+ferroptosis-type+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Tryparedoxin peroxidase-deficiency commits trypanosomes to ferroptosis-type cell death.</a> Elife. 7, e37503(2018).</li>
<li>Cheloni, G., Slaveykova, V. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+the+C11-BODIPY581%2F591+dye+for+the+determination+of+lipid+oxidation+in+Chlamydomonas+reinhardtii+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Cytom+Part+A%22%5BJournal%5D)">Optimization of the C11-BODIPY581/591 dye for the determination of lipid oxidation in Chlamydomonas reinhardtii by flow cytometry.</a> Cytom Part A. 83 (10), 952-961 (2013).</li>
<li>Itoh, N., Cao, J., Chen, Z. H., Yoshida, Y., Niki, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advantages+and+limitation+of+BODIPY+as+a+probe+for+the+evaluation+of+lipid+peroxidation+and+its+inhibition+by+antioxidants+in+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Bioorganic+Med+Chem+Lett%22%5BJournal%5D)">Advantages and limitation of BODIPY as a probe for the evaluation of lipid peroxidation and its inhibition by antioxidants in plasma.</a> Bioorganic Med Chem Lett. 17 (7), 2059-2063 (2007).</li>
<li>Sato, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducer+erastin+irreversibly+inhibits+system+xc%E2%88%92+and+synergizes+with+cisplatin+to+increase+cisplatin%27s+cytotoxicity+in+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducer erastin irreversibly inhibits system xc− and synergizes with cisplatin to increase cisplatin's cytotoxicity in cancer cells.</a> Sci Rep. 8, 968(2018).</li>
<li>Cheff, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferroptosis+inducing+compounds+RSL3+and+ML162+are+not+direct+inhibitors+of+GPX4+but+of+TXNRD1%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biol%22%5BJournal%5D)">The ferroptosis inducing compounds RSL3 and ML162 are not direct inhibitors of GPX4 but of TXNRD1.</a> Redox Biol. 62, 102703(2023).</li>
<li>Wang, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+degradation+mechanism+of+GPX4+degrader+in+induction+of+ferroptosis+exerting+anti-resistant+tumor+effect%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Dual degradation mechanism of GPX4 degrader in induction of ferroptosis exerting anti-resistant tumor effect.</a> Eur J Med Chem. 247, 115072(2023).</li>
<li>Vucetic, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Together+we+stand%2C+apart+we+fall%3A+how+cell-to-cell+contact%2Finterplay+provides+resistance+to+ferroptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">Together we stand, apart we fall: how cell-to-cell contact/interplay provides resistance to ferroptosis.</a> Cell Death Dis. 11, 789(2020).</li>
<li>Meira, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cystine-cysteine+intercellular+shuttle+prevents+ferroptosis+in+xctko+pancreatic+ductal+adenocarcinoma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">A cystine-cysteine intercellular shuttle prevents ferroptosis in xctko pancreatic ductal adenocarcinoma cells.</a> Cancers (Basel). 13 (6), 1434(2021).</li>
</ol>

אנו מצהירים כי אין ניגוד עניינים במחקר המוצג בזאת.

סימן ההיכר העיקרי של מוות תאי פרופטוטי הוא הצטברות בלתי מבוקרת של הידרופרוקסידים ליפידים בקרום הפלזמה. נזק חמצוני זה עלול להתרחש באופן אנזימטי או לא אנזימטי, אך בכל מקרה, התגובה תלויה בברזל/מזורזת, מה שמסביר את שמו של סוג זה של מוות תאי. הידרופרוקסידציה של שומנים מוערכת לעתים קרובות בעקיפין על ידי מדידת תוצרי הפירוק של הידרופרוקסידציה של שומנים, כגון 4-hydroxy-2,3-trans-nonenal (4-HNE) או malonaldehyde (MDA). מוצרים אלה, הנוצרים על ידי פירוק חמצוני של חומצות שומן רב בלתי רוויות, יכולים להגיב עם מקרומולקולות שונות, מה שמוביל למגוון רחב של פתולוגיות, כגון הפרעות נוירודגנרטיביות, סוכרת ואי ספיקת לב כרונית, בין היתר. עם זאת, אלו הן ההשלכות של אירוע החמצון, והושקע מאמץ ניכר בפיתוח בדיקות טובות ספציפיות להידרופראוקסיד ליפידים.
בדיקה נפוצה אחת היא BODIPY 581/591 C11, שגם לה יש חסרונות שיש לקחת בחשבון. באופן ספציפי, צבע הפלואורסצנטי BODIPY 591/581 מציג שני שיאי פליטה, אחד במצבו המופחת (590 ננומטר) ואחד במצבו המחומצן (510 ננומטר). היחס בין הפלואורסצנטיות בשני אורכי גל אלה הוא בעל חשיבות מיוחדת אם המטרה היא כימות מדויק. עם זאת, עוצמת הפלואורסצנטיות של BODIPY 591/581 ננומטר הייתה בשימוש נרחב ברחבי הספרות 1,25,26,27,28, במיוחד כאשר העוצמה המופחתת של פליטה אדומה ב 510 ננומטר מוסווית לעתים קרובות על ידי זליגת הפלואורסצנטיות של המולקולה המחומצנת 22,29. זוהי אחת הסיבות העיקריות לכך שהפלואורסצנטיות של BODIPY 591/581 מיוצגת בדרך כלל בצורה איכותית כפונקציה של עוצמת פלואורסצנטיות יחידה (ירוקה).
מגבלה חשובה נוספת של בדיקה זו היא דיכוי הפלואורסצנטיות שלה על ידי נוגדי חמצון באופן תלוי ריכוז30. לכן, מכתים צריך להתבצע בתקשורת ללא תוספת נוגדי חמצון. בפרוטוקול הנוכחי, ferrostatin 1, נבלות רב עוצמה של hydroperoxides שומנים, שימש; עם זאת, לפני הוספת הגשושית הוסר פרוסטטין 1, והתאים נשטפו ב-PBS כך שהגשושית לא נחשפה לפעילות נוגדת החמצון שלה.
לגבי השראת פרופטוזיס, ניתן להשתמש בתרופות מסחריות רבות. כאן נעשה שימוש בארסטין, מעכב בלתי הפיך של טרנספורטר xCT31. בהתחשב בכך שהוא נקשר באופן קוולנטי לטרנספורטר, ניתן להשתמש בריכוזים גבוהים עוד יותר (עד 100 מיקרומטר) לפרק זמן קצר יותר (5 דקות), ואחריו שלבשטיפה 31. כדי להעריך את הקינטיקה המדויקת של פרופטוזיס עם עיכוב מוחלט של xCT, נעשה שימוש בתאי xCT-/- בהיעדר NAC. הצטברות מסיבית של הידרופרוקסידים ליפידים הייתה ניתנת לזיהוי לאחר 6 שעות, וכמעט לא ניתן היה לזהות תאים בני קיימא 24 שעות לאחר הזריעה. באשר ל-RSL3, גורם חזק מאוד לפרופטוזיס בתחום הננו-מולארי, הוא הציג קינטי דומה לזה שנצפה עם תאי xCT-/-. אופן פעולתו עדיין שנוי במחלוקת, אך נראה כי הוא אינו משפיע על הפעילות אלא גורם לפירוק האנזים GPx432,33.
היבט חשוב של השראת פרופטוזיס במבחנה הוא מפגש תאים. זה כבר זמן רב ציין כי שכבת התא confluent הוא הרבה יותר עמיד רעב ציסטאין, xCT או GPx4 עיכוב, דלדול GSH, וכו '34. הסיבה העיקרית שניתנה היא כי מגע פיזי, כלומר, מפגש, מוביל להפעלת מסלול היפופוטם, אשר, בתורו, מווסת את חילוף החומרים ואת הייצור הפנימי של מיני חמצן תגובתי (ROS). יתר על כן, המעבורת של ציסטאין מופחת יכולה גם לתרום להתנגדות לעיכוב xCT35 לא שלם. במחקר הנוכחי נעשה שימוש בריכוז של 1,00,000 תאים לבאר (צלחת 6 בארות) על מנת לשמור על מפגש נמוך עם תאים גדולים ושטוחים למדי. עם זאת, עם תאים קטנים יותר בצורת עגול, כגון HD-MB03, מספר זה יכול להיות מוגבר ל 1,50,000-2,00,000 תאים לכל באר (צלחת 6 באר).
המגבלה האחרונה של המחקר הנוכחי היא זיהוי מוות תאי בשיטת פרופידיום יודיד (PI). שיטה זו ידידותית למשתמש לזיהוי כל סוג של מוות תאי, וניתן להבדיל בין פרופטוזיס לבין סוגים אחרים של מוות תאי באמצעות מעכבי פרופטוזיס ספציפיים, כגון פרוסטטין-1. צביעת PI מבוססת על העובדה שתאים גוססים מאבדים את שלמות הממברנה, מה שמאפשר ל-PI לחדור לתאים, להצטלב בין בסיסי הדנ"א ולפלוט אות פלואורסצנטי. עם זאת, ראוי לציין כי הידרופרוקסידציה של שומנים גורמת ל"דליפה" של הממברנה, המאפשרת חדירה של PI עוד לפני שמתרחש מוות תאי. לפיכך, הערכת הקינטיקה של פרופטוזיס בהתבסס על שיטה זו בלבד היא מאתגרת.

פרופטוזיס (Ferroptosis) הוא סוג חדש של חמצן תגובתי (ROS) התלוי במוות תאי1. מלבד ROS, ברזל ממלא תפקיד מכריע בסוג זה של מוות תאי, ומכאן השם2. השלב האחרון והביצועי של פרופטוזיס הוא הצטברות ברזל של נזק חמצוני של שומנים בקרום הפלזמה שבסופו של דבר מוביל לפגיעה בשלמות הממברנה וחדירות סלקטיבית, ולבסוף, מוות תאי על ידי בעבוע. אירוע הידרופרוקסידציה של שומנים הוא תופעה טבעית; עם זאת, התפשטותו ברחבי קרום התא נמנעת על ידי ההגנה נוגדת החמצון של התא. השחקן העיקרי בהקשר זה הוא חלבון Se גלוטתיון פרוקסידאז 4 (GPx4), שיכול להתקרב לממברנה ולהמיר הידרופרוקסידים ליפידים לנגזרות האלכוהול הפחות רעילות שלהם3. כוח ההפחתה של GPx4 מסופק בעיקר, אך לא רק, על ידי גלוטתיון (GSH), טריפפטיד המורכב מחומצות אמינו לא חיוניות: גליצין, גלוטמט וציסטאין. חומצת האמינו המגבילה את קצב הביוסינתזה של GSH היא ציסטאין4. למרות ציסטאין מסווג כחומצת אמינו לא חיונית, הדרישות שלה יכול בקלות לחרוג הייצור הפנימי שלה בתאים שגשוג מאוד (כגון תאים סרטניים). לפיכך הוא סווג מחדש בקבוצה של חומצות אמינו חיוניות למחצה. היבוא הדרוש של ציסטאין מתרחש בעיקר באמצעות מערכת Xc, המאפשרת יבוא של צורה מחומצנת (דומיננטית) של ציסטאין (aka ציסטין) על חשבון ייצוא גלוטמט5. מערכת Xc מורכבת מתת-יחידת תעבורה תלוית Cl-עצמאית Na+, המכונה xCT, ומתת-יחידה מלווה, המכונה CD98. עד לאחרונה, התכונות האנטי-פרופטוטיות של ציר xCT-GSH-GPx4 נתפסו כייחודיות ובלתי ניתנות לשכפול6. עם זאת, בשנת 2019תואר מסלול אנטי-פרופטוטי חלופי, המורכב מיוביקווינול (קואנזים Q10) והאנזים הרגנרטיבי שלו - חלבון מדכא פרופטוזיס 1 (FSP1), 7,8. זמן קצר לאחר מכן, דווח על מערכת ניקוי רעלים נוספת של הידרופראוקסיד שומנים הכוללת GTP cyclohydrolase-1/tetrahydrobiopterin (GCH1/BH4)9. עם זאת, נראה כי תפקידו המרכזי של ציר xCT-GSH-GPx4 במניעת פרופטוזיס אינו מאותגר.
במהלך העשור האחרון, ferroptosis נחקר בהרחבה במגוון סוגי גידולים, מראה פוטנציאל גדול כאסטרטגיה אנטי סרטנית (נסקר על ידי Lei et al.10). יתר על כן, דווח כי תאים סרטניים המפגינים עמידות גבוהה לכימותרפיה קונבנציונלית ו / או נטייה לשלוח גרורות רגישים באופן מפתיע להשראת פרופטוזיס, כגון מעכבי GPx4 11,12,13. עם זאת, בהקשר של גידולי מוח, הפוטנציאל של גורמים פרופטוטיים נותר במידה רבה לא נחקר. בעוד שסוג זה של מוות תאי נקשר קשר קשר הדוק עם פגיעה באיסכמיה מוחית14ומחלות נוירודגנרטיביות15, הפוטנציאל שלו בהקשר של גידולי מוח הוגבל בעיקר לגליובלסטומה, הגידול הממאיר הממאיר ביותר (נסקר על ידי Zhuo et al.16). מצד שני, הרגישות של מדולובלסטומה, הגידול הממאיר השכיח ביותר במוח בילדים וגורם מוביל לתמותה בילדות, לגורמים לפרופטוזיס עדיין לא נחקרה במידה רבה. למיטב ידיעתנו, קיימת ספרות מועטה שעוברת ביקורת עמיתים המקשרת בין פרופטוזיס למדולובלסטומה. עם זאת, כמה מחקרים גילו כי ברזל ממלא תפקיד מכריע בהישרדות, התפשטות ופוטנציאל גידולי של תאי גזע סרטניים מדולובלסטומה וגליובלסטומה (CSC)17,18, מה שעלול להפוך אותם לפגיעים יותר להשראת פרופטוזיס. זה משמעותי במיוחד מכיוון שמדולובלסטומה ידועה לשמצה בתת-האוכלוסייה שלה של CSCs, או תאים יוזמים/מתפשטים של גידולים, שנראה כי הם אחראים במידה רבה לעמידות לכימותרפיה, הפצה והישנות19.
רגישות להשראת פרופטוזיס נחקרת בדרך כלל על ידי מדידת תכולת/הצטברות שומנים הידרופרוקסידים, אשר עשויה להוביל למוות תאי או לא. הגורמים הנפוצים ביותר להשראת פרופטוזיס הם (1) ארסטין, מעכב של טרנספורטר xCT20,(2) RSL3, מעכב של האנזים GPx42, ו/או (3) תורמי ברזל, כגון פרו-אמוניום ציטראט (FAC)21. תכולת הידרופרוקסיד שומנים מוערכת באמצעות הבדיקה הסלקטיבית BODIPY 581/591 C1122, שיש לה עירור ופליטה מקסימלית ב 581/591 ננומטר במצבו המופחת. עם אינטראקציה וחמצון על ידי הידרופרוקסידים ליפידים, הגשושית מעבירה את העירור והפליטה המקסימלית שלה ל 488/510 ננומטר. בדרך כלל, עלייה משמעותית בתכולת הידרופרוקסיד שומנים קודמת למוות של תאים פרופטוטיים. מכיוון שפרופטוזיס אינו מוות תאי מתוכנת, אין מפל איתות מולקולרי המוביל לביצועו. לכן, הדרך היחידה לאשר את זה היא לפקח על תוכן hydroperoxide שומנים ולהשתמש מעכבים ספציפיים עבור סוג זה של מוות התא, כגון ferrostatin 123. Ferrostatin 1 הוא נוגד חמצון ליפופילי שיכול לחדור את תא השומנים של התא ולסלק hydroperoxides שומנים, ובכך למנוע אירועים ferroptotic.

<table><tbody><tr><td>BODIPY 581/591 C11</td><td>תרמו פישר</td><td>D3861</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>בקמן</td><td>קולטר Z1</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בינוני&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>10569010</td><td></td></tr><tr><td>Erastin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7781-5MG</td><td></td></tr><tr><td>Ferroamminium ציטראט</td><td>Acros Organics</td><td>211842500</td><td></td></tr><tr><td>Ferrostatin-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SML0583-25MG</td><td></td></tr><tr><td>סרום בובין עוברי (FBS)</td><td>דומיניק דאצ'ר</td><td>500105N1N</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטר זרימה</td><td>BD Biosciences</td><td>מנגינה</td> <td>FACS</td></tr><tr><td>Gibco StemPro Accutase מגיב דיסוציאציה של תאים</td><td>תרמו פישר</td><td>11599686</td><td></td></tr><tr><td>N-אצטיל-ציסטאין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A7250</td><td></td></tr><tr><td>ערכת זיהוי מיקופלזמה PlasmoTest</td><td>InvivoGen</td><td>rep-PT1</td><td></td></tr><tr><td>פרופידיום יודיד</td><td>Invitrogen</td><td>P3566</td><td></td></tr><tr><td>RSL3</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>SML2234-25MG</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין - EDTA 10X - 100 מ"ל</td><td>דומיניק דאצ'ר</td><td>X0930-100</td><td></td></tr></tbody></table>

חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה

Revealing the Ferroptotic Phenotype of Medulloblastoma

האינטראקציה של ברזל וחמצן היא חלק בלתי נפרד מהתפתחות החיים על פני כדור הארץ. עם זאת, כימיה ייחודית זו ממשיכה לרתק ולתהות, ומובילה למיזמים ביולוגיים חדשים. בשנת 2012, קבוצה מאוניברסיטת קולומביה הכירה באינטראקציה זו כאירוע מרכזי המוביל לסוג חדש של מוות תאי מווסת בשם "פרופטוזיס". המאפיין העיקרי של פרופטוזיס הוא הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים עקב (1) הגנה נוגדת חמצון לא מתפקדת ו / או (2) עקה חמצונית מוחצת, אשר לרוב עולה בקנה אחד עם תוכן מוגבר של ברזל חופשי בתא. זה נמנע בדרך כלל על ידי הציר האנטי-פרופטוטי הקנוני הכולל את טרנספורטר הציסטין xCT, גלוטתיון (GSH) ו- GSH peroxidase 4 (GPx4). מכיוון שפרופטוזיס אינו סוג מתוכנת של מוות תאי, הוא אינו כרוך במסלולי איתות האופייניים לאפופטוזיס. הדרך הנפוצה ביותר להוכיח סוג זה של מוות תאי היא באמצעות נוגדי חמצון ליפופיליים (ויטמין E, ferrostatin-1, וכו ') כדי למנוע את זה. מולקולות אלה יכולות להתקרב ולסלק נזקי חמצון בקרום הפלזמה. היבט חשוב נוסף בחשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי הוא זיהוי הצטברות קודמת של הידרופרוקסידים ליפידים, שעבורם משתמשים בצבע הספציפי BODIPY C11. כתב היד הנוכחי יראה כיצד ניתן לגרום לפרופטוזיס בתאי מדולובלסטומה מסוג בר באמצעות השראות שונות: ארסטין, RSL3 ותורם ברזל. באופן דומה, ייעשה שימוש בתאי xCT-KO שגדלים בנוכחות NAC, ועוברים פרופטוזיס לאחר הסרת NAC. הפנוטיפ ה"מבעבע" האופייני נראה תחת מיקרוסקופ האור תוך 12-16 שעות מרגע הפעלת הפרופטוזיס. יתר על כן, ייעשה שימוש בצביעת BODIPY C11 ואחריה ניתוח FACS כדי להראות הצטברות של הידרופרוקסידים ליפידים ומוות תאים כתוצאה מכך באמצעות שיטת צביעת PI. כדי להוכיח את האופי הפרופטוטי של מוות תאי, ferrostatin-1 ישמש כסוכן ספציפי המונע פרופטוזיס.

קו תאי המדולובלסטומה DAOY תורבית בתווך DMEM סטנדרטי בתוספת 8% FBS עד שהגיע לכ-60% מפגש. ביום הניסוי נקצרו תאים, ו-1,00,000 תאים לבאר צופו בצלחות בנות 6 בארות, לפי טבלה 1. למחרת, תאים (בטריפליקט) טופלו ב-1 מיקרומטר של ארסטין, 0.3 מיקרומטר של RSL3, או 250 מיקרומטר של FAC. לאחר מכן הונחו הלוחות באינקובטור בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס ו-5% CO2. לאחר 6 שעות, תאים נצפו תחת המיקרוסקופ כדי לזהות תאים מבעבעים, כפי שמצוין על-ידי החיצים באיור 1. זה שימש אינדיקטור לכך שהתרופה הייתה יעילה בגרימת פרופטוזיס לפני שהתאים הוכנו לצביעת הידרופראוקסיד שומנים וניתוח FACS לאחר מכן.
לזיהוי תכולת הידרופרוקסיד שומנים, נעשה שימוש בצבע הספציפי BODIPY 581/591 C11 בריכוז סופי של 2 מיקרומטר למשך 30 דקות. מכיוון שצבע זה רגיש לחמצון-חיזור, היה צורך להסיר כל טיפול מהתאים ולשטוף אותם עם PBS שחומם מראש. לאחר חצי שעה של צביעה, התאים נשטפו פעמיים עם PBS, נותקו באמצעות תמיסת ניתוק התא, והוכנו לניתוח FACS. נתונים שהתקבלו בשלב זה הראו פלואורסצנטיות ירוקה מוגברת של הצבע בדגימות שטופלו בכל שלוש התרופות (איור 2). אולם ההשפעה החזקה ביותר נצפתה עם 0.3 מיקרומטר של RSL3 (איור 2B), בעוד ש-1 מיקרומטר של ארסטין (איור 2A) ו-250 מיקרומטר של FAC (איור 2C) הראו השפעה מעט פחותה לאחר 6 שעות של טיפול.
כדי לקבוע שהצטברות השומנים ההידרופרוקסידים שזוהתה מובילה למוות תאי, במיוחד פרופטוזיס, אותם טיפולים המתוארים בטבלה 1 יושמו במשך 24 שעות. לצורך ניתוח תאים מתים על ידי ציטומטריית זרימה, הן התאים והן הסופרנטנט נקצרו. התאים החיים והמתים נפלטו על ידי צנטריפוגה ולאחר מכן הושעו מחדש במאגר FACS לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה עוקבת. הנתונים המוצגים באיור 3 הראו כי כל שלושת הטיפולים גרמו למוות תאי מסיבי, אשר נמנע לחלוטין על ידי שימוש במעכב הספציפי לפרופטוזיס, פרוסטטין-1. זה תומך בבירור בהתרחשות של מוות תאי פרופטוטי על עיכוב xCT, עיכוב GPx4, או עומס ברזל בתאי מדולובלסטומה.
בהתחשב בכך ששלוש התרופות הראו השפעות שונות במקצת על הצטברות שומנים הידרופרוקסידים, ככל הנראה בשל הבדלים בעוצמה, נעשה שימוש בגישה גנטית כדי לחקור את מלוא העוצמה של הגורמים הפרופטוטיים. תאי DAOY xCT-/- שהתקבלו בעבר (איור משלים 1A) גודלו בתרבית באותה מדיה כמו עמיתיהם ב-WT, אולם עם תוספת NAC. ברירה חיובית זו אפשרה לתאי xCT-/- לגדול בתרבית. אולם 6 שעות לאחר ש-NAC הוסר מתרבית, תאים החלו לצבור הידרופרוקסידים ליפידים באותה רמה כמו תאי WT שטופלו ב-RSL3 (איור 4). בדומה לעיכוב פרמקולוגי, סילוק NAC מהמדיה גרם לבעבוע אופייני של תאי xCT-/- לאחר 6 שעות (איור משלים 1B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig01.jpg"> איור 1: פנוטיפ פרופטוטי של תאי מדולובלסטומה. מיקרוגרפים מייצגים של תאי DAOY WT שטופלו (או לא) במשך 6 שעות עם 1 מיקרומטר של ארסטין (ERA), 0.3 מיקרומטר של RSL3 או 250 מיקרומטר של פרואמוניום ציטראט (FAC) בנוכחות או לא של 2 מיקרומטר מעכב פרופטוזיס Ferrostatin-1 (Ferro-1). חיצים לבנים מציינים תאים עגולים, "מבעבעים", המציינים פנוטיפ פרופטוטי הנראה במיקרוסקופ אור. הגדלה: פי 20, תוספות: פי 40. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר, כניסה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig02.jpg"> איור 2: הידרופראוקסיד ליפידי כסמן העיקרי של פרופטוזיס בתאי מדולובלסטומה. נתונים מייצגים של צביעת הידרופראוקסיד שומנים על ידי ציטומטריית זרימה בתאים שטופלו במשך 6 שעות עם (A,B) 1 מיקרומטר של ארסטין (ERA), (C,D) 0.3 מיקרומטר של RSL3, או (E,F) 250 מיקרומטר של פרואמוניום ציטראט (FAC), בנוכחות או לא של 2 מיקרומטר מעכב פרופטוזיס Ferrostatin-1 (Ferro-1). (א,ג,ה) עלילות נקודה של האירועים המתועדים; (ב,ד,ו) ייצוג היסטוגרמה של תכולת הידרופרוקסיד השומנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig03.jpg"> איור 3: השראת מוות של תאים פרופטוטיים בגישה פרמקולוגית. תרשים נקודות ציטומטריה של זרימה מייצגת של תאים מוכתמים ביודיד פרופידיום לאחר 6 שעות של טיפול עם 1 מיקרומטר של ארסטין (ERA), 0.3 מיקרומטר של RSL3, או 250 מיקרומטר של פרואמוניום ציטראט (FAC), בנוכחות או לא של 2 מיקרומטר מעכב פרופטוזיס Ferrostatin-1 (Ferro-1). גאטינג מפריד בין אוכלוסיות חיות (Q4) ומתות (Q3) של התאים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66645/66645fig04.jpg"> איור 4: השראת פרופטוזיס בגישה גנטית. נתונים מייצגים של צביעת הידרופראוקסיד שומנים על ידי ציטומטריית זרימה בתאי DAOY WT ו- xCT-/- לאחר 6 שעות בנוכחות או לא של מעכב פרופטוזיס 2 מיקרומטר Ferrostatin-1 (Ferro-1). משמאל ייצוג ההיסטוגרמה של תכולת הידרופרוקסיד השומנים. מימין נמצאות חלקות הנקודות של האירועים המתועדים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/66645fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>צלחת I</td>
			<td>CTL I</td>
			<td>CTL II</td>
			<td>CTL III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 מיקרומטר ארסטין I</td>
			<td>1 מיקרומטר ארסטין II</td>
			<td>1 מיקרומטר ארסטין III</td>
		</tr><tr><td>צלחת II</td>
			<td>0.3 מיקרומטר RSL3 I</td>
			<td>0.3 מיקרומטר RSL3 II</td>
			<td>0.3 מיקרומטר RSL3 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 מיקרומטר FAC I</td>
			<td>250 מיקרומטר FAC II</td>
			<td>250 מיקרומטר FAC III</td>
		</tr><tr><td>צלחת III</td>
			<td>2 מיקרומטר Ferro-1 I</td>
			<td>2 מיקרומטר Ferro-1 II</td>
			<td>2 מיקרומטר Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>1 מטר ארסטין + 2 מטר Ferro-1 I</td>
			<td>1 מטר ארסטין + 2 מטר Ferro-1 II</td>
			<td>1 מטר ארסטין + 2 מטר Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td>צלחת IV</td>
			<td>0.3 מטר RSL3 + 2 מטר Ferro-1 I</td>
			<td>0.3 מטר RSL3 + 2 מטר Ferro-1 II</td>
			<td>0.3 מטר RSL3 + 2 מטר Ferro-1 III</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>250 מטר FAC + 2 מטר Ferro-1 I</td>
			<td>250 מטר FAC + 2 מטר Ferro-1 II</td>
			<td>250 מטר FAC + 2 מטר Ferro-1 III</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: פרטי הטיפול של תאי הבקרה והניסוי.
איור משלים 1: מוות של תאים פרופטוטיים של תאי DAOY xCT-/- . (A) ניתוח כתם מערבי של רמת xCT בתאי DAOY WT ו-xCT-/- במדיית DMEM בתוספת או לא עם 2 מיקרומטר של Ferrostatin-1. (B) מיקרוגרפים מייצגים של תאי DAOY xCT-/- בנוכחות (משמאל) ובהיעדר (מימין) של 1mM N-אצטיל-ציסטאין למשך 6 שעות. חיצים לבנים מציינים תאים עגולים, "מבעבעים", המציינים פנוטיפ פרופטוטי הנראה במיקרוסקופ אור. הגדלה: פי 40. פסי קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66645/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

תכולת הידרופרוקסיד שומנים מייצגת את האינדיקטור הנפוץ ביותר למוות של תאים פרופטוטיים. מאמר זה מדגים את ניתוח ציטומטריית הזרימה שלב אחר שלב של תכולת הידרופראוקסיד שומנים בתאים עם השראת פרופטוזיס.

The interaction of iron and oxygen is an integral part of the development of life on Earth. Nonetheless, this unique chemistry continues to fascinate and ...

המטרה הסופית של המחקר שלנו היא לפתח טיפולים חדשים לסרטן ילדים כגון מיובלסטומה. לשם כך, הצוות שלנו מפתח מערכות מודל חדשות המדגישות את הרקע הגנטי של המחלה, כמו גם ניצול אפיקים טיפוליים חדשים. בשנים האחרונות, גנומיקה של תא בודד חשפה כיצד מחויבות שושלת לקויה משפיעה על התוצאות הקליניות של סרטן ילדים, כמו גם על התגובה לטיפולים, ובסופו של דבר על התפתחות אוכלוסיות תאים עמידים לטיפול בתוך הגידול.נראה כי הספקטרום של מצב מובחן של אב עצבי עומד בבסיס התוצאה הקלינית של סרטן ילדים. האתגרים העיקריים הם להבין את האבות הידועים מאוד או הלא מספיק פלסטיים בתוך הגידולים, כמו גם לפתח טיפולים חדשים יעילים יותר ומזיקים פחות למחלות אלה. מנקודת מבט זו, המחקר שלנו על ferroptosis נראה מבטיח מאוד.תלות בברזל היא אחת מנקודות התורפה העיקריות של תאים סרטניים, הידועים גם בשם תאי גזע סרטניים, כל המרכיב החיוני. ברזל הוא חרב פיפיות מכיוון שתגובתו עם מיני חמצן תגובתי יכולה להוביל לסוג מסוים של מוות תאי, הנקרא פרופטוזיס. הנתונים שלנו הראו בבירור כי ferroptosis הוא פוטנציאל גדול נגד סוג זה של תאים סרטניים.

revealing-the-ferroptotic-phenotype-of-medulloblastoma

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד, העשרה, ותחזוקה של הגידול מדולובלסטומה בתאי גזע שמקורם בעכברים מוטנטים עם פעילות חוץ רחמי מסלול סוניק הקיפוד.

, בידוד והעשרה, ותחזוקה של גזע תאים מדולובלסטומה

פרוטוקול זה מתאר את הבידוד דיסוציאציה של רקמת מדולובלסטומה העכבר, לאחר מכן allografting של תאים סרטניים לעכברים הנמען immunocompromised כדי ליזום מדולובלסטומה משנית.

Allografting orthotopic תוך גולגולתי של תאים מדולובלסטומה ב עכברים immunocompromised

כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל ורב-תכליתי להשראה, ניטור וניתוח גליובלסטומה חדשה (GBM) באמצעות DNA טרנספוזון המוזרק לחדרים של עכברים יילודים. תאים של האזור התת-חדרי, התופסים את הפלסמיד, הופכים, מתרבים ומייצרים גידולים בעלי מאפיינים היסטו-פתולוגיים של GBM אנושי.

Transposon מתווך האינטגרציה של פלסמיד דנ&quot;א לתוך אזור Subventricular של עכברים בילוד ליצירת מודלים חדשניים של גליובלסטומה

מוצג כאן פרוטוקול לביצוע מניפולציה גנטית במוח החמוס העוברי באמצעות באלקטרואידיות הרחם. שיטה זו מאפשרת מיקוד של תאי האבות העצביים בneocortex ב vivo.

ב Vivo מיקוד של תאי הצבי העצבי Neocortex חמוס על ידי באלקטרופורציה ברחם

תוך שימוש באלקטרופורציה של ovo , פיתחנו שיטה לטרנספציה סלקטיבית של האוזן הפנימית השמיעתית וגרעין השבלול בעוברי עוף כדי להשיג פגיעה ספציפית לקבוצת התאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במהלך תקופות בדידות של הרכבת מעגלים.

ניתוח תפקוד אוטונומי של תאים של חלבון פיגור שכלי X שביר במעגל שמיעתי על ידי אלקטרופורציה של In Ovo

שיטות המאפשרות אפיון ובידוד של אוכלוסיות תאי גזע מדגימות ביולוגיות הן קריטיות לקידום טיפולים מוכווני תאי גזע בסרטן ומעבר לו. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד תאי גזע סרטניים באמצעות פנוטיפ האוכלוסייה בצד מופעלות בצד.

רתימת DNA- מופעלות בצד האוכלוסייה פנוטיפ לזהות ולטהר תאי גזע סרטניים מ דוגמאות ביולוגיות

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנצל מונחה אולטרה סאונד הזרקה של נוירובלסטומה (NB) ותאים של יואינג סרקומה (ES) (שהוקמה שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה) באתרים הרלוונטיים ביולוגית ליצירת במודלים פרה אמין עבור סרטן מחקר.

ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבודד תאים סרטניים בשד אפופטוטיים להיפגע על-ידי תא לפעיל על-ידי קרינה פלואורסצנטית מיון ולגלות עוד יותר את המעבר של תאים שאינם-גזע סרטניים בשד השד תאים סרטניים, כמו בתאי גזע לאחר היפוך אפופטוזיס מאת cytometry זרימה.

גילוי Cytometric זרימה של תאים, כמו תאי גזע סרטניים בשד החדשה לאחר היפוך אפופטוזיס

פרוטוקול זה מתאר שיטה מהירה לייצר בו תרבויות מלנוציט ופיברובלסט מן העור של 0-4 העכברים הישנים של היום. התרבויות העיקריות הללו ניתן לשמור ומניפולציות בתוך מבחנה כדי ללמוד מגוון של תהליכים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית, כולל ביולוגיה של תאי העור, פיגמנטציה, ריפוי פצעים ומלנומה.

הדור המהיר של משפחת מלנוציט הראשית והתרבויות בפיברובלסט

במאמר זה, הצגנו מערכת של שיטות מעשיות ושימושיות לאפיון מוטציות הקשורות למחלות של משפחת חיל-החוץ, הכוללים בתוך שיטת ההפעלה המבחנה, שיתוף הפעולה של החיל המלכותי הבריטי, ובחינה משלימה של פיצול לוציפראז.

אפיון מוטציות הקשורות למחלות של חיל המשפחה באמצעות קבוצה של שיטות מעשיות ושימושיות

חקור את תהליך הפרופטוזה במדולובלסטומה באמצעות ניתוח גנומיקה של תא בודד וציטומטריית זרימה. שיטה זו מאפשרת לזהות אוכלוסיות תאים עמידות לטיפול ולפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לסרטן ילדים.

חשיפת הפנוטיפ הפרופטוטי של מדולובלסטומה

גלה סרטונים נוספים