אבחון מבוסס קריספר נקודתי עם ריאגנטים מעורבבים מראש ומיובשים בהקפאה
16 באוגוסט 2024
כאן, אנו מציגים את ההכנה שלב אחר שלב של הגברה איזותרמית מבוססת רקומבינאז מעורבבת מראש, ליופילית ותגובות מבוססות Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR), אשר ניתן להשתמש בהן לזיהוי סמנים ביולוגיים של חומצות גרעין של פתוגנים של מחלות זיהומיות או סמנים גנטיים אחרים בעלי עניין.
אנחנו מפתחים בדיקה נקודתית לגילוי החומרים האלה של מחלות זיהומיות. בדיקה זו משתמשת בהגברה איזותרמית של חומצות גרעין ובזיהוי מבוסס קריספר. עם דיוק אוסמוטי גבוה הדומה ל- PCR, הם יכולים לזהות הבדלי רצפים קטנים כולל פולימורפיזם נוקלאוטיד יחיד ויכולים להיות כפולות.
CRISPR, התגובות האוסמוטיות מכילות רכיבים ושלבים מרובים וקשה לבצע אותן בנקודת הטיפול. מכיוון שהאוסמוטיקה מבוססת קריספר, היא רגישה מאוד, קיים סיכון לזיהום שאריות שעלול להוביל לתוצאות שגויות. למרבה המזל, בעיה זו יכולה להיות מופחתת אם אנו לפשט את ההליכים של התגובות.
אנו מציעים שיטה קלה לשימוש לזיהוי פתוגנים וסמנים גנטיים של המחלה שלנו באמצעות הגברה איזותרמית רקומבינאז וריאגנטים מבוססי קריספר. ריאגנטים אלה פשוטים לאחסון ולשימוש. אנו מציעים גם עצות לפתרון בעיות נפוצות בעת שימוש בשיטות ובריאגנטים אלה, כדי להקל על אנשים להשתמש בהם.
הפרוטוקול כאן משתמש בריאגנטים CRISPR, אשר להקל על הובלה ואחסון. ריאגנטים מיובשים בהקפאה יכולים בקלות להתייבש מחדש בנקודות השימוש ולשמור על יעילות הגברה וזיהוי גבוהה. אנו מקווים ליישם טכנולוגיות אבחון CRISPR כדי לזהות מחלות זיהומיות אנדמיות ומתפתחות.
אם ניתן לבצע בדיקה זו באופן שגרתי ונכון בנקודת הטיפול, זה יכול ליידע אפשרויות טיפול אנטי-ויראליות ואנטיביוטיות, עשוי להציל חיים, להפחית שימוש יתר בתרופות ופיתוח עמידות.
סקירה כללית
מאמר זה מציג שיטה לפיתוח בדיקות בנקודת הטיפול (point-of-care) המשתמשות בהגברה איזותרמית של חומצות גרעיניות ובזיהוי מבוסס CRISPR לצורך זיהוי חומר גנטי של מחלות זיהומיות. גישה זו שואפת להגביר את הרגישות והדיוק תוך התגבשות על פתרונות לאתגרים כגון סיכוני זיהום.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אבחון מחלות זיהומיות
- טכניקות להגברת חומצות גרעיניות
- טכנולוגיית CRISPR
רקע
- בדיקות בנקודת הטיפול (Point-of-care) הן חיוניות לאבחון מהיר של מחלות זיהומיות.
- הגברה איזותרמית מאפשרת זיהוי יעיל של חומצות גרעיניות.
- טכנולוגיית CRISPR מציעה רגישות גבוהה לזיהוי חומר גנטי.
- סיכוני זיהום עלולים להוביל לתוצאות שגויות במערכי בדיקה רגישים.
מטרת המחקר
- פיתוח פרוצדורה מפושטת לתגובות מבוססות CRISPR.
- שיפור הדיוק בזיהוי וריאציות גנטיות קטנות.
- הפחתת סיכוני זיהום בסביבות בדיקה בנקודת הטיפול (point-of-care).
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנה של ריאגנטים ליאופיליזציה בערבוב מוקדם להגברה איזותרמית.
- יישום של שיטות זיהוי מבוססות CRISPR.
- הערכת רגישות וספציפיות בזיהוי ביומרקרים של חומצות גרעיניות.
- אופטימיזציה של תנאי התגובה להפחתת סיכוני זיהום.
תוצאות עיקריות
- השיטה שפותחה הדגימה רגישות גבוהה לזיהוי סמנים גנטיים.
- סיכוני זיהום הופחתו באופן משמעותי באמצעות פישוט הפרוטוקול.
- התוצאות היו דומות לאלו של שיטות PCR מסורתיות.
- הגישה מתאימה ליישומים של בדיקות במקום הטיפול (point-of-care).
מסקנות
- מחקר זה מציג שיטה ישימה לזיהוי מהיר של פתוגנים של מחלות זיהומיות.
- ניתן לפשט ביעילות בדיקות המבוססות על CRISPR לשימוש מעשי.
- עבודות עתידיות עשויות להתמקד בשיפור נוסף של חסון הבדיקות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ריאגנטים לאבחון מבוסס CRISPR, המועמדים לערבוב מוקדם ולייבוש בהקפאה, מאפשרים זיהוי מהיר ומדויק של סממנים גנטיים של מחלות זיהומיות בנקודת הטיפול, ובכך פותרים צווארי בקבוק תפעוליים בבדיקות מבוזרות. גישה זו מפחיתה את מורכבות הטיפול הידני ואת הסיכון לזיהום, ותומכת בפריסה רחבה בסביבות שטח ובמקומות עם משאבים מוגבלים. השיטה מגבירה את הביטחון החזוי להתערבות מוקדמת ומסייעת בקבלת החלטות טיפוליות בזמן אמת.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח ביו-פרמצבטיים
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה מהירה של סממנים גנטיים של פתוגנים לצורך תיקוף מטרות במחקר של מחלות זיהומיות.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי אספקת זיהוי ברגישות גבוהה של פולימורפיזם של נוקלאוטיד בודד (SNP).
- מסייע במיון תיקי פיתוח על ידי הבחנה בין זנים של פתוגנים בעלי קשר הדוק.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק מערכות ריאגנטים מאושרות ומוכנות לשימוש עבור תהליכי עבודה יעילים בפיתוח בדיקות (assays).
- משפר את השחזוריות והסטנדרטיזציה של הבדיקה באמצעות פורמטים ליאופיליים (lyophilized) מעורבבים מראש.
- מאפשר סריקה ניתנת להרחבה (scalable) של דגימות קליניות או סביבתיות במינימום ציוד.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מתיישב עם אסטרטגיות של ביומרקרים תרגומיים על ידי מתן אפשרות לגילוי חתימות של חומצות גרעין הרלוונטיות למחלה.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני באמצעות אספקת אמצעי אבחון חסונים הניתנים לפריסה בשטח.
- מפחית סיכונים בקידום מועמדים לאבחון על ידי הדגמת היציבות והיעילות של הריאגנטים.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד (Pipeline)
שיטה זו משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד למחקר תרגומי, ותומכת בתהליכי עבודה החל מזיהוי מטרה ועד לתיקוף פרה-קליני של פלטפורמות אבחוניות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת זיהוי ברמת ביטחון גבוהה של מטרות גנטיות לצורך בדיקת היפותזות ומחקרים מכניסטיים.
- סריקה: מציעה פלטים כמותיים וסטנדרטיים להשוואת תנאי דגימה וביצועי בדיקה.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות רגישות מבוססות פלואורסצנציה לצורך ניתוח נתונים חסון ותמיכה בקבלת החלטות.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין יישומים במעבדה ובשטח, ותומכת בפיתוח אבחנתי מונחה-ביומארקרים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבססת פלטפורמת ריאגנטים לשימוש חוזר, הניתנת להתאמה למגוון מטרות של פתוגנים ולסוגי דגימות שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות בזיהוי פתוגנים.
- ערך תפעולי: מפשט תהליכי עבודה, משפר את השחזוריות ותומך בלוגיסטיקה שאינה תלויה בשרשרת קירור.
- ערך אסטרטגי: מאיץ קבלת החלטות מסוג go/no-go עבור מועמדים לאבחון ומפחית סיכונים בשלבים מאוחרים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של נכסי אבחון עבור מחלות מתפרצות ואנדמיות, תוך התאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בהגברה של חומצות גרעיניות ובתכנון בדיקות מבוססות CRISPR.
- נדרשת גישה לציוד ליופיליזציה ולקוראי לוחות מיקרו-פלוורסצנציה לביצוע מלא של תהליך העבודה.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת ריאגנטים וטיפול בהם.
- ניתן להתאמה לסוגי דגימות שונים, אך עשוי לדרוש אופטימיזציה עבור פתוגנים ספציפיים.
- היציבות והיעילות תוקפו למשך שמונה חודשים לפחות ב-20°C-, מה שמאפשר פריסה ממושכת.
שאלות נפוצות בביו-פארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:19
Preparation of Lyophilized Reverse Transcriptase‐Recombinase Polymerase Amplification (RT‐RPA) Reactions
5:02
Preparation of Lyophilized CRISPR‐Cas13a Premixed Detection Reagents for Nucleic Acid Biomarkers Detection
7:45
RT‐RPA Nucleic Acid Amplification and CRISPR‐Cas13 Nucleic Acid Detection
