Name: תרבית פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה של עכבר לטווח ארוך כפלטפורמה לאימות השתלת תאים בפגיעה בחוט השדרה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-12T14:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: למד שיטה לטיפוח פרוסות אורגנוטיפיות של חוט שדרה עכבר לטווח ארוך עם השתלת תאי גזע עצביים. פלטפורמה זו מאפשרת הערכת יעילות טיפולי החלפת תאים בפגיעות חוט השדרה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחקר נתמך על ידי קרן Wings for Life (WFL-IT- 20/21), תוכנית ההתאוששות והחוסן הלאומית של האיחוד האירופי מהדור הבא (NRRP)-משימה 4 רכיב 2, השקעה n. 1.4-CUP N. B83C22003930001 (Tuscany Health Ecosystem-THE, Spoke 8), ומרינה רומולי אונלוס. כתב יד זה משקף רק את השקפותיהם ודעותיהם של המחברים, לא האיחוד האירופי ולא הנציבות האירופית יכולים להיחשב אחראים להם. נתונים ומטה-נתונים זמינים ב-Zenodo 10.5281/zenodo.10433147. התמונות נוצרו באמצעות Biorender https://www.biorender.com/.

השתלה ארוכת טווח של תאי h-SC-NES בתרביות אורגנוטיפיות של חוט השדרה

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

עדיין אין טיפול יעיל לחולים עם SCI. גישות שונות נבדקו ואחת המבטיחות ביותר מבוססת על החלפת תאי אסטרטגיה רגנרטיבית. כיום, ההתקדמות בתחום הרפואה הרגנרטיבית מבקשת פלטפורמות חדשניות לבדיקת היעילות והבטיחות של השתלות תאים, לבד או בשילוב עם גישות אחרות. האימות הפרה-קליני שלהם חיוני כדי להמשיך במחקרים קליניים נוספים. תרביות אורגנוטיפיות של SC הן פלטפורמה שימושית לחקר היבטים שונים של ניוון עצבי, התחדשות עצבית והתפתחות עצבית, ולחקירת יעילותן של גישות טיפוליות חדשניות23. בפרט, מאפיינים ספציפיים של תרבויות אורגנוטיפיות כגון שמירה על היסטוארכיטקטורה מקורית והרכב תאים ומיקרו-סביבה הם יתרון לפענוח דינמיקת השתלות, כגון קליטת תאים, אינטגרציה, התמיינות והתבגרות.
באופן עקבי עם פרוטוקולים שפורסמו, פרוסות אורגנוטיפיות SC יכולות להישמר בתרבית במשך כ 2-3 שבועות בתנאים בריאים, מה שמגביל את השימוש בהן לחקירות ארוכות טווח וסינון פונקציונלי הנדרש לתוכניות בדיקה של טיפול תאי. חקירת תהליכים חשובים כגון התמיינות והבשלה לקראת גורלם הנכון של תאים מושתלים בתוך רקמת SC דורשת ניטור ארוך טווח. תהליכים תאיים אלה הם קריטיים במהלך השתלות נפוצות במודלים של בעלי חיים. הזמינות של מערכת ex vivo המחקה תכונות רבות הקיימות in vivo תהיה מועילה בשלב הסינון הפרה-קליני.
מסיבה זו, בעבודה זו, אנו מציעים שיטת תרבות אורגנוטיפית אופטימלית לטווח ארוך (≥30 יום) SC המאפשרת לשמור על פרוסות SC קיימא עד 90 יום, תוך שילוש מסגרת הזמן הרגילה שלהם בתרבית. יתר על כן, אנו מראים קליטה יציבה של תאי h-SC-NES בתוך פרוסות SC ושמירה על תרבית ההשתלה למשך עד 30 יום. עקבנו אחר קליטת התאים לאורך זמן על ידי התבוננות בביטוי GFP כדי לאמת את הישרדות התאים עד DPT 30. לאחר 30 DPT, הערכנו את קצב אפופטוזיס התא. בספרות, הערכה של אפופטוזיס של תאי h-SC-NES מושתלים בפרוסות SC ב 7 DPT דווח40. כאן, הרחבנו את ניתוח אפופטוזיס התא ב- DPT 30 כדי להשוות את קצב האפופטוטי ביחס לנקודת הזמן הקודמת (DPT 7). גילינו שהנתונים שלנו עולים בקנה אחד עם הספרות, מה שמצביע על כך שתאי h-SC-NES מושתלים שורדים גם בנקודת זמן מאוחרת יותר אם הם נשמרים בתנאי התרבית האופטימליים בעבודתנו. פלטפורמת ex vivo משופרת זו לטווח ארוך לבדה ובתצורת ההשתלה תסייע לחוקרים בבדיקות פרה-קליניות להשתלות מבוססות תאי גזע עבור SCI. זה יאפשר להם לזהות את המועמד הטוב ביותר לתאים למחקרי in vivo נוספים המקדמים את הצלחת ההשתלות. יתר על כן, לאחר סינון ראשוני, פרוסות אורגנוטיפיות SC יכולות לשמש גם במקביל למחקרי in vivo כדי לאשר ולאמת דינמיקה תאית ארוכת טווח והתנהגויות שנצפו במודלים של בעלי חיים או לתמוך במחקרים מכניסטיים.
הפרוטוקול שלנו מתאר בפירוט כיצד ליצור מודל אורגנוטיפי ארוך טווח זה, אך יש לדון גם בכמה צעדים קריטיים. לגבי הדור של תרבויות אורגנוטיפיות SC, ישנם כמה אתגרים במהלך הניתוח ואת השלבים הראשונים של התרבות. הליך ניתוח המבוצע היטב חיוני ליצירת פרוסות השומרות על ההיסטוארכיטקטורה המקורית. אם SC נהרס במהלך הבידוד, פרוסות יכולות לאבד את המבנה האנטומי האופייני שלהן ונזק לרקמות יכול לגרום לעלבון פרו-דלקתי מוגזם המוביל לתנאים לא בריאים ומוות תאי. השלב המאתגר ביותר במהלך הניתוח הוא עקירת ה-SC מעמוד השדרה והסרת קרומי המוח מה-SC המבודד. ההצלחה של צעדים אלה תלויה בניסיון של המפעיל; לכן, מומלץ תקופת הכשרה לפני תחילת הניסויים.
חתך קורונלי של SC באמצעות מסוק הוא גם שלב מאתגר. את ה-SC המבודד יש למקם על סיפון החיתוך בדיוק בניצב ללהב. המפעיל צריך גם למקם את הלהב בניצב לסיפון החיתוך. אמצעי זהירות אלה נחוצים כדי להבטיח את הדור של פרוסות לשחזור בין ניסויים זהים ושונים. נושא חשוב נוסף הוא שזמן הניתוח מוגבל: כל הליך יצירת הפרוסה חייב להימשך ~30 דקות. אם המפעיל משקיע זמן רב יותר בניתוח וחיתוך, רקמת SC תסבול וזה יכול לפגוע בהצלחת התרבית ובשלבים הבאים של הניסוי.
לאחר שמניחים פרוסות על קרום התרבית, חשוב להאכיל אותן נכון. GDNF נחוץ כדי לשמור על התאוששות רקמות והישרדות. חיתוך עם מסוק הוא טראומטי עבור הרקמה, ומסיבה זו, פרוסות ממוקמות זמן קצר לאחר החיתוך לתוך מדיום דיסקציה קר כקרח כדי לנקות את עודף של מולקולות פרו דלקתיות ומעודדות מוות. לאחר מכן, פרוסות מונחות על קרומי התרבית (תוספות תרבית תאים) עם מדיום טרי שונה עם GDNF כדי לקדם התאוששות מהירה יותר הידבקות פרוסה לממברנה. GDNF צריך להתווסף למדיום כל יום בשבוע הראשון בתרבות בגלל מחצית החיים הקצרה שלו50,51. ראינו כי פרוסות זקוקות לנוכחות רציפה של GDNF במהלך הימים הראשונים בתרבית כדי לקדם התאוששות רקמות וכדאיות. בכל מקרה, מכיוון שנוכחות GDNF חשובה לכל תקופת הטיפוח, מומלץ מאוד להפריע לניהול GDNF בנקודות זמן נוספות.
במהלך השבוע הראשון בתרבית, חשוב גם לבדוק את הפרוסות באופן מקרוסקופי בעין ובמיקרוסקופ. רקמה שקופה ושקיפות של הגבולות הם סימנים להידבקות נכונה של הפרוסות לממברנה ולרקמה בת קיימא. הרקמה הנמקית תיראה לבנה מאוד במבט מאקרוסקופי ראשון והאזורים הנמקיים ייראו אפורים כהים במיקרוסקופ. לאחר מספר שבועות בתרבית, המורפולוגיה של הרקמה עשויה להשתנות: תנועות התאים והיצמדות הרקמה לממברנה יכולות להשפיע על תהליך זה. ראינו, למשל, את אובדן הלומן המרכזי בכמה פרוסות מלאות תאים ואת אובדן המורפולוגיה של הקרן הגבית והגחון. זה קורה בעיקר עם פרוסות קטנות יותר, בעוד רובם ישמרו על מבנה אנטומי קרוב למקור. פרוסות נוצרות בדרך כלל מאזורי המותניים או החזה מכיוון שבדרך זו הם יכולים לקבל את הגודל המתאים כדי לשמור על ההיסטוארכיטקטורה המקורית שלהם לאורך זמן: אם הם קטנים מדי, הם מאבדים את הארכיטקטורה שלהם בעוד שאם גדולים מדי, האזור המרכזי יכול לעבור נמק. לכן, השתמשנו באזור המותני של גורי עכברים כדי ליצור פרוסות בגודל המתאים לגידול אופטימלי לטווח ארוך, אבל, באופן עקרוני, ניתן לשקול מקטעים אחרים. יתר על כן, בחרנו להשתמש באזור המותני, מכיוון שאזורי הגחון והגב נבדלים יותר זה מזה. בנוסף, אזור זה מציג אזורי רקמה עם אחוז גבוה יותר של נוירונים מוטוריים וחומר אפור, שהם אתרי עניין לטיפולים בתחליפי תאים ב- SCI. לגבי השתלת תאים בפרוסות, הבעיה העיקרית קשורה לשבירת קצה מיקרו-מחט הזכוכית. אם החור למעבר התאים גדול מדי, הוא עלול לגרום נזק לרקמת SC במהלך המיקרו-הזרקה. אם הוא קטן מדי, ערימת תאים יכולה לחסום את המחט, ולעכב את תהליך ההשתלה. הליך ההשתלה צריך להסתיים בתוך 1 שעה כדי למזער סבל תאים ומוות.
הפרוטוקול המוצע מספק כלי אופטימלי ורב-תכליתי לסוגים שונים של חקירות. כאן, אנו מיישמים את הפלטפורמה ארוכת הטווח שלנו כדי לאמת את ההשתלה של תאי h-SC-NES בשלבים הראשונים של התמיינות בתוך רקמת SC של עכבר למשך 30 יום. החידוש העיקרי של הגישה המוצעת הוא אופטימיזציה של פרוטוקול התרבות המשותפת. מרכיבי GM שומרים על הישרדות עצבית ארוכת טווח של פרוסות SC ותאי h-SC-NES המושתלים. ואכן, GM, בהיותו מדיום נטול סרום, מקיים את התמיינות התאים המושתלים לעבר הגורל העצבי ביחס למדיום ששימש בעבר לתרבית פרוסות אורגנוטיפית47.
לגבי המודלים המוצעים עבור SCI, ניסויים מבוצעים בדרך כלל על עכברים בוגרים. עד כה, ההבדלים החשובים ביותר בין SC יילודים ובוגרים קשורים לפוטנציאל ההתחדשות הגבוה יותר שנמצא בילוד ביחס לעכברים בוגרים52. עם זאת, להבדלים כאלה אין השפעה על סוג הפרוטוקול שאנו מציעים, שכן כאן אנו מתמקדים בתגובה של תאים מושתלים לסביבת הרקמה המארחת ולא ביכולות ההתחדשות של תאי העצב השוכנים. הבדל נוסף בין עכברים ילודים לעכברים בוגרים לאחר SCI קשור להיווצרות צלקת גליה המתרחשת אצל מבוגרים. היבט זה אינו נלקח בחשבון במודל המוצע, שאינו מתחשב בתהליכים הפיזיולוגיים המורכבים הנובעים מפגיעות ראשוניות ומשניות.
לגבי היישומים, הפלטפורמה יכולה לשמש גם כדי לחקור את האינטגרציה בין התאים המושתלים עם מעגלים תושבים הקיימים במודל האורגנוטיפי SC. כלי הנדסה גנטית כבר שימשו במערכת העצבים המרכזית להערכת קישוריות סינפטית וניתן היה לנצל אותם בהקשר זה 53,54,55. בפרט, ניתן לחקור ולאמת את האינטגרציה על ידי הערכת היווצרות הסינפסות בין התאים המושתלים לבין רקמת SC ex vivo. תרבויות אורגנוטיפיות ארוכות טווח אלה יכולות להיות מנוצלות גם לבדיקת חומרים נוירופרוטקטיביים ונוירורגנרטיביים או מולקולות/חומרים חדשים או לחקר הפרעות נוירודגנרטיביות המערבות את ה-SC. כדי לחקור הפרעות נוירודגנרטיביות ספציפיות, יש להתאים את הפרוטוקול לגידול פרוסות SC שנוצרו ממודלים רלוונטיים, כגון עכברים טרנסגניים הנושאים מוטציות ספציפיות הקשורות לפתולוגיה, בשלב הרלוונטי לפתולוגיה (כלומר, יילודים, נוער, מבוגרים). לסיכום, הפרוטוקול שלנו ותרביות אורגנוטיפיות בכלל, בהיותן צמחים של איבר מסוים, מציגות תכונות המגשרות על הפער בין תרביות תאים דו-ממדיות לבין מודלים in vivo, המאשרות אותם ככלי רב ערך הן למחקר בסיסי והן לבדיקות פרה-קליניות.

לפגיעה טראומטית בחוט השדרה (SCI) יש השלכות פיזיות, פסיכולוגיות וכלכליות הרסניות על מטופלים ומטפלים1. ניסיונות רבים נעשו לקדם התחדשות אקסונלית ב- SCI בגישות שונות 2,3,4 וכמה השפעות מועילות הודגמו על ידי היווצרות ממסרים עצביים בין נוירונים פרוקסימליים ודיסטליים באתר הפציעה באמצעות טיפולים בתחליפי תאים. העניין בטיפולים תאיים עדיין גדל5 מכיוון שתאים מושתלים יכולים למלא תפקידים רבים, כולל מתן תמיכה טרופית, אפנון חיסוני, חידוש מעגלים עצביים אבודים באמצעות השראת פלסטיות, החלפת תאים ורמיאלינציה של אקסונים6.
לאחרונה, המאמץ העיקרי בתחום התמקד בתאי גזע/אב עצביים אנושיים (NSCs/NPCs)7. מספר מחקרים מראים כי NSCs/NPCs מווסתים את תגובת האסטרוציטים8, מקדמים את הפרשת הגורמים הפרוגנרטיביים 9,10, ומחליפים תאים עצביים חסרים ב-SCI11,12. עם זאת, מחקרים התומכים בהתמיינות של תאים מושתלים לנוירונים פונקציונליים עדיין גרועים. יתר על כן, הישרדות התאים המושתלים וההתמיינות בחוט השדרה הפגוע (SC) הם נמוכים13, אולי משום שלתאים מושתלים לוקח מספר שבועות, אפילו חודשים, להתמיין in vivo. בנוסף, מחקרים עכשוויים לא הבהירו לחלוטין היבטים ביוכימיים, מולקולריים, תאיים ותפקודיים רבים של טיפולים בתחליפי תאים. בהקשר זה, נדרשים מודלים פשוטים, מהירים וחסכוניים כדי לחקור את מנגנוני קליטת התא, את יכולתם של תאים מושתלים להתרבות, להתמיין לסוגים או תת-אוכלוסיות ספציפיות של תאים, וליצור סינפסות עם תאי עצב שוכנים.
שילוב מחקרים היסטולוגיים ברישום אלקטרופיזיולוגי ובפרופיל שעתוק ופרוטאום הכרחי להבנה מלאה של המפל המולקולרי המתרחש לאחר השתלת תאים. זה בהחלט יאיץ את התכנון והאימות של טיפולים חדשים לתחליפי תאים במודלים פרה-קליניים ובמחקרים קליניים. ואכן, עד כה, השימוש במכרסמים, בעלי חיים גדולים ופרימטים לא אנושיים היה כדאי להבהרת תהליכים תאיים רבים לאחר השתלה14. עם זאת, בשל העלות הגבוהה, ההשפעה האתית הגבוהה, כמו גם את המורכבות של האורגניזם, השימוש בהם הוא לעתים קרובות לא פשוט או לא מספיק כדי לפענח תהליכים ביוכימיים ומולקולריים. בנוסף, הם עשויים להציג חסרונות רבים בקורלציה עם הבדלים ביולוגיים, הן בין מינים (מטבוליזם) ושונות תוך מינית (מין, גיל).  גורמים אלה, יחד עם גורמים חיצוניים כגון מצבים מלחיצים, יכולים לשנות את תוצאות הניסוי ואת יכולת החיזוי שלהם במונחים של תרגום טיפולי לבני אדם 15,16,17.
לפיכך, קבוצות רבות משתמשות בתרביות תאים דו-ממדיות במבחנה ובפרוסות אורגנוטיפיות ex vivo (תרביות ex vivo) בנוסף למודלים של בעלי חיים. תרבית תאים דו-ממדית היא המערכת הנפוצה ביותר לחקר תהליכים ביולוגיים ספציפיים ברמת תא בודד ו/או אוכלוסיית תאים. עם זאת, תרביות תאים חד-שכבתיות אינן משקפות את המורכבות המצויה באורגניזם שלם. היעדר מבני רקמה וסביבה פיזיולוגית אינו מאפשר למערכות התרבית הדו-ממדיות לחקות לחלוטין היבטים מבניים, מורפולוגיים ותפקודיים מרכזיים של הרקמה הנחקרת 18,19,20.תרבויות אורגנוטיפיות יכולות להתגבר על חלק מהבעיות הללו. מודלים אורגנוטיפיים מבוססים על שתילת שבר של רקמה או איבר ותחזוקתו ex vivo לתקופה מוגבלת21,22. בפרט, פרוסות של רקמה נטוע נוצרים עם עובי מדויק המאפשר חומרים מזינים להגיע בקלות כמעט לכל התאים בפרוסות. הם יכולים להיווצר מאזורים שונים של מערכת העצבים המרכזית, כגון ההיפוקמפוס, ההיפותלמוס, המוח הקטן, התלמוס, קליפת המוח, substantia nigra וסטריאטום, וחוט השדרה23. תרביות אורגנוטיפיות שומרות על ארכיטקטורת הרקמות, על ההתפלגות המרחבית של התאים, על המגוון התאי ועל הסביבה (כלומר, הרכב המטריצות החוץ-תאיות) של איבר המוצא. יתר על כן, הם משמרים את הפעילות העצבית המקורית, קשרים בין תאים, ובפרט, מעגלים למרחקים קצרים לאחר explant.
היבטים אלה מספקים כמה יתרונות לתרבויות ex vivo ביחס הן לתרבויות חד-שכבתיות והן למודלים של בעלי חיים. הם שומרים על תכונות רקמה מרכזיות שנמצאו in vivo אך עם הפחתת העלויות והאפשרות לבצע סוגים שונים של ניסויים מולקולריים, תאיים ופונקציונליים עם ויסות מדויק של הפרמטרים הסביבתיים של התרבית 24,25,26,27,28,29. פרוסות אורגנוטיפיות יכולות להיות מנוצלות גם לפיתוח מודלים להפרעות נוירולוגיות שונות על ידי הדמיית תכונות היסטופתולוגיות מרכזיות של מצבים ספציפיים30. יתר על כן, השמירה על סביבת הרקמה הרב-תאית המקורית הופכת אותם לפלטפורמות מתאימות לבדיקת תרופות ולבדיקת מולקולות וחומרים נוירו-פרוטקטיביים ונוירו-רגנרטיביים.
בעבודה זו אנו מציעים שימוש בתרביות אורגנוטיפיות SC כמודל לייעול השתלות מל"ל. זה לא טריוויאלי מכיוון שתנאי גידול אופטימליים נדרשים כדי להבטיח את הישרדותם של המאכסן (רקמת SC) וההשתלה (NSCs) במשך שבועות. קבוצות מחקר שונות המושתלות בתרביות אורגנוטיפיות, מוחיות ונגזרות SC, סוגים שונים של תאים. רוב העבודות הראו השתלה של תאי גזע מזנכימליים31,32,33, תאי מעטפת ריח34, או NSCs35,36,37,38,39,40 והעריכו את האינטראקציות של תאים מושתלים עם התאים המארחים, הישרדות המערכת כולה, והאם התאים המושתלים התמינו לנוירונים או לתאים דמויי נוירון בתוך סביבת הרקמה Ex Vivo 32,33,41. חלקם העריכו את פוטנציאל ההתחדשות של תאים לאחר ההשתלה, והתבוננו בגדילה האקסונלית שלהם בתוך הרקמה 37,40,41, ביכולת המיאלינציה של מבשרי אוליגודנדרוציטים מושתלים 42, בנדידת התאים המושתלים לרקמה המארחת43, והאם התאים המושתלים שחררו גורמים שדחפו לסביבה מתחדשת31. מגבלה אחת של המחקרים הנוכחיים היא שהם אינם חוקרים את ההשתלה במשך תקופה ארוכת טווח.
בהתחשב בכך שנראה כי NSCs דורשים מספר שבועות כדי להבדיל in vivo 44,45, מחקר זה מתמקד כיצד ליצור ולתחזק פרוסות SC עכבר לטווח ארוך (≥30 ימים) למשך עד 90 יום. נמצא כי פרוסות שומרות על המבנה האנטומי המקורי שלהן ושומרות על קצב אפופטוטי נמוך ויציב לאורך זמן ועל כדאיות גבוהה של תאים. נצפו ביטוי מפוזר של סמנים עצביים RNA קושר שועל-1 הומולוג 3 (RBFOX3) ושרשרת אור נוירופילמנט (NFL), כאשר האחרונים הראו מגמה הולכת וגוברת של נביטה אקסונלית סביב הפרוסות לאורך זמן, המעידה על מצבן הבריא. יתר על כן, השתלנו בהצלחה בתאי גזע נוירואפיתל אנושיים המבטאים GFP (h-SC-NES) בשלבים הראשונים של התמיינות עצבית. השתל נשמר במשך 30 יום לאחר ההשתלה והתאים הראו ביטוי GFP במשך כל התקופה בתרבית. שיעור אפופטוטי של תאים ביום שלאחר ההשתלה (DPT) 30 נמצא גם הוא בקנה אחד ביחס לערך קצב אפופטוטי שנצפה ב- DPT 7 באותם תאים40. נראה כי התאים השתלבו בסביבת הרקמה ושרדו עד מספר שבועות.
לסיכום, הנתונים שלנו מראים כי ניתן לשמור בתרבית פרוסות אורגנוטיפיות SC במשך 3 חודשים מבלי לפגוע בציטוארכיטקטורה המקורית שלהן ובסביבת הרקמות. והכי חשוב, ניתן לנצל אותם כדי לבחון טיפולים תאיים לפני שממשיכים בניסוי in vivo , ובכך להפחית את העלויות ואת זמן הניסוי. כאן, אנו ממחישים בפירוט את כל הקטעים ליצירת פרוסות אורגנוטיפיות של עכבר SC וכיצד לשמור עליהם לתקופות ארוכות טווח (≥30 יום). יתר על כן, אנו מסבירים לעומק כיצד לבצע השתלת NPC לתוך הפרוסות וכיצד לשמור אותם לניתוח במורד הזרם.

<table><tbody><tr><td>קספאז-3 נגד שסע, &nbsp; (ASP175) (5A1E) (ארנב)</td><td>טכנולוגיית איתות תאים</td><td>9661S</td><td>1:400</td></tr><tr><td>אנטי-GFP (עכבר) - חד-שבטי</td><td>סיגמא/Merck</td><td>G6539</td><td>1:400</td></tr><tr><td>גרעינים אנטי-אנושיים (עכבר) - חד-שבטי, שיבוט 235-1&nbsp;</td><td>סיגמא/מרק</td><td>MAB1281</td><td>1:400</td></tr><tr><td>גרעינים אנטי-אנושיים (ארנב)</td><td>NeoBiotechnologies</td><td>RBM5-346-P1</td><td>1:400</td></tr><tr><td>אנטי-NeuN (RBFOX3) (ארנב) -</td><td>סיגמא/מרק</td> רב-שבטי <td>ABN78</td><td>1:400</td></tr><tr><td>אנטי-NFL (עכבר)</td><td>סיגמא/מרק</td><td>MAB1615</td><td>1:400</td></tr><tr><td>אנטי-NFL H-פוספו (ארנב) -ביולוגנד פוליקלונלי</td><td></td><td>840801</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Aqua Polymount</td><td>Poly-sciences</td><td>18606-20</td><td></td></tr><tr><td>B-27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Gibco</td><td>PHC7074</td><td></td></tr><tr><td>Blades</td><td>Leica</td><td>118364227</td><td></td></tr><tr><td>תרבית תאים מים מדורגים</td><td>Sigma/Merck</td><td>W3500-500ML</td><td></td></tr><tr><td>קולגן מזנב עכברוש</td><td>Sigma/Merck</td><td>C7661</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי - מיקרוסקופ קונפוקלי A1 (Eclipse Ti)</td><td>ניקון&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>D(+)-גלוקוז</td><td>סיגמא/Merck</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים לניתוח</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>15915</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>31330</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>סיגמא/Merck</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>סיגמא/Merck</td><td>gf144</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Gibco</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>FGF-2</td><td>Stemgent</td><td>03-0002</td><td></td></tr><tr><td>GDNF</td><td>Sigma/Merck</td><td>SRP3200</td><td></td></tr><tr><td>נימי זכוכית, 3.5 אינץ'&nbsp;</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-038</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי עכבר IgG Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11029</td><td></td></tr><tr><td>עז-אנטי עכבר IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21236</td><td>1:500</td></tr><tr><td>עז-אנטי ארנב IgG Alexa Fluor 568</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A11011</td><td>1:500</td></tr><tr><td>עז-אנטי ארנב IgG Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A21244</td><td>1:500</td></tr><tr><td>Graph Pad-Prism</td><td>Dotmatics</td><td></td><td>תוכנה לניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14025-050</td><td>1:500</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Gibco</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>H3570</td><td></td></tr><tr><td>סוס סרום</td><td>Gibco</td><td>16050-122</td><td></td></tr><tr><td>אינסולין</td><td>סיגמא/Merck</td><td>I9278</td><td></td></tr><tr><td>למינין</td><td>סיגמא/Merck</td><td>L2020</td><td></td></tr><tr><td>Lentiviral prep</td><td>Addgene</td><td>17446-LV</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25030024</td><td></td></tr><tr><td>ערכת בדיקת כדאיות/ציטוטוקסיות חי/מת</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L32250</td><td></td></tr><tr><td>McIlwain Tissue Chopper</td><td>World Precision Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>Gibco</td><td>11090-081</td><td></td></tr><tr><td>טיפים למיקרו-מטען</td><td>Eppendorf</td><td>5242956003</td><td>להעמיס תאים במחט להשתלה</td></tr><tr><td>שקופיות מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td>631-0909</td><td></td></tr><tr><td>קרום תרבית תאים מילי-תאים</td><td>סיגמא/מרק</td><td>PICM0RG50</td><td></td></tr><tr><td>משקפי כיסוי מיסקרוסקופ</td><td>VWR&nbsp;</td><td>ECN 631-1572</td><td></td></tr><tr><td>N-2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין/סטרפטומיצין</td><td>תרמו פישר</td><td></td> 15140122 <td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי מדעית (35 מ"מ)</td> <td>VWR</td><td>734-2317</td><td></td></tr><tr><td>PFA</td><td>סיגמא/Merck</td><td>P6148-500G</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה פסטור פלסטיק</td><td>Sarstedt</td><td>86.1171.010</td><td></td></tr><tr><td>פנאומטי PicoPump</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV830</td><td>מיקרו-מזרק להשתלה</td></tr><tr><td>פולי-L-ליזין</td><td>סיגמא/Merck</td><td>P4707</td><td></td></tr><tr><td>להב אזמל מס' 10 נירוסטה סטרילית</td><td>VWR ידית</td> אזמל <td>SWAN3001</td><td></td>בינלאומית</tr> #<tr><td>3</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500236</td><td></td></tr><tr><td>אביב מספריים</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>501235</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ להדמיה ורכישה</td><td>Nikon&nbsp;</td><td>SMZ18</td><td></td></tr><tr><td>סטריאומיקרוסקופ לניתוח</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Merck</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה-דומונט #5-inox</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501985</td><td></td></tr><tr><td>מספריים ואנה, 8.5 ס"מ</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500086</td><td></td></tr><tr><td>מכשיר תריס חולץ מיקרופיפטה אנכי</td><td></td><td>P-30</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632</td><td>מו"פ די מערכות</td><td>1254/50</td><td></td></tr></tbody></table>

תרבית פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה של עכבר לטווח ארוך כפלטפורמה לאימות השתלת תאים בפגיעה בחוט השדרה

Long-Term Mouse Spinal Cord Organotypic Slice Culture as a Platform for Validating Cell Transplantation in Spinal Cord Injury

תרופות נחושות לפגיעות בעמוד השדרה (SCIs) עדיין חסרות, בשל הפתופיזיולוגיה המורכבת. אחת הגישות הרגנרטיביות המבטיחות ביותר מבוססת על השתלת תאי גזע כדי להחליף רקמות שאבדו ולקדם התאוששות תפקודית. יש להמשיך ולחקור גישה זו טוב יותר במבחנה ובאקס ויו לבטיחות ויעילות לפני שנמשיך בניסויים יקרים יותר וגוזלים זמן רב יותר בבעלי חיים. בעבודה זו, אנו מראים את הקמתה של פלטפורמה ארוכת טווח המבוססת על פרוסות אורגנוטיפיות של חוט השדרה של עכבר (SC) שהושתלו בתאי גזע עצביים אנושיים כדי לבחון טיפולים תחליפיים תאיים עבור SCIs.
תרביות אורגנוטיפיות סטנדרטיות של SC נשמרות במשך כשבועיים או שלושה במבחנה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול ממוטב לתחזוקה לטווח ארוך (≥30 יום) למשך עד 90 יום. המדיום המשמש לגידול ארוך טווח של פרוסות SC הותאם גם להשתלת תאי גזע עצביים במודל האורגנוטיפי. תאי גזע נוירואפיתל אנושיים שמקורם ב-SC (H-SC-NES) הנושאים חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) הושתלו בפרוסות SC של עכבר. שלושים יום לאחר ההשתלה, התאים עדיין מראים ביטוי GFP וקצב אפופטוטי נמוך, דבר המצביע על כך שהסביבה האופטימלית שמרה על הישרדותם והשתלבותם בתוך הרקמה. פרוטוקול זה מייצג התייחסות חזקה לבדיקה יעילה של טיפולים בתחליפי תאים ברקמת SC. פלטפורמה זו תאפשר לחוקרים לבצע סינון מקדים ex vivo של טיפולים שונים להשתלת תאים, ותסייע להם לבחור את האסטרטגיה המתאימה ביותר לפני שהם ממשיכים בניסויי in vivo .

השיטות המתוארות מאפשרות הקמת פרוסות אורגנוטיפיות SC מעכברים בשלב P3 ותחזוקתן בתרבית למשך זמן ממושך בתנאים בריאים. יתר על כן, אנו מראים פרוטוקול להשתלת תאים בפרוסות ולגידול משותף שלהן למשך עד 30 יום (איור 1). ראשית, אנו מראים אופטימיזציה של תנאי התרבית ופרוטוקול המתאים לגידול ממושך של פרוסות SC עם תאים מושתלים (איור 2A). פרוסות נוצרות ומתוחזקות מ-DEV 0 עד DEV 2 ב-OM, שהוצע במקור כמדיום אופטימלי לתחזוקת פרוסות SC47. עם זאת, בשל נוכחותם של חלבונים בסרום, מדיום זה יכול להיות suboptimal כדי לקיים את ההתמיינות העצבית ואת ההתבגרות של תאים מבשר עצבי מושתל. ואכן, ב-DEV 3 בדקנו את המעבר מ-OM ל-GM, פורמולציה המכילה Neurobasal בתוספת B27, התומכת בהישרדות עצבית, וללא סרום, המעכב את ההתמיינות העצבית הנכונה, ומקדם במקום זאת גורל גלייה 48,49.
איור 2B מראה את התוצאות שהושגו על-ידי החלפת המדיום ב-DEV 3 מ-OM ל-GM, בהשוואה לפרוסות SC שלא קיבלו את המתג (פרוסות הבקרה גודלו בתרבית ב-OM). השתמשנו בפיזור אות ה-NFL בתוך הפרוסות כסמן לשלמות עצבית (איור 2B,C). פרוסות ב-DEV 7 היו בריאות בשני תנאי הגידול, והראו את ההתפלגות המפוזרת של נוירופילמנט (NFL, בירוק) בתוכם. ב-DEV 10, פרוסות שתורבתו ב-GM נראו בריאות יותר ביחס לפרוסות הבקרה שתורבתו ב-OM, כפי שתועד על ידי הפצת כתמים ב-NFL. הערכנו גם את שטח NFL+ (% NFL+ Area/DAPI+ Area) של הפרוסות שמוצגות בתמונות המייצגות של איור 2B. אזור ה-NFL+ המשוער מיוצג בהיסטוגרמות באיור 2C, מה שמאשר שאות ה-NFL מפוזר באופן מפוזר בפרוסות ב-DEV 7 בשני התנאים. עם זאת, ב-DEV 10, השטח המשוער המכוסה על ידי צביעת NFL פוחת עבור מצב התרבות OM.
נתונים אלה מצביעים על כך שהמעבר ל-GM ב-DEV 3 נסבל היטב לגידול ממושך של פרוסות SC (DEV 10). בשלב הבא, בדקנו את GM בנקודות זמן ממושכות יותר: DEV 30, DEV 60 ו-DEV 90. כפי שניתן לראות באיור 3A,B, פרוסות נשמרו בריאות בתרבית עד DEV 90. צביעת NFL נמצאה באופן נרחב בפרוסות בכל נקודת זמן, עם נביטה מפוזרת סביב פרוסות הנוירוטים היוצאות מאזור המרכז. ואכן, הערכנו את שטח ה-NFL+ של הפרוסות שמוצגות באיור 3A, והוא גדל עם הזמן כפי שמוצג בהיסטוגרמות של איור 3B. ראינו גם חיוביות לסמן העצבי RBFOX3, מה שסיפק קו נוסף של ראיות להתמיינות העצבית של הפרוסות. בכל נקודת זמן, בדקנו גם את קצב האפופטוזיס על-ידי הערכה בפרוסות שונות של מספר התאים החיוביים ל-aCASP3 (איור 4A,B). הניתוח בוצע כמתואר בסעיף 10.2 לפרוטוקול. שיעור אפופטוטי (% תאי aCASP3+ / המספר הכולל של תאי DAPI+) נמצא נמוך מאוד בכל נקודת זמן (0.85 ± 0.52%, 0.71 ± 0.27%, 0.66 ± 0.45% עבור DEV 30, 60 ו- 90, בהתאמה) ללא הבדלים משמעותיים בין שלוש נקודות הזמן הנחשבות (ערך p &gt; 0.05, איור 4B). נתונים אלה מצביעים על כך שהקצב האפופטוטי הקשור ל-aCASP3 נשאר יציב לאורך זמן, ויחד עם הפיזור הרחב של NFL בפרוסות (איור 4A), מאשרים את הישרדות הפרוסות בכל נקודת זמן.
כתמיכה לנתונים קודמים, ביצענו גם בדיקה חיה/מתה כדי להעריך את הכדאיות של הפרוסות בשלוש נקודות הזמן השונות. השתמשנו בקלצין (צביעה ירוקה) כדי לתייג את התאים הפעילים מבחינה מטבולית ובסיטוקס (צביעת ציאן) כדי להעריך מוות תאי. כפי שניתן לראות בהיסטוגרמות באיור 4C, אחוז התאים הפעילים מטבולית עולה מעט מ-DEV 30 ל-DEV 90 (93.17 ±-5.21%, 96.43 ±-3.02%, 96.33 ±-3.10% עבור DEV 30, 60 ו-90, בהתאמה), ומתייצב בין שתי נקודות הזמן האחרונות (DEV 30 לעומת DEV 60 p-value = 0.018; DEV 30 לעומת DEV 90 p-value = 0.027; DEV 60 לעומת DEV 90 p-value = 0.99). מצאנו רמות נמוכות של מוות תאי שירדו עם הזמן (6.83 ±-5.21%, 3.57 ±-3.02%, 3.66 ±-3.10% עבור DEV 30, 60 ו-90, בהתאמה) ונמצא הבדל משמעותי בין DEV 30 לבין נקודות זמן מאוחרות יותר, DEV 60 ו-DEV 90 (DEV 30 לעומת DEV 60 p-value = 0.018; DEV 30 לעומת DEV 90 p-value = 0.027; DEV 60 לעומת DEV 90 p-value = 0.99). נתונים אלה, בשילוב עם שיעור האפופטוזיס, מאשרים את הישרדות הפרוסה לאורך זמן ותומכים ביעילות פרוטוקול הטיפוח ארוך הטווח המבוצע.
לאחר שנקבעה ההיתכנות של תרבית ממושכת של פרוסות SC, אתגרנו את המערכת על ידי השתלת תאי h-SC-NES בשלבים הראשונים של התמיינות עצבית. בדקנו את תאי h-SC-NES מכיוון שהם הראו תוצאות מבטיחות לטיפול ב-SCI12. הליך ההשתלה של תאי h-SC-NES בפרוסות SC של העכבר מתואר בסעיף 6 של הפרוטוקול. פרוסות SC ותאי h-SC-NES שהושתלו נשמרו עד DPT 30. תאים הושתלו ב-DIV 10 של התמיינות (שלב מקדים עצבי) לפרוסות אורגנוטיפיות של DEV 4, כפי שמוצג בסכמת הפרוטוקולים של איור 5A. התאים המושתלים נוטרו לביטוי GFP בתרבית במשך עד 30 יום. איור 5B מציג תמונות חיות מייצגות, ב-DPT שונה, של פרוסת SC עם תאי GFP+ מושתלים. הביטוי היציב של GFP לאורך זמן (איור 5B ואיור 6A) מצביע על כך שתאים שרדו לתוך רקמת SC בתנאי התרבית שעברו אופטימיזציה בעבר. בדקנו גם את שיעור האפופטוטי של תאים מושתלים כמתואר בסעיף 10.2 לפרוטוקול. שיעור האפופטוטי (% aCASP3+ תאים/המספר הכולל של תאי Hu-Nu+ ) נמצא נמוך מאוד (0.44 ± 0.34%) לאחר 30 DPT (איור 6B). יתר על כן, שיעור אפופטוטי ב DPT 30 נמצא בקנה אחד עם זה שנמצא עבור אותו סוג של תאים ב DPT 7, כפי שדווח בעבר40, תיעוד כי התרביות מתייצבים לאורך זמן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig01.jpg"> איור 1: זרימת העבודה של הפרוטוקול. סכימה מייצגת המציגה את זרימת העבודה הכללית של הפרוטוקול שבוצע. (A) משמאל, סכימה המסכמת יצירת פרוסות SC-פרוסות עכבר מ-SC מבודד של גורי עכברים ב-P3 וטיפוח ארוך טווח של פרוסות אורגנוטיפיות SC. (B) מימין, סכימה המסכמת השתלה של תאי h-SC-NES המבטאים GFP בפרוסות SC-organotypic של עכבר. תאים מושתלים נשמרים במשך 30 יום לאחר ההשתלה. קיצורים: h-SC-NES = גזע נוירואפיתל הנגזר מחוט השדרה האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DEV = יום ex vivo; DPT = יום לאחר ההשתלה; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; RBFOX3= RNA קושר פוקס-1 הומולוג 3; aCASP3 = קספאז-3 פעיל; SC= חוט השדרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig02v2.jpg"> איור 2: אופטימיזציה של תנאי גידול ארוכי טווח. (A) תוכנית מייצגת של הפרוטוקול לבדיקת OM ו- GM. OM נשמר עד DEV 7-10 עבור קבוצת הביקורת. המדיום עובר ל-GM ב-DEV 3 עבור הפרוסות המטופלות; לאחר מכן, הם קבועים ב- DEV 7-10 להשוואה לבקרות. (B) תמונות מייצגות המשוות פרוסות אורגנוטיפיות של עכבר SC ב-DEV 7 ו-10 בתרבית בתנאים שונים. פרוסות מוכתמות עבור הסמן cytoskeletal סמן neurofilament (NFL, ירוק). התפוצה הרחבה של כתמי NFL בפרוסות שתורבתו עם GM מצביעה על הישרדות כללית ובידול. גרעינים מוכתמים ב-DAPI. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (C) היסטוגרמות מייצגות של אומדן השטח המכוסה על-ידי NFL בפרוסות המוצגות באיור 1B. ב-DEV 10, שטח הפנים של ה-NFL יורד בתנאי התרבות של OM. קיצורים: DEV = day ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור neurofilament.; OM = מדיום אורגנוטיפי; GM = מדיום השתל; SC = חוט השדרה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig03v3.jpg"> איור 3: פרוסות אורגנוטיפיות של עכבר מתורבת לטווח ארוך. (A) פרוסות נשמרות בתרבית עד DEV 90. בדיקת אימונופלואורסנציה מגלה תפוצה רחבה של הסמן הציטו-שלד נוירופילמנט (NFL, ירוק) והסמן העצבי הגרעיני RBFOX3 (אדום), המעידים על מצבם הבריא וזהותם העצבית לאחר תרבית ארוכת טווח. יש לציין כי אקסונים מסוג NFL+ נובטים החוצה באופן מפוזר סביב הפרוסות לאורך זמן. גרעינים מוכתמים ב-DAPI. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. (B) היסטוגרמות מייצגות של אומדן השטח והזמן של NFL+ ושטח RBFOX3+ של הפרוסות המוצגות בלוח A. שטח הנוירוט NFL+ גדל עם הזמן. קיצורים: DEV = day ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; SC = חוט השדרה; RBFOX3= RNA קושר פוקס-1 הומולוג 3. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig04.jpg"> איור 4: הערכת כדאיות התא בפרוסות SC לאורך זמן. (A) תמונות מייצגות של פרוסות אורגנוטיפיות ב-DEV 60 מוכתמות עבור aCASP3 (אדום) ו-NFL (ירוק). סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. NFL מראה תבנית מפוזרת. תאים נדירים חיוביים לסמן אפופטוטי aCASP3 (כניסה: 1-2-3). (B) ניתוח קצב האפופטוזיס בפרוסות בנקודות זמן שונות. ממוצע ± SD, N (משוכפל) = 6 פרוסות, n (סה"כ תאים) &gt; 1,000 עבור כל פרוסה, מבחן Kruskal-Wallis, השוואה מרובה, ערך p &gt; 0.05. קצב האפופטוטי יציב לאורך זמן. בכניסות 1-2-3 של לוח A, ניתן לצפות בפרטים של תאים חיוביים עבור aCASP3 (צביעה אדומה, חצים לבנים). נקודות אדומות קטנות מסמנות פסולת תאים וגרעינים פיקנוטיים. סרגל קנה מידה = 50 מיקרומטר. (C) תמונות מייצגות של בדיקה חיה/מתה המבוצעת על פרוסות SC ב-DEV 90: תאים פעילים מטבולית מסומנים בירוק עם Calcein, בעוד תאים מתים ופגועים מסומנים בכחול בהיר (ציאן) עם Sytox. שתי ההיסטוגרמות מראות את % התאים החיוביים עבור קלצאין (משמאל) וסיטוקס (מימין) במספר התאים הכולל. עבור שניהם ממוצע ± SD, N (משוכפל) = 6 פרוסות, n (סה"כ תאים) &gt; 1,000 עבור כל פרוסה, מבחן Kruskal-Wallis, השוואה מרובה, DEV 30 לעומת DEV 60 p-value = 0.018; DEV 30 לעומת DEV 90 p-value = 0.027; DEV 60 לעומת DEV 90 ערך p &gt; 0.99. קיצורים: DEV = day ex vivo; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; SC = חוט השדרה; aCASP3 = קספאז-3 פעיל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig05.jpg"> איור 5: השתלת תאי h-SC-NES בפרוסות אורגנוטיפיות של עכבר. (A) תכנית מייצגת של פרוטוקול ההשתלה. תאים מושתלים כמבשרים עצביים ב-DIV 10 של התמיינות לפרוסות אורגנוטיפיות של DEV 4. (B) תמונות מייצגות של פרוסות אורגנוטיפיות של עכברים שהושתלו בתאי h-SC-NES המבטאים GFP לאורך זמן עד DPT 30. תאים מומרים עם וקטור lentiviral הנושא את הגן GFP . ביטוי GFP לאורך זמן מאשר את הכדאיות וההתאמה שלהם לסביבת הפרוסה. סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר. קיצורים: DIV = היום הראשון לפני ההבחנה; h-SC-NES = גזע נוירואפיתל הנגזר מחוט השדרה האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DEV = יום ex vivo; OM = מדיום אורגנוטיפי; GM = מדיום השתל; DPT = ימים לאחר ההשתלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66704/66704fig06.jpg"> איור 6: הערכת שיעור אפופטוזיס של תאי h-SC-NES מושתלים לאחר 30 יום מההשתלה. (A) תמונה מייצגת של פרוסה אורגנוטיפית של עכבר שהושתלה בה תאי h-SC-NES המבטאים GFP. התאים מומרים עם וקטור לנטיויראלי הנושא את הגן GFP לניטור שלהם לתוך הפרוסות לאחר ההשתלה. ביטוי GFP לאורך זמן מאשר את הכדאיות וההתאמה שלהם לסביבת הפרוסה. נקודת הזמן המוצגת היא DPT 30; תאים מוכתמים עבור גרעינים אנושיים (ציאן) ו aCASP3 (אדום). סרגל קנה מידה = 150 מיקרומטר. (B) משמאל, תרשים עוגה מייצג של ניתוח אפופטוזיס של תאים שהושתלו בפרוסות ב- DPT 30 (N (משוכפל) = 5 פרוסות, n (תאים) = 5,000), ומימין, כניסה של תאי Hu-Nu+ ופרט של תא חיובי ל- aCASP3 (חץ לבן). סרגל קנה מידה = 75 מיקרומטר. נקודות אדומות קטנות מסמנות פסולת תאים וגרעינים פיקנוטיים. קיצורים: h-SC-NES = גזע נוירואפיתל הנגזר מחוט השדרה האנושי; GFP = חלבון פלואורסצנטי ירוק; DPT = יום לאחר ההשתלה; DAPI = 4',6-diamidino-2-phenylindole; NFL = שרשרת אור נוירופילמנט; aCASP3 = קספאז-3 פעיל; Hu-Nu = גרעינים אנושיים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הרכב הפתרונות המשמשים בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66704/66704_Tables%20of%20Solutions%20rev.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

במאמר זה, אנו מספקים שיטה ניתנת לשחזור ליצירה ותחזוקה של פרוסות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של חוט השדרה שהושתלו בתאי גזע עצביים כמודל ex vivo לבדיקת טיפולים תחליפיים תאיים.

Resolutive cures for spinal cord injuries (SCIs) are still lacking, due to the complex pathophysiology. One of the most promising regenerative approaches ...

אנו מעוניינים לפתח גישה רגנרטיבית מבטיחה לטיפול בפגיעות בעמוד השדרה. במאמר זה, אנו מאמתים את המודל האורגנוטיפי של חוט השדרה לבדיקת טיפולים תחליפיים תאיים במחקר חוט השדרה. עד כה, מודלים אורגנוטיפיים של חוט השדרה נשמרים בתרבית במשך שבועיים או שלושה במבחנה.ומדיה תת-תרבותית אינה אופטימלית לקליטה, התמיינות והתבגרות של תאי גזע עצביים. טיפולים בתחליפי תאים עדיין דורשים את השיפור כדי להכריז על יכולתם של התאים המושתלים לשחזר את המעגלים שאבדו. באמצעות פרוטוקול זה, אנו מספקים פלטפורמת ex vivo חדשנית וארוכת טווח להתמודדות עם בעיות הקשורות להשתלת תאים כמו הישרדות, אינטגרציה וקצב ההבשלה של תאי גזע עצביים מושתלים.פלטפורמה זו תסייע לחוקרים למצוא את האסטרטגיה הטובה ביותר להשתלת תאים, ותפחית את מספר בעלי החיים הדרושים לאימות in vivo. הפרוטוקול שלנו פשוט, מהיר וחסכוני לביצוע מחקרי הוכחת היתכנות ואופטימיזציה.

long-term-mouse-spinal-cord-organotypic-slice-culture-as-platform-for

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

השתלת מבשר עצבית היא אסטרטגיה מבטיח הגנה ו / או החלפת אבוד / נוירונים מתפקדת צוואר הרחם מנוע הסרעפת של פגיעה בחוט השדרה (SCI) לבין הנוירון המוטורי הפרעה, amyotrophic laterals טרשת (ALS). אנו מספקים פרוטוקול למסירה התא בחוט השדרה הצווארי קרן הגחון במודלים של מכרסמים ALS ו SCI.

Intraspinal השתלת תאים עבור מיקוד הורן הגחון צוואר הרחם ב טרשת לרוחב amyotrophic וקורד טראומטית פגיעה בעמוד השדרה

מקור: Palma-Tortosa, S., et.al. תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים. J. Vis. Exp. (2022)סרטון זה מדגים השתלה של תאי אב עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות רקמת קליפת המוח האנושית. ההליך כולל בידוד והשעיה מחדש של תאי אב במטריצת קרום מרתף, ולאחר מכן הזרקתם לפרוסה קליפת המוח המונחת על מכלול טרנסוול. לאחר הדגירה כדי לאפשר התמצקות מטריצה והתמיינות עצבית, הרקמה המושתלת מוכנה לניתוח נוסף.

השתלת אבות עצביים שמקורם בתאי גזע לפרוסות קליפת המוח האנושיות

תרבויות פרוסות להקל על המניפולציה של התפתחות עובר על ידי גן והפרעות תרופתיות. עם זאת, תנאי התרבות חייבים להבטיח שהתפתחות תקינה יכולה להמשיך בסביבה המופחתת של הפרוסה. אנו מדגימים פרוטוקול המאפשר פיתוח חוט שדרה רגיל להמשיך לפחות 24 שעות.

פרוטוקול עוף עובר חוט שדרת Slice תרבות

מטריצות הפיברין המכילות גורמי גדילה שימשו כדי לשמר את תאי גזע עצביים מורכבים לתוך אתרים של חיתוך רוחב חוט השדרה. תאים מורכבים מלאים לחלוטין חלל הנגע ומובחן לסוגים שונים עצבי תאים, כוללים תאי עצב שהשתרעו אקסונים לחוט השדרה מארח על פני מרחקים ארוכים.

קידום ההישרדות וההתמיינות של תאי גזע עצביים עם פיברין וקוקטיילי גורם גדילה לאחר פגיעה בחוט השדרה חמורה

מתוארת טכניקה לחקר תאי NG2 ואוליגודנדרוציטים באמצעות מערכת תרבית פרוסות של המוח הקדמי והמוח הקטן.  שיטה זו מאפשרת לבחון את הדינמיקה של התפשטות והתמיינות של תאים בתוך שושלת האוליגודנדרוציטים שבה ניתן לתפעל בקלות את הסביבה החוץ-תאית תוך שמירה על ציטו-ארכיטקטורת רקמות.

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

פגיעה בחוט השדרה היא מצב טראומטי שגורם לתחלואה קשה ותמותה גבוהה. בעבודה זו אנו מתארים בפירוט מודל חבלה של פגיעה בחוט השדרה בעכברים ואחרי השתלה של תאי גזע עצביים.

השתלת תאי גזע עצבית בדגם ניסיוני של Contusive פגיעה בחוט השדרה

כאן אנו מציגים פרוטוקול המבוסס על פרוסות חוט השדרה בתרבית על מערכים רב-אלקטרודה ללמוד התחדשות פונקציונלית של קשרי propriospinal במבחנה.

חוקר התחדשות פונקציונלית בחוט השדרה שיתוף תרבויות Organotypic גדלו על מערכים רב-אלקטרודה

מחקר זה מציג טכניקה לבידוד של נוירונים מ WT עכברים neonatal. זה דורש דיסקציה זהיר של חוט השדרה מן העכבר הילוד, ואחריו הפרדת הנוירונים של רקמת חוט השדרה דרך מחשוף מכני אנזימטי.

נוירונים חוט השדרה בידוד ותרבות מ עכברים ניאונטליים

מאמר זה מתאר שיטה להוספת צינור חלול בין גדמי חוט השדרה לאחר חיתוך מלא מילוי עם תאי שוואן (SCs), קרום המרתף להזרקה מטריקס על מנת לגשר, לקדם התחדשות האקסון על פני הפער.

השתלת של שוואן תאים בתוך תעלות PVDF-TrFE לגשר עכברוש Transected גדמי חוט השדרה כדי לקדם התחדשות האקסון על פני הפער

פרוטוקול זה מתאר תרביות אורגנוטיפיות ארוכות טווח של קליפת המוח האנושית הבוגרת בשילוב עם השתלה תוך-קורטיקלית ex vivo של אבות קורטיקליים פלוריפוטנטיים מושרים שמקורם בתאי גזע, אשר מציגים מתודולוגיה חדשנית לבדיקה נוספת של טיפולים מבוססי תאי גזע להפרעות נוירודגנרטיביות אנושיות.

תרביות אורגנוטיפיות של קליפת המוח האנושית הבוגרת כמודל Ex vivo להשתלה ואימות של תאי גזע אנושיים

למד שיטה לטיפוח פרוסות אורגנוטיפיות של חוט שדרה עכבר לטווח ארוך עם השתלת תאי גזע עצביים. פלטפורמה זו מאפשרת הערכת יעילות טיפולי החלפת תאים בפגיעות חוט השדרה.

תרבית פרוסה אורגנוטיפית של חוט השדרה של עכבר לטווח ארוך כפלטפורמה לאימות השתלת תאים בפגיעה בחוט השדרה

גלה סרטונים נוספים