Name: הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-03-29T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 58 s
Description: חקור מבני שריר הלב במכרסמים באמצעות מיקרוסקופיית light-sheet בהתאמה אישית. השיטה מאפשרת הדמייה תלת-ממדית ברזולוציה איזוטרופית ללא חיתוך פיזי של הדגימה, ומספקת הבנה מעמיקה של התפתחות הלב ושינויים מבניים בתגובה לפציעה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מביעים את תודתנו לקבוצתו של ד"ר אריק אולסון במרכז הרפואי UT Southwestern על שיתוף נדיב של דגמי בעלי החיים. אנו מעריכים את כל ההערות הבונות שסופקו על ידי חברי החממה D ב- UT דאלאס. עבודה זו נתמכה על ידי NIH R00HL148493 (Y.D.), R01HL162635 (Y.D.) ותוכנית UT Dallas STARS (Y.D).

מיקרוסקופ יריעות אור וניקוי רקמות להדמיית לב מקיפה

למחברים אין ניגוד עניינים לחשוף.

התקדמות שיטות ההדמיה, החישוב וניקוי הרקמות סיפקה הזדמנות חסרת תקדים לחקור באופן נרחב את מבנה הלב ותפקודו. זה טומן בחובו פוטנציאל גדול להעמקת ההבנה שלנו של מורפוגנזה ופתוגנזה של הלב באמצעות מודל לב מכרסם שלם. בניגוד למחקרי in vivo של לב דג זברה בגישה דומה 40,41,42,43, השילוב של טכניקות LSM מתקדמות ושיטות ניקוי רקמות מאפשר לנו להתגבר על אתגרים בין רזולוציה מרחבית לעומק חדירה בעת הדמיה של מכרסם מודל 9,44. טכניקות ניקוי רקמות הופכות את הלבבות לשקופים אופטית על ידי הסרת שומנים ואלמנטים אחרים לפיזור אור, ומאפשרות חדירת הדמיה עמוקה יותר45. בשילוב עם LSM, אנו מסוגלים לדמיין את שריר הלב. שילוב זה משפר את עומק ההדמיה ומאפשר תצפית על מיקרו-מבנה מורכב של שריר הלב. בעוד שיטות ניקוי רבות הוקמו18, התאמנו את iDISCO20 כדי להפוך במהירות את הלב שלם שקוף בהשוואה לשיטות ניקוי רקמות אחרות15, מה שהופך אותו זמין עבור הדמיה של autofluorescence מן שריר הלב. עבור תיוג פלואורסצנטי ספציפי, ניתן לשלב את הפרוטוקולים המקוריים iDISCO ו- Adipo-Clear46 עם כתמים חיסוניים במערכת הדמיה מותאמת אישית זו, למרות הדגירה הארוכה יותר. בינתיים, שיטות ששומרות על פלואורסצנטיות אנדוגנית ודורשות זמן עיבוד קצר יותר מועדפות למחקר המוצע. בניגוד לשיטות אחרות, פלטפורמה זו מציעה את היתרונות הבאים. ראשית, אנו משתמשים בפרוטוקול iDISCO מותאם לניקוי רקמות, המאפשר עיבוד מהיר של הלב שקוף תוך פחות משבוע תוך שמירה על אוטופלואורסצנטיות של שריר הלב. שנית, אנו משלבים שיטות חישוביות כגון תפירת תמונה ודה-קונבולוציה מרובת תצוגות במערכת יריעות אור מבוססת זו להדמיית לב. לבסוף, אנו מתכננים ומסנכרנים את מערכת ASLM כדי לשפר את הרזולוציה הצירית על פני FOV גדול, מה שמאפשר הדמיה רב-ממדית וניתוח של דחיסת שריר הלב וטרבקולציה ברזולוציה כמעט איזוטרופית.
כדי ללכוד תמונות לב של מודל המכרסם, סיפקנו ארבע גישות המבוססות על LSM: i) השיטה המקובלת למטרות סינון19, ii) תפירת תמונה, iii) deconvolution multiview, ו- iv) סריקת ASLM. בהתחשב בשונות בגודל הלב בין דגמים שונים, ביקשנו להתייחס לפשרה הבסיסית ברזולוציה מרחבית, מהירות רכישה ו- FOV. בעוד שתפירת תמונה מאפשרת FOV גדול עם רזולוציה מרחבית חשופה, שילובו עם deconvolution multiview או ASLM מספק רזולוציה כמעט איזוטרופית על פני ה- FOV המורחב כדי לכסות את כל לב העכבר הבוגר. יתר על כן, שילוב שיטות אלה משפר את איכות התמונה ואת הניגודיות ברקמה העמוקה, ומאפשר שחזור דיגיטלי מקיף של מודלים תלת ממדיים של מיקרו-מבנים כגון טרבקולציה של שריר הלב ודחיסה בתוך החדרים. עם זאת, מבול מערכי הנתונים, עלות עיבוד חישובית נרחבת, הצורך ברישום תמונה מדויק והפוטנציאל של ארטיפקטים בפירוק ריבוי תצוגות ותפירת הדמיה מעכבים את היישומים הרחבים שלהם. בעוד ASLM היא חלופה מתפתחת, המורכבות של סנכרון המערכת, אסטרטגיות סריקת לייזר והסתמכות על שקיפות רקמות מציבים אתגרים שעלולים להשפיע על חוסן המערכת ולהגדיל את הסיכון לנזק לצילום הלב.
באופן קולקטיבי, מתודולוגיה זו כוללת הדמיית LSM וניקוי רקמות מספקת נקודת התחלה לחקר מבנה הלב מיילודים ועד מבוגרים. הוא טומן בחובו פוטנציאל למקם את התפלגות שושלות הלב המיוחדות ואת תפקודן במהלך התפתחות הלב47. עם פיתוח ניתוח חישובי המותאם ליישומי לב 6,48,49,50,51,52,53, ניתן להרחיב מסגרת זו כדי לחקור תהליכי עיצוב מחדש של הלב, במיוחד בתגובה לאוטם שריר הלב. בסופו של דבר, אסטרטגיה הוליסטית זו טומנת בחובה פוטנציאל לפענח את המנגנון הבסיסי של מורפוגנזה לבבית ולקדם את הפיתוח של התערבויות טיפוליות.

אי ספיקת לב נותרה הגורם המוביל לתמותה ברחבי העולם, בעיקר בשל היעדר יכולת התחדשות של קרדיומיוציטים בוגרים1. הארכיטקטורה המורכבת של הלב ממלאת תפקיד מכריע בתפקודו ומספקת תובנות לגבי תהליכים התפתחותיים. הבנה מעמיקה של מבנה הלב חיונית להבהרת התהליכים הבסיסיים של מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש בתגובה לאוטם שריר הלב. ההתקדמות האחרונה הוכיחה כי עכברים ילודים יכולים לשחזר את תפקוד הלב לאחר פציעה, בעוד עכברים בוגרים חסרים יכולת התחדשות כזו2. זה מבסס בסיס לחקר רמזים הקשורים לחריגות מבניות ותפקודיות במודלים של עכברים. לשיטות הדמיה מסורתיות, כגון מיקרוסקופיה קונפוקלית, יש מגבלות טכניות, כולל עומק חדירה מוגבל, סכמת סריקה נקודתית איטית ונזקי צילום כתוצאה מחשיפה ממושכת לאור לייזר. אלה מעכבים הדמיה תלת ממדית מקיפה (3D) של הלב השלם. בהקשר זה, מיקרוסקופ גיליון אור (LSM) מתגלה כפתרון רב עוצמה, המציע את היתרונות של הדמיה במהירות גבוהה, נזק מופחת לצילום ויכולות חתך אופטיות יוצאות דופן 3,4,5. התכונות הייחודיות של LSM מציבות אותו כשיטה מבטיחה להתגבר על מגבלות הטכניקות הקונבנציונליות, ומספקות תובנות חסרות תקדיםעל התפתחות הלב ותהליכי שיפוץ 6,7,8.
בפרוטוקול זה, אנו מציגים אסטרטגיית הדמיה המשלבת LSM מתקדם עם גישות מותאמות לניקוי רקמות9, ומאפשרת הדמיה של לבבות עכבר שלמים ללא צורך בתיוג ספציפי ובחתך מכני. אנו מציעים גם כי ניתן לשפר את הדמיית LSM קונבנציונלית באמצעות טכניקות multiview deconvolution10 או מיקרוסקופ גיליון אור (ASLM) 11,12,13,14,15 כדי לשפר את הרזולוציה הצירית. בנוסף, שילוב של תפירת תמונה עם כל אחת מהשיטות הללו יכול להתגבר ביעילות על הפשרה בין רזולוציה מרחבית לשדה ראייה (FOV), ובכך לקדם את ההדמיה של לבבות עכברים בוגרים. השילוב של גישות רבות לניקוי רקמות, כולל שיטות הידרופוביות, הידרופיליות ומבוססות הידרוג'ל, מאפשר חדירת אור עמוקה יותר ללכידת המורפולוגיה של הלב כולו 16,17,18,19.
בעוד שיטות ניקוי מרובות תואמות למערכות LSM הנוכחיות, המטרה היא למזער את פיזור הפוטונים ולהגביר את חדירת האור ברקמות, כמו הלב, על ידי החלפת שומנים בתווך התואם באופן הדוק את מקדם השבירה שלו. iDISCO נבחרה כמייצגת20,21 והותאמה לדימות אוטופלואורסצנטי בפרוטוקול זה הודות לעיבוד המהיר והשקיפות הגבוהה שלה (איור 1A). באופן קולקטיבי, השילוב של גישת LSM המתקדמת עם טכניקות ניקוי רקמות מציע מסגרת מבטיחה לפענוח אנטומיה לבבית מורכבת בלבבות מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל משמעותי לקידום הבנתנו במורפוגנזה ופתוגנזה של הלב.

<table><tbody><tr><td><חזק>1% אגרוז</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr>נקודת <tr><td>התכה נמוכה אגרוז</td><td>תרמו פישר</td><td>16520050</td><td></td></tr><tr><td>מים נטולי יונים</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>כימיקלים <חזקים>לניקוי רקמות&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-Amino-1,3,3-trimethylcyclohexanemethylamine, תערובת של cis ו-trans</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>118184</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade; 332</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31185</td><td></td></tr><tr><td>D.E.R.&trade; 736</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>31191</td><td></td></tr><tr><td>Dibenzyl ether (DBE)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>33630</td><td></td></tr><tr><td>דיכלורומתאן (DCM)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>270997</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי פלואורסצנט</td><td>Spherotech</td><td>FP-0556-2</td><td></td></tr><tr><td>מי חמצן (H2O2)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>216736</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>439193</td><td></td></tr><tr><td>פרפורמלדהיד (PFA)</td><td>תרמו פישר</td><td>47392</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת מלח חוצצת פוספט (PBS)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>79383</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן כלורי (KCl)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P3911</td><td></td></tr><tr><td><חזק>תוכנה ואלגוריתמים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>אמירה</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>2021.2</td><td></td></tr><tr><td>BigStitcher</td><td>H&ouml; rl et al.22</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fiji-ImageJ</td><td>Schindelin et al.20</td><td>1.54f</td><td></td></tr><tr><td>HCImage Live</td><td>Hamamatsu Photonics</td><td>4.6.1.2</td><td></td></tr><tr><td>LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>2017 SP1</td><td></td></tr><tr><td>רכיבי מפתח של מערכת גיליונות האור המותאמת אישית</חזקה></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>0.63 - 6.3X זום גוף</td><td>אולימפוס</td><td>MVX-ZB10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>10X מטרת תאורה</td><td>Nikon</td><td>MRH00105</td><td></td></tr><tr><td>1X מטרת זיהוי</td><td>Olympus</td><td>MV PLAPO 1X/0.25&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>473nm DPSS לייזר</td><td>לייזר</td> טכנולוגיות <td>LRS-0473-PFM-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>532nm DPSS לייזר</td> לייזר טכנולוגיות <td>LRS-0532-PFM-00100-05</td><td></td><td></td></tr><tr><td>589&thinsp; nm DPSS לייזר</td><td>Laserglow Technologies</td><td>LRS-0589-GFF-00100-05</td><td></td></tr><tr><td>מחבר BNC</td><td>מכשיר לאומי</td><td>BNC-2110</td><td></td></tr><tr><td>עדשה גלילית</td><td>Thorlabs</td><td>ACY254-050-A</td><td></td></tr><tr><td>בקר מנוע DC, 4 צירים</td><td>Physik Instrumente</td><td>C-884.4DC</td><td></td></tr><tr><td>ETL</td><td>Optotune</td><td>EL-16-40-TC-VIS-5D-1-C</td><td></td></tr><tr><td>כבל ETL</td><td>Optotune</td><td>CAB-6-300</td><td></td></tr><tr><td>ETL דרייבר עדשה</td><td>Optotune</td><td>EL-E-4i</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>Chroma</td><td>ET525/30</td><td></td></tr><tr><td>מסנן</td><td>Chroma</td><td>ET585-40</td><td></td></tr><tr><td>Chroma</td><td></td><td>ET645-75</td><td></td></tr><tr><td>גלגל מסנן&nbsp;</td><td>מכשיר תריס</td><td>LAMBDA 10-B</td><td></td></tr><tr><td>שלב תרגום ממונע</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.20DG10</td><td></td></tr><tr><td>שלב תרגום ממונע</td><td>Physik Instrumente</td><td>L-406.40DG10</td><td></td></tr><tr><td>שלב תרגום ממונע</td><td>Physik Instrumente</td><td>M-403.4PD</td><td></td></tr><tr><td>NI רב תכליתי I/O</td><td>מכשיר לאומי</td><td>PCIe-6363</td><td></td></tr><tr><td>מצלמת sCMOS</td><td>Hamamatsu</td><td>C13440-20CU</td><td></td></tr><tr><td>מנוע צעד</td><td>פולולו</td><td>1474</td><td></td></tr><tr><td>עדשת צינור</td><td>אולימפוס</td><td>MVX-TLU</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

Light-Sheet Imaging to Reveal Cardiac Structure in Rodent Hearts

מיקרוסקופ יריעות אור (LSM) ממלא תפקיד מרכזי בהבנת המבנה התלת-ממדי (תלת-ממדי) המורכב של הלב, ומספק תובנות חיוניות לגבי פיזיולוגיה בסיסית של הלב ותגובות פתולוגיות. אנו מתעמקים בזאת בפיתוח ויישום טכניקת LSM כדי להבהיר את המיקרו-ארכיטקטורה של הלב במודלים עכבריים. המתודולוגיה משלבת מערכת LSM מותאמת אישית עם טכניקות ניקוי רקמות, הפחתת פיזור האור בתוך רקמות הלב לצורך הדמיה נפחית. השילוב של LSM קונבנציונלי עם תפירת תמונה וגישות deconvolution multiview מאפשר ללכוד את הלב כולו. כדי להתמודד עם הפשרה המובנית בין רזולוציה צירית לשדה ראייה (FOV), אנו מציגים גם שיטת מיקרוסקופ יריעות אור שנסחף באופן אקסיאלי (ASLM) כדי למזער אור מחוץ למיקוד ולהאיר באופן אחיד את הלב לאורך כיוון ההתפשטות. בינתיים, שיטות ניקוי רקמות כגון iDISCO לשפר את חדירת האור, להקל על הדמיה של מבנים עמוקים ולהבטיח בדיקה מקיפה של שריר הלב לאורך הלב כולו. השילוב של שיטות LSM וניקוי רקמות המוצעות מהווה פלטפורמה מבטיחה לחוקרים בפתרון מבנים לבביים של מכרסמים, טומנת בחובה פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצובה מחדש.

LSM הוכח כמטפח מחקרי לב 31,32,33,34,35,36,37 בשל הסיכון המינימלי לנזק לצילום, רזולוציה מרחבית גבוהה וחתך אופטי בניגוד לשיטות הדמיה אופטיות אחרות כגון שדה בהיר וטכניקות סריקה נקודתית 6,8,38,39,40 . לכן, כדי להבין טוב יותר את ארכיטקטורת שריר הלב התלת-ממדית, ביססנו את הפרוטוקול המבוסס על גישות ראשוניות כולל ניקוי iDISCO מותאם, תפירת תמונות, deconvolution multiview ו- ASLM. בעוד שהצגנו תוצאות באמצעות מודלים של עכברים, חשוב לציין שגם חולדות ומודלים אחרים של מכרסמים מתאימים לשיטות המוצעות. פרוטוקול ניקוי הרקמה המותאם מאפשר עיבוד של לב עכבר P1 שקוף תוך 4 ימים ולב עכבר בן 8 שבועות שקוף תוך 7 ימים (איור 1B). צעד זה משמש כנקודת מוצא למזעור בליעת פוטונים ופיזורם בלב שלם. Multiview deconvolution מאפשר שיפור של רזולוציה צירית על ידי מיזוג תמונות מנקודות מבט מרובות למודל יחיד. לאחר הקלטה רציפה של תמונות מ-6 תצוגות של אותו לב, שיטת הדה-קונבולוציה מרובת התצוגות משיגה רזולוציה כמעט איזוטרופית עם רוחב של 4.68 מיקרומטר וצירית של 5.06 מיקרומטר, לאחר 15 שעות של חישוב (איור 8A). כדי לייתר את המורכבות החישובית, התאמנו אישית ASLM מבוסס ETL לתמונה מלבבות עכברים בוגרים ליילודים. שיטה זו מאפשרת לנו לסרוק את שריר הלב באמצעות קרן לייזר ממוקדת היטב, למזער את הרקע הלא ממוקד ולשפר את ניגודיות התמונה בהשוואה לשיטות LSM הקונבנציונליות (איור 8B). עם תכנון ASLM הנוכחי, הרזולוציות הצידיות והציריות הממוצעות של המערכת משיגות 2.18 מיקרומטר ו- 2.88 מיקרומטר, בהתאמה, מה שמאפשר חקירה מעמיקה של טרבקוליציית שריר הלב בחדרים. בנוסף, ניתן להשתמש בתפירת תמונה באופן עצמאי, או בשילוב עם deconvolution multiview או ASLM כדי להרחיב את ה- FOV עבור גדלי דגימה גדולים יותר. שילוב תפירה עם ASLM מאפשר לנו לכסות את כל לב העכבר בן 8 השבועות ברזולוציה אחידה (איור 8C), ומספק פתרון יעיל לחקר חתך הלב כולו.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig01.jpg"> איור 1: תהליך ניקוי רקמות. (A) השיטה ההידרופובית כוללת התייבשות רקמות, מיצוי שומנים והתאמת אינדקס שבירה באמצעות אתר דיבנזיל (DBE) כממס אורגני. (B) לטבול את הלב בתמיסת 4% פורמלדהיד (PFA) ולייבש אותו עם שיפוע של מתנול ותערובות מים דה-יוניזציה (DI). אקונומיקה של הלב באמצעות 5% H2O2 במתנול ב 4 ° C. מעדנים את הלב עם דיכלורומתאן (DCM) ותמיסת מתנול עד שהדגימה שוקעת לתחתית הצינור. לבסוף, לדגור על הלב ב- DBE על מנת להשיג את מדד השבירה הרצוי. קווי רשת 5 מ"מ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig02.jpg"> איור 2: סכמטי של מיקרוסקופ יריעות אור שנסחפו באופן אקסיאלי . (A) תא מודפס תלת-ממדי מותאם אישית, (B) מגנט קאמרי, (C) מחזיק מהדק ו-(D) מערכת ASLM. קיצורים: CL: עדשה גלילית; ETL: עדשה אלקטרונית; IL: עדשת תאורה; DL: עדשת זיהוי; FW: גלגל סינון; TL: עדשת צינור. נתון זה שונה מ- Ref16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig03.jpg"> איור 3: תפירת תמונה ודה-קונבולוציה מרובת תצוגות. (א-ב) תפירת תמונה משמשת לכיסוי כל לבבות העכבר, כאשר לכל אריח יש חפיפה של 10% FOV עם האריחים הסמוכים לו. (C) תבנית תנועה של לב העכבר לתפירת תמונה. (D) חרוזי פלורסנט מודבקים לקצה צינור הזכוכית כדי להקל על רישום התמונה, בעוד הלב ממוקם בתוך צינור הזכוכית המכיל DBE, מה שמאפשר הדמיה בו-זמנית של לב העכבר וחרוזי פלורסנט. (E) דה-קונבולוציה מרובת תצוגות כוללת רכישה של תמונות משש נקודות מבט שונות, שכל אחת מהן אוספת תמונות מכיוונים ייחודיים. (F) נתונים גולמיים של לב עכבר P1 וחרוזים בזוויות שונות של 0°, 60°, 120°, 180°, 240° ו-300°. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. נתון זה שונהמ-16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig04.jpg"> איור 4: דיאגרמת בלוקים של מערכת ASLM. שימוש בכרטיס DAQ לסנכרון מצלמת ETL ו-sCMOS. הדיור של מנהל ההתקן ETL נפתח להלחמה של חוטי אות והארקה ל- PCB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig05.jpg"> איור 5: לוח הבקרה LabView. לוח הבקרה LabVIEW ליצירת טריגרים לסנכרון ETL ופיקסלים מופעלים של מצלמת sCMOS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig06.jpg"> איור 6: סנכרון המיקוד של גיליון אור עם פיקסלים מופעלים. (A) זיהוי נקודות ההתחלה והסיום של טווח סריקת יריעות האור מושג על-ידי הגדרת המתח המתאים עבור הדק ETL. (B) התוצאה הסינכרונית של חרוזים פלואורסצנטיים ניכרת לאורך האלכסון של התמונה. (ג-ו) הרזולוציה המרחבית הלא אחידה על פני כל ה- FOV נובעת מהפעולה האסינכרונית של ETL עם מצלמת sCMOS. ה-ETL יוזם סריקה (C) מאוחר יותר או (D) מוקדם יותר מהפיקסל שהופעל. (ה-ו) אזור המוקד אינו מקביל לאלכסון של התמונה, דבר המצביע על חוסר תאימות בין מהירויות הסריקה וההפעלה. סריקת ETL (E) מהירה יותר או (F) איטית יותר מטאטוא פיקסלים פעילים ב-sCMOS. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig07.jpg"> איור 7: פתרון בעיות של ASLM. (A) יריעת האור ממוקמת בדיוק במרחק המוקד של עדשת האיתור. ה-ETL סורק את מוקד גיליון האור לאורך כיוון ההתפשטות תוך סנכרון עם הפיקסל המופעל של חיישן sCMOS. (B) תצוגת XY של חרוזים פלואורסצנטיים כאשר ה-ETL מיושר ומסונכרן כראוי. (ג-ד) תוצאות של חרוזים פלואורסצנטיים במישור המוקד וחוסר מיקוד בתמונות חתך, דבר המצביע על חוסר התאמה בין סריקת ETL והתפשטות לייזר. פסי קנה מידה: 200 מיקרומטר ו-10 מיקרומטר בכניסה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66707/66707fig08.jpg"> איור 8: הדמיה של יריעות אור של לבבות עכברים. (A) תמונה מעובדת בנפח של לב העכבר Multiview deconvolution P1 המדגישה את הטרבקולציה בתוך חלל החדר. (B) תמונות חתך רוחב של לב עכבר בן 8 שבועות שנוצרו על-ידי LSM קונבנציונלי (משמאל) ו-ASLM (מימין). התמונות מוצגות כנתונים גולמיים. (C) שילוב של תפירת תמונה ו-ASLM להדמיית לב עכבר בן 8 שבועות, הכולל 12 אריחים המסודרים ב-3 אריחים אופקית ו-4 אריחים במאונך. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. קיצורים: LV: חדר שמאלי, LA: אטריום שמאלי, RV: חדר ימני, ו- RA: אטריום ימני. נתון זה שונה מ- Ref16. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66707/66707fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3">פרוצדורה</td>
			<td>זמן (לב עכבר P1)</td>
			<td>זמן (לב עכבר בן 8 שבועות)</td>
			<td>טמפרטורה</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td colspan="3">תיקון ב-4% PFA</td>
			<td>לילה</td>
			<td>לילה</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="5">הכנת דוגמאות</td>
		</tr><tr><td colspan="3">יש לשטוף עם 1x PBS</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">יש לשטוף עם 1x PBS</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">יש לשטוף עם 1x PBS</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>30 דק'</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">הטמעה עם ג'ל אגרוז</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>2 שעות</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">דגירה ב-20% מתנול/80% מי DI</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>2 שעות</td>
			<td>RT</td>
			<td rowspan="6">התייבשות</td>
		</tr><tr><td colspan="3">דגירה ב-40% מתנול/60% מי DI</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>2 שעות</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">לדגור ב-60% מתנול/40% מי DI</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>2 שעות</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">דגירה ב-80% מתנול/20% DI מים</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>2 שעות</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">לדגור ב-100% מתנול</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>2 שעות</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">לדגור על מתנול טרי 100%</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>2 שעות</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">לדגור על מתנול טרי 100%</td>
			<td>10 דק'</td>
			<td>10 דק'</td>
			<td>4°C</td>
			<td rowspan="3">דה-פיגמנטציה</td>
		</tr><tr><td colspan="3">אקונומיקה עם 5% H2O2/מתנול</td>
			<td>לילה</td>
			<td>לילה</td>
			<td>4°C</td>
		</tr><tr><td colspan="3">לדגור ב-100% מתנול</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>1 שעות</td>
			<td>RT</td>
		</tr><tr><td colspan="3">דליפידט עם 66% DCM/33% מתנול על השייקר</td>
			<td>3 שעות</td>
			<td>3 שעות</td>
			<td>RT</td>
			<td>דליפידציה</td>
		</tr><tr><td colspan="3">לדגור ב-DBE על השייקר</td>
			<td>2 ימים</td>
			<td>5 ימים</td>
			<td>RT</td>
			<td>התאמת RI</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: שלבי ניקוי רקמות מותאמים אישית להדמיית אוטופלואורסצנטיות.

הפרוטוקול משתמש במיקרוסקופ מתקדם של יריעות אור יחד עם שיטות מותאמות לניקוי רקמות כדי לחקור מבנים לבביים מורכבים בלבבות מכרסמים, טומן בחובו פוטנציאל גדול להבנת מורפוגנזה לבבית ועיצוב מחדש.

Light-sheet microscopy (LSM) plays a pivotal role in comprehending the intricate three-dimensional (3D) structure of the heart, providing crucial insights ...

מטרת המחקר שלנו היא להתאים אישית מערכת הדמיה של יריעות אור כדי לחקור את מבני שריר הלב של לב מכרסם שלם ברמה התאית. פיתחנו זרימת עבודה לחקר שריר הלב השלם ברזולוציה איזוטרופית ברמת המיקרון מלבבות יילודים למכרסמים בוגרים. המחקר שלנו ממלא פער בחקירת מיקרו-מבנים מורכבים של שריר הלב, כגון טרבקולציה, בתוך החדרים השלמים, ברזולוציה מרחבית גבוהה.אסטרטגיית הדמיה זו מספקת נקודת כניסה להערכת מיקרו-מבנה ללא חיתוך פיזי, מה שמוביל להבנה משופרת של התפתחות הלב ועיצובו מחדש. נתרכז בחקר השינויים המבניים של שריר הלב בתגובה לפגיעה לבבית ושיפוץ.

light-sheet-imaging-to-reveal-cardiac-structure-in-rodent-hearts

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מאמר זה מתאר טכניקה גבוהה ברזולוציה של זמן ומרחב התנועה תמונה אופטית פעולה פוטנציאל על פני השטח של Langendorff-perfused הלבבות חולדה באמצעות צבע פוטנציומטרית (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

כאן, אנו מתארים את הכנת פרוסות חדר קיימא מעכברים בוגרים ושימוש שלהם עבור הקלטות אלקטרודה פעולה פוטנציאליים חדים. אלה תכשירים תאיים לספק השתמר in vivo כמו מבנה רקמות, מה שהופך אותם מודל יקר עבור מחקרים אלקטרו-פרמקולוגיים במבחנה .

מורין קצר ציר הלב ואת פרוסות הלב עבור מחקרים אלקטרו

מחקר זה משתמש בטכניקה מיקרוסקופ (LSFM) אור גיליונות פלורסצנטיות דו-צדדית תאורה בשילוב עם קרחת אופטי ללמוד את הלב מאתר.

מיקרוסקופ אור גיליונות פלורסצנטיות לחקר הלב מאתר

אנו מתארים כלים ממוטבים לחקר לב דג הזברה ב- vivo עם מיקרוסקופיית פלואורסצנטיות של יריעת אור. באופן ספציפי, אנו מציעים קווים מהונדסים לב בהיר ולהציג טכניקות הטמעה עדינות חדשות ושתקה להימנע מומים התפתחותיים ולב. צינור איסוף וניתוח נתונים אפשרי המותאם להדמיית לב מסופק גם כן.

מיקרוסקופיה קלה של דינמיקת לב מהירה בעוברי דגי זברה

אנו מדווחים על שיטה לשחזור מזוסקופי של לב העכבר כולו על ידי שילוב של התקדמות חדשה בטרנספורמציה וצביעה של רקמות עם פיתוח של מיקרוסקופ אור סרוק אקסיאלי.

הדמיה אופטית מזוסקופית של לב עכבר שלם

כאן אנו מציגים פרוטוקול הדמיה ניסיוני לכימות תפקוד הלב והמורפולוגיה באמצעות טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים ברזולוציה גבוהה/טומוגרפיה ממוחשבת לבעלי חיים קטנים. גם עכברים וגם חולדות נחשבים, דנים בדרישות השונות של חומרי ניגוד טומוגרפיה ממוחשבת עבור שני המינים.

טומוגרפיה של פליטת פוזיטרונים לבביים ברזולוציה גבוהה/טומוגרפיה ממוחשבת לבעלי חיים קטנים

פרוטוקול זה משתמש בהדמיה של יריעות אור כדי לחקור את תפקוד התכווצות הלב בזחלי דגי זברה ולקבל תובנות על מכניקת הלב באמצעות מעקב אחר תאים וניתוח אינטראקטיבי.

הדמיית גיליון אור 4D של התכווצות הלב של דגי זברה

מיקרוסקופיה אופטית ברזולוציה photoacoustic (OR-PAM) היא טכנולוגיה המתעוררים מסוגל קליטה הדמיה אופטית...

תלת ממדית ברזולוציה אופטית photoacoustic מיקרוסקופית

כתב יד זה מתאר את היצירה של רקמות לב מהונדסות מוגדרות באמצעות ביטוי סמני פני השטח ומיון תאים. לאחר מכן ניתן להשתמש ברקמות המוגדרות בביו-ריאקטור רב-רקמתי כדי לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב על מנת לספק מערכת מודל פונקציונלית, אך מבוקרת, של הלב האנושי.

בניית רקמות לב Engineered האנושית תחם לחקור מנגנונים של טיפול בתאי לב

שיטה זו מתארת את השימוש בטומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת קוונטית (MicroCT) כדי להעריך את המורפולוגיה הלבבית, התפקוד, הזלוף, חילוף החומרים והכדאיות עם חומר ניגוד יוד בעכברים עם איסכמיה של שריר הלב המושרה בניסוי. ניתן ליישם את הטכניקה להדמיה אורכית לא הרסנית בתפוקה גבוהה in vivo של מודלים שונים של בעלי חיים של מחלות לב אנושיות.

In vivo כמותי הערכת מבנה שריר הלב, תפקוד, זלוף ואת הכדאיות שימוש טומוגרפיה לב מיקרו שחושב

חקור מבני שריר הלב במכרסמים באמצעות מיקרוסקופיית light-sheet בהתאמה אישית. השיטה מאפשרת הדמייה תלת-ממדית ברזולוציה איזוטרופית ללא חיתוך פיזי של הדגימה, ומספקת הבנה מעמיקה של התפתחות הלב ושינויים מבניים בתגובה לפציעה.

הדמיית יריעות אור לחשיפת מבנה הלב בלבבות מכרסמים

גלה סרטונים נוספים