התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר
25 באוקטובר 2024
פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. באופן ספציפי, בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, ניתן לקבל 90% טוהר של תאי Th17 פתוגניים מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות שיטת התמיינות זו.
מטרת המחקר שלנו היא להתמקד בהתמיינות מכוונת של תאי Th17, ואנו שואפים לחקור שיטה פשוטה להתמיינות מבוא מחדש של תאי Th17, המשמשת כתנאי מסורתי לניסויי מבוא מחדש הקשורים לחלק מתאי Th17 הקשורים למחלות. מחקרים רבים הזכירו את השיטות להחזרה של תאי Th17, והמחקר האחרון התמקד במעכבים מולקולריים קטנים וגירויים אחרים. עם זאת, טוהר השראת הרחם של כמעט כל המחקרים לא היה יציב מעל 50%טכניקות חדשות רבות יושמו על המסך והסירקולציה של תאי Th17, כגון מיון ציטומטריית זרימה של תאי Th17 ומיון חרוזים מגנטיים עבור תאי Th17.
נקודת המפתח היא שמצאנו שיטה פשוטה לגרום להתמיינות תאי Th17, על ידי הוספת ריכוזים שונים של למדיום, וטוהר ההתמיינות שלו יכול להיות קרוב ל -90% המעבדה שלנו, אנו חוקרים את השינויים באימינו-מיקרו-סביבה במודלים של קיפאון עצמי, כולל השינוי בתאי החיסון והכיוון של חוסר איזון חיסוני, וכן הלאה.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר שיטה לגזירה של תאי CD4 + T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים in vitro, תוך השגת רמת טוהר של 90%. הגישה משתמשת בציטומטריית זרימה רב-פרמטרית לצורך ניתוח תאים יעיל.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של התא
- פתולוגיה
רקע
- תאי Th17 ממלאים תפקיד מכריע במחלות אוטואימוניות.
- שיטות מסורתיות להשראתה של דיפרנציאציה ל-Th17 מניבות לעיתים קרובות רמת טוהרה נמוכה.
- התפתחויות אחרונות מתמקדות במעכבים מולקולריים קטנים לשיפור הדיפרנציאציה.
- ציטומטריית זרימה היא טכניקה מרכזית לניתוח אוכלוסיות תאים.
מטרת המחקר
- פיתוח שיטה מהימנה להשראת דיפרנציאציה של תאי Th17.
- השגת רמת טוהר גבוהה של תאי Th17 מובחנים למטרות מחקר.
- בחינת שינויים במיקרו-סביבה החיסונית הקשורים לתאי Th17.
שיטות ששימשו
- בידוד תאי T מסוג CD4+ נאיביים מטחול של עכבר.
- תרבית של תאי T במדייומים ספציפיים עם תערובות הפעלה.
- ניתוח בציטומטריית זרימה להערכת דיפרנציאציה של תאים.
- שימוש במיון באמצעות חרוזי מגנט להעשרת תאים.
תוצאות עיקריות
- 90% מתאי CD4 + T נאיביים התהו ביעילות לתאי Th17 פתוגניים.
- ציטומטריה של זרימה אישרה את רמת הטוהר הגבוהה של התאים שהתהו.
- תנאי תרבית התאים עברו אופטימיזציה לצורך התהוות יעילה.
- תצפית על שינויים במורפולוגיית התאים המעידה על התהוות.
מסקנות
- השיטה המתוארת מספקת גישה פשוטה ויעילה לדיפרנציאציה של תאי Th17.
- דרגת טוהר גבוהה של תאי Th17 יכולה לסייע במחקרים נוספים על מחלות אוטואימוניות.
- ניתן להתאים פרוטוקול זה למערכים ניסיוניים שונים באימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בידוד ובידול in vitro בדרגת טוהר גבוהה של תאי Th17 פתוגניים נותן מענה לצוואר בקבוק קריטי בתהליכי גילוי תרופות הממוקדים באימונולוגיה, ומאפשר תיקוף יעיל יותר של מטרות תרופתיות והפחתת סיכונים מכניסטיים בתוכניות למחלות אוטואימוניות ודלקתיות. השגת טוהר בידול של כ-90% תומכת בביטחון ניבוי בסריקות בשלבים מוקדמים ובמחקרים פונקציונליים, ומשפיעה ישירות על תעדוף הפורטפוליו ועל רציפות המחקר התרגומי. פרוטוקול זה משפר את המהימנות של מודלים תאיים רלוונטיים למחלה עבור צינורות מו"פ ארגוניים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה מעמיקה של מנגנוני מחלה המונעים על ידי Th17 בהקשרים של מחלות אוטואימוניות ודלקתיות.
- תומך בתיקוף פונקציונלי של מטרות על ידי אספקת אוכלוסיות תאי Th17 ברמת טוהר גבוהה ורלוונטיות למחלה.
- מסייע בהפחתת סיכונים מנגנוניים ומגביר את הביטחון החיזוי עבור תוכניות בשלבים מוקדמים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספקת תכשירים סטנדרטיים וניתנים לשחזור של תאי Th17 לצורך סריקת תרכובות בהמשך התהליך.
- משפרת את מהימנות הבדיקה על ידי מזעור ההטרוגניות התאית ומקסום יעילות הדיפרנציאציה.
- מאפשרת הערכה כמותית של השפעות תרכובות על דיפרנציאציה ותפקוד פתוגניים של תאי Th17.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים של Th17 in vitro לסביבות מיקרו-אימונולוגיות רלוונטיות למחלה לצורך מחקרים תרגומיים.
- תומכת ברצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי מתן אפשרות לקריאות תאיות עקביות.
- מפחיתה סיכון ביולוגי בקידום מועמדים לאימונומודולציה המכוונים למסלולי Th17.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת עיבוד
פרוטוקול דיפרנציאציה זה משתלב ברצף שבין שלבי הגילוי המוקדמים לשלב הפרה-קליני, ותומך הן בתיקוף מטרות (target validation) והן בזיהוי מובילים (lead identification) עבור תוכניות למחלות אוטואימוניות ודלקתיות.
- ביולוגיה של גילוי: מספקת פלטפורמה לבדיקת היפותזות ומחקרים מכניסטיים של פתולוגיה המתווכת על ידי Th17.
- סריקה: מספקת תאי Th17 בעלי טוהר גבוה ובצורה הניתנת לשחזור לצורך פיתוח בדיקות והערכת תרכובות.
- אנליטיקה: מאפשרת קריאות כמותיות של ציטומטריה עם זרימה להשוואת יעילות הדיפרנציאציה ותפוקות פונקציונליות.
- מחקר טרנסלציונלי: מגשר בין ממצאים in vitro לתגובות חיסוניות רלוונטיות למחלה במודלים פרה-קליניים.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס פרוטוקול סטנדרטי שניתן להתאימו למספר תוכניות מחקר באימונולוגיה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית במחקר המכוון ל-Th17.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, השחזוריות והיכולת להרחבה (scalability) של ייצור תאי Th17.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת ההחלטות לגבי המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) ואת יעילות ההון בתיקי מחקר של אימונולוגיה.
- השפעה על תיק הפיתוח: תומך בתעדוף מותאם סיכון ובקידום של מועמדים למולקולות מווסתות Th17.
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בבידוד תאים ראשוניים, מיון באמצעות חרוזי מגנט וניתוח בציטומטריה זרימה.
- נדרשת גישה לתשתיות תרביות תאים ולפלטפורמות ציטומטריה זרימה רב-פרמטריות.
- נדרשת סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי גזירה וניתוח.
- ייתכן שיידרש ביצוע התאמות עבור זני עכברים שונים או מודלים של מחלות.
- רמת הטוהר והתנובה עשויות להשתנות בהתאם לאיכות התאים המוחדרים ולעקביות הריאגנטים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:38
Isolation and Preparation of Mice Splenic Single‐Cell Suspension for Flow Cytometry Analysis
3:45
Purification and Analysis of Mice Naive CD4+ T‐Cells Using Magnetic Bead‐Based Negative Selection
5:57
In Vitro Induction of Pathogenic Th17 Cells into Naive CD4+ T‐Cells of Mice
