Name: בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-03T14:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 45 s
Description: למדו בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקסים נשימתיים מדגימות רקמה קטנות ותרביות תאים. שיטה זו מאפשרת חקר ביוגנזה מיטוכונדריאלית וארגון מערכת OXPHOS במחלות שונות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מספר "PGC2018-095795-B-I00" מ- Ministerio de Ciencia e Innovación (https://ciencia.sede.gob.es/) ועל ידי מענקים "Grupo de Referencia: E35_17R" ומענק מספר "LMP220_21" מ- Diputación General de Aragón (DGA) (https://www.aragon.es/) ל- PF-S ו- RM-L.

שבירה מיטוכונדריאלית בדגימות רקמה קטנות לאנליזה סופר-מורכבת

<ol><li>Acin-Perez, R., Fernandez-Silva, P., Peleato, M. L., Perez-Martos, A., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+active+mitochondrial+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Respiratory active mitochondrial supercomplexes.</a> Mol Cell. 32 (4), 529-539 (2008).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplexes+in+the+respiratory+chains+of+yeast+and+mammalian+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Supercomplexes in the respiratory chains of yeast and mammalian mitochondria.</a> EMBO J. 19 (8), 1777-1783 (2000).</li>
<li>Schagger, H., Pfeiffer, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ratio+of+oxidative+phosphorylation+complexes+I-V+in+bovine+heart+mitochondria+and+the+composition+of+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The ratio of oxidative phosphorylation complexes I-V in bovine heart mitochondria and the composition of respiratory chain supercomplexes.</a> J Biol Chem. 276 (41), 37861-37867 (2001).</li>
<li>Acin-Perez, R., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+respiratory+supercomplexes%3A+the+plasticity+model%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">The function of the respiratory supercomplexes: the plasticity model.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 444-450 (2014).</li>
<li>Cogliati, S., Cabrera-Alarcon, J. L., Enriquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+and+functional+role+of+the+electron+transport+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Soc+Trans%22%5BJournal%5D)">Regulation and functional role of the electron transport chain supercomplexes.</a> Biochem Soc Trans. 49 (6), 2655-2668 (2021).</li>
<li>Genova, M. L., Lenaz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+role+of+mitochondrial+respiratory+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Functional role of mitochondrial respiratory supercomplexes.</a> Biochim Biophys Acta. 1837 (4), 427-443 (2014).</li>
<li>Kohler, A., Barrientos, A., Fontanesi, F., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+functional+significance+of+mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">The functional significance of mitochondrial respiratory chain supercomplexes.</a> EMBO Rep. 24 (11), e57092(2023).</li>
<li>Lapuente-Brun, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supercomplex+assembly+determines+electron+flux+in+the+mitochondrial+electron+transport+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Supercomplex assembly determines electron flux in the mitochondrial electron transport chain.</a> Science. 340 (6140), 1567-1570 (2013).</li>
<li>Milenkovic, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preserved+respiratory+chain+capacity+and+physiology+in+mice+with+profoundly+reduced+levels+of+mitochondrial+respirasomes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Preserved respiratory chain capacity and physiology in mice with profoundly reduced levels of mitochondrial respirasomes.</a> Cell Metab. 35 (10), e1797 1799-1813 (2023).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., Fernández-Silva, P. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aMoreno-Loshuertos%2C+R+%22Clinical+Bioenergetics%22">Clinical Bioenergetics</a>. Ostojic, S. , Academic Press. 3-60 (2021).</li>
<li>Fernandez-Vizarra, E., Ugalde, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cooperative+assembly+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">Cooperative assembly of the mitochondrial respiratory chain.</a> Trends Biochem Sci. 47 (12), 999-1008 (2022).</li>
<li>Javadov, S., Jang, S., Chapa-Dubocq, X. R., Khuchua, Z., Camara, A. K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+supercomplexes+in+mammalian+cells%3A+structural+versus+functional+role%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Molecular+Medicine%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory supercomplexes in mammalian cells: structural versus functional role.</a> Journal of Molecular Medicine. 99 (1), 57-73 (2021).</li>
<li>Lopez-Fabuel, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+I+assembly+into+supercomplexes+determines+differential+mitochondrial+ROS+production+in+neurons+and+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Complex I assembly into supercomplexes determines differential mitochondrial ROS production in neurons and astrocytes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (46), 13063-13068 (2016).</li>
<li>Mukherjee, S., Ghosh, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+mechanism+of+mitochondrial+respiratory+chain+assembly+and+its+relation+to+mitochondrial+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Molecular mechanism of mitochondrial respiratory chain assembly and its relation to mitochondrial diseases.</a> Mitochondrion. 53, 1-20 (2020).</li>
<li>Nesci, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+and+supramolecular+structure+of+the+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+system%3A+implications+for+pathology%5BTitle%5D)+AND+%22Life+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Molecular and supramolecular structure of the mitochondrial oxidative phosphorylation system: implications for pathology.</a> Life (Basel). 11 (3), 242(2021).</li>
<li>Frenzel, M., Rommelspacher, H., Sugawa, M. D., Dencher, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ageing+alters+the+supramolecular+architecture+of+OxPhos+complexes+in+rat+brain+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Gerontol%22%5BJournal%5D)">Ageing alters the supramolecular architecture of OxPhos complexes in rat brain cortex.</a> Exp Gerontol. 45 (7-8), 563-572 (2010).</li>
<li>Morant-Ferrando, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fatty+acid+oxidation+organizes+mitochondrial+supercomplexes+to+sustain+astrocytic+ROS+and+cognition%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Metab%22%5BJournal%5D)">Fatty acid oxidation organizes mitochondrial supercomplexes to sustain astrocytic ROS and cognition.</a> Nat Metab. 5 (8), 1290-1302 (2023).</li>
<li>McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+supercomplexes+are+destabilized+in+Barth+Syndrome+patients%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain supercomplexes are destabilized in Barth Syndrome patients.</a> J Mol Biol. 361 (3), 462-469 (2006).</li>
<li>Rosca, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+mitochondria+in+heart+failure%3A+decrease+in+respirasomes+and+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cardiovasc+Res%22%5BJournal%5D)">Cardiac mitochondria in heart failure: decrease in respirasomes and oxidative phosphorylation.</a> Cardiovasc Res. 80 (1), 30-39 (2008).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Garcia-Nino, W. R., Flores-Garcia, M., Pedraza-Chaverri, J., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alteration+of+mitochondrial+supercomplexes+assembly+in+metabolic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Alteration of mitochondrial supercomplexes assembly in metabolic diseases.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1866 (12), 165935(2020).</li>
<li>Gonzalez-Rodriguez, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+mitochondrial+complex+I+induces+progressive+parkinsonism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Disruption of mitochondrial complex I induces progressive parkinsonism.</a> Nature. 599 (7886), 650-656 (2021).</li>
<li>Novack, G. V., Galeano, P., Castano, E. M., Morelli, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplexes%3A+physiological+organization+and+dysregulation+in+age-related+neurodegenerative+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Endocrinol+%28Lausanne%29%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplexes: physiological organization and dysregulation in age-related neurodegenerative disorders.</a> Front Endocrinol (Lausanne). 11, 600(2020).</li>
<li>Ramirez-Camacho, I., Flores-Herrera, O., Zazueta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+relevance+of+the+supramolecular+arrangements+of+the+respiratory+chain+complexes+in+human+diseases+and+aging%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">The relevance of the supramolecular arrangements of the respiratory chain complexes in human diseases and aging.</a> Mitochondrion. 47, 266-272 (2019).</li>
<li>Hollinshead, K. E. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+Supercomplexes+Promote+Mitochondrial+Efficiency+and+Growth+in+Severely+Hypoxic+Pancreatic+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Respiratory Supercomplexes Promote Mitochondrial Efficiency and Growth in Severely Hypoxic Pancreatic Cancer.</a> Cell Rep. 33 (1), 108231(2020).</li>
<li>Ikeda, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+supercomplex+assembly+promotes+breast+and+endometrial+tumorigenesis+by+metabolic+alterations+and+enhanced+hypoxia+tolerance%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial supercomplex assembly promotes breast and endometrial tumorigenesis by metabolic alterations and enhanced hypoxia tolerance.</a> Nat Commun. 10 (1), 4108(2019).</li>
<li>Kamada, S., Takeiwa, T., Ikeda, K., Horie, K., Inoue, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+COX7RP+and+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of COX7RP and mitochondrial oxidative phosphorylation in breast cancer.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 717881(2022).</li>
<li>Marco-Brualla, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+in+the+ND2+subunit+of+mitochondrial+complex+I+are+sufficient+to+confer+increased+tumorigenic+and+metastatic+potential+to+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancers+%28Basel%29%22%5BJournal%5D)">Mutations in the ND2 subunit of mitochondrial complex I are sufficient to confer increased tumorigenic and metastatic potential to cancer cells.</a> Cancers (Basel). 11 (7), 1027(2019).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+hot+can+mitochondria+be%3F+Incubation+at+temperatures+above+43+degrees+C+induces+the+degradation+of+respiratory+complexes+and+supercomplexes+in+intact+cells+and+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">How hot can mitochondria be? Incubation at temperatures above 43 degrees C induces the degradation of respiratory complexes and supercomplexes in intact cells and isolated mitochondria.</a> Mitochondrion. 69, 83-94 (2023).</li>
<li>Vonck, J., Schafer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Supramolecular+organization+of+protein+complexes+in+the+mitochondrial+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Supramolecular organization of protein complexes in the mitochondrial inner membrane.</a> Biochim Biophys Acta. 1793 (1), 117-124 (2009).</li>
<li>Althoff, T., Mills, D. J., Popot, J. L., Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Arrangement+of+electron+transport+chain+components+in+bovine+mitochondrial+supercomplex+I1III2IV1%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Arrangement of electron transport chain components in bovine mitochondrial supercomplex I1III2IV1.</a> EMBO J. 30 (22), 4652-4664 (2011).</li>
<li>Cogliati, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+super-assembly+of+respiratory+complexes+III+and+IV%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of super-assembly of respiratory complexes III and IV.</a> Nature. 539 (7630), 579-582 (2016).</li>
<li>Gonzalez-Franquesa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+proteomics+reveals+mitochondrial+supercomplexome+plasticity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based proteomics reveals mitochondrial supercomplexome plasticity.</a> Cell Rep. 35 (8), 109180(2021).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Features+and+applications+of+blue-native+and+clear-native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Features and applications of blue-native and clear-native electrophoresis.</a> Proteomics. 8 (19), 3974-3990 (2008).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
<li>Garcia-Cazarin, M. L., Snider, N. N., Andrade, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+isolation+from+skeletal+muscle%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial isolation from skeletal muscle.</a> J Vis Exp. (49), e2452(2011).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoresis+for+isolation+of+mitochondrial+oxidative+phosphorylation+protein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Native electrophoresis for isolation of mitochondrial oxidative phosphorylation protein complexes.</a> Methods Enzymol. 260, 190-202 (1995).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Chomyn, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet-mediated+transformation+of+mtDNA-less+human+cells%3A+analysis+of+phenotypic+variability+among+clones+from+normal+individuals--and+complementation+behavior+of+the+tRNALys+mutation+causing+myoclonic+epilepsy+and+ragged+red+fibers%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Platelet-mediated transformation of mtDNA-less human cells: analysis of phenotypic variability among clones from normal individuals--and complementation behavior of the tRNALys mutation causing myoclonic epilepsy and ragged red fibers.</a> Am J Hum Genet. 54 (6), 966-974 (1994).</li>
<li>Moreno-Loshuertos, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differences+in+reactive+oxygen+species+production+explain+the+phenotypes+associated+with+common+mouse+mitochondrial+DNA+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Differences in reactive oxygen species production explain the phenotypes associated with common mouse mitochondrial DNA variants.</a> Nat Genet. 38 (11), 1261-1268 (2006).</li>
<li>Celis, J. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aFern%C3%A1ndez-Vizarra%2C+E+%22Cell+Biology+%28Third+Edition%29%22">Cell Biology (Third Edition)</a>. , Academic Press. 69-77 (2006).</li>
<li>Cogliati, S., Herranz, F., Ruiz-Cabello, J., Enríquez, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Digitonin+concentration+is+determinant+for+mitochondrial+supercomplexes+analysis+by+BlueNative+page%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Digitonin concentration is determinant for mitochondrial supercomplexes analysis by BlueNative page.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1862 (1), 148332(2021).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

ההתאמות המתודולוגיות שהוכנסו בפרוטוקולים המתוארים כאן נועדו למנוע הפסדים ולהגדיל את התשואה תוך שמירה על פעילויות מורכבות במיטוכונדריה (שהיא חיונית כאשר הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות נפגעת) ולשחזר את התבנית הצפויה של SCs ברקמה או בקו התא (ראו איור 2C). למטרה זו ומכיוון שלא נדרש טוהר מיטוכונדריאלי גבוה כדי לזהות כראוי את ה-SCs, מספר השלבים, הזמנים והנפחים הופחתו בכל פעם שהדבר היה אפשרי.
כך, לאחר הומוגניזציה וסילוק גרעינים ותאים בלתי שבורים על ידי צנטריפוגה במהירות נמוכה, הסופרנאטנטים המכילים את המיטוכונדריה מועברים לצינורות פוליפרופילן בנפח 1.5 מ"ל, והצנטריפוגות הבאות להשגת שברי המיטוכונדריה הגולמי מבוצעות במיקרופוגה על ידי הגברת המהירות והפחתת הזמנים והנפחים ביחס לפרוטוקולים קונבנציונליים. זה מאפשר עיבוד של מספר דגימות בזמן קצר יחסית: הערכה קרובה היא שניתן לעבד 10 דגימות ב~2-2.5 שעות (מתחילת ההומוגניזציה (שלב פרוטוקול 1.6. או שווה ערך לרקמות) ועד להשגת חלק SCs מוכן לטעינה בג'ל (שלב פרוטוקול 3.7) וממזער את ההפסדים תוך שמירה על פעילויות. שינוי נוסף ביחס לפרוטוקולים הקבוצתיים המקוריים של Schägger הוא להחליף, לאחר מסיסות הממברנה עבור קבלת שבר SCs, צעד אולטרה-צנטריפוגה בצנטריפוגה מיקרופוגה פשוטה (פרוטוקול שלב 3.4).
ישנם כמה שלבים קריטיים בהליך. ראשית, יעילות שבירת תאים, במיוחד במקרה של תאים בתרבית (ראה הערה לאחר פרוטוקול שלב 1.8) ובמיוחד במקרה של תאים קטנים. רקמות וקווי תאים מציגים דרגת קושי משתנה בשבירת תאים: לדוגמה, בלב ובשריר, שלב זה הוא בדרך כלל פחות יעיל מאשר בכבד או בטחול, אך הוא מפוצה בתשואה מכיוון שלראשונים יש תוכן מיטוכונדריאלי גבוה יותר. חלופה אחת לשיפור תפוקת המיטוכונדריה כאשר מבודדים משריר או לב תהיה טיפול בדגימות עם טריפסין לפני הומוגניזציה. המוח הוא רקמה נוספת המציגה יעילות נמוכה בשבירת תאים בגלל ההומוגניזציה הידנית, שהיא מתונה יותר ויעילה פחות וכנראה גם בגלל השונות הגבוהה יותר בסוגי התאים ברקמה זו, כפי שדווח בעבר 42. ניתן לפצות על כך חלקית על ידי שלב הומוגניזציה שני כפי שמוצע בפרוטוקול שלנו (שלב 2.7.4). מצד שני, אם שבירת התאים מוגזמת, הדגימה הסופית המכילה SCs עלולה להיות מזוהמת במקטעי דנ"א גרעיני שעלולים להפריע לפעולה האלקטרופורטית. בעיה זו מוצגת כעלייה בצמיגות הדגימה כאשר מוסיפים דיגיטונין כדי להמיס את קרומי המיטוכונדריה וניתן לפתור אותה על ידי טיפול ב- DNAse I.
שנית, אם יחס הדטרגנט לחלבון נמוך מדי, התוצאה תהיה מסיסות פחות יעילה של הממברנה ואפשרות להיווצרות אגרגטים. זה יכול להראות בג'לים כרזולוציה ירודה ב-SCs בעלי משקל מולקולרי גבוה (ראו איור 4) או כ-CIV הנותן פסים מרובים המתאימים לאוליגומרים43. אם היחס גבוה מדי, זה יכול להוביל לפירוק של SCs (בעיקר CI-SCs). שלישית, חשוב להימנע מחימום דגימות במהלך כל התהליך (ראו איור 4) ולהימנע ממחזורים חוזרים ונשנים של הקפאה-הפשרה, שכן הם עלולים להשפיע על מצב ההרכבה של SC.
בטבלה 2 מוצג סיכום של התשואות הצפויות עבור מספר סוגי תאים ודגימות רקמות. הערכים משוערים ויהיו תלויים ביעילות שבירת התא ובאופי המקור. במקרה של רקמות, אם חומר המוצא קפוא הוא נוטה לתת תשואה גבוהה יותר מאשר עם דגימות טריות. מוצגת הערכה של מספר הנתיבים (בהתחשב בעומס בין 50 ל-60 מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי לכל נתיב) שניתן להעמיס.
הפרוטוקולים המוצגים כאן מכסים מגוון רקמות וסוגי תאים בווריאציות קטנות, ניתן להשתמש בהם עם דגימות טריות או קפואות ודורשים ציוד פשוט ועלות נמוכה יחסית, שאינה כרוכה בשימוש בערכות טיהור או שיפועים יקרים. עם זאת, הם עשויים להזדקק להתאמות מסוימות כדי לשמש עם סוגי תאים מסוימים או דגימות, כמו גם כאשר אוכלוסיות מיטוכונדריאליות ספציפיות, כגון מיטוכונדריה סינפטית במוח או מיטוכונדריה subsarcolemmal שרירים, למשל, הם מושא הניתוח.
מאחר שעדיין לא הוגדרו התפקידים הפיזיולוגיים המדויקים, כמו גם המעורבות הפוטנציאלית של SCs במצבים פתולוגיים, יש צורך בניתוח הדינמיקה שלהם והגורמים המשפיעים על הרכבתם, יציבותם ותפקודם. הפרוטוקולים שלנו יכולים לייצג כלים יקרי ערך המאפשרים להשיג תוצאות הניתנות לשחזור על תבניות SCs עם דגימות קטנות וממגוון סוגי תאים ורקמות, במיוחד כאשר יש צורך להשוות בין תנאי ניסוי מרובים29.

סופרקומפלקסים (SCs) הם קשרים על-מולקולריים בין קומפלקסים בודדים של שרשרת הנשימה 1,2. מאז הזיהוי הראשוני של SCs ותיאור הרכבם על ידי קבוצת Schägger 2,3, שאושר מאוחר יותר על ידי קבוצות אחרות, נקבע כי הם מכילים מתחמי נשימה I, III ו- IV (CI, CIII ו- CIV, בהתאמה) בסטואיכיומטריות שונות. ניתן להגדיר שתי אוכלוסיות עיקריות של SCs, אלה המכילות CI (ו- CIII בלבד או CIII ו- CIV) ובעלות משקל מולקולרי גבוה מאוד (MW, החל ~ 1.5 MDa עבור SC הקטן יותר: CI + CIII2) ואלה המכילות CIII ו- CIV אך לא CIV, עם גודל קטן בהרבה (כגון CIII2 + CIV עם ~ 680 kDa). SCs אלה מתקיימים יחד בקרום המיטוכונדריאלי הפנימי עם קומפלקסים חופשיים, גם בפרופורציות שונות. לכן, בעוד CI נמצא בעיקר בצורותיו הקשורות (כלומר, ב- SCs: ~ 80% בלב בקר ויותר מ -90% בסוגי תאים אנושיים רבים)3, CIV שופע מאוד בצורתו החופשית (יותר מ -80% בלב בקר), כאשר CIII מראה התפלגות מאוזנת יותר (~ 40% בצורתו החופשית השופעת יותר, כעמום, בלב בקר).
בעוד קיומם מקובל כיום, תפקידם המדויק עדיין נתון לוויכוח 4,5,6,7,8,9,10. על פי מודל הפלסטיות, פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בודדים יכולים להתקיים בהתאם לסוג התא או למצב המטבולי 1,7,11. אופי דינמי זה של ההרכבה יאפשר לתאים לווסת את השימוש בדלקים זמינים ואת היעילות של מערכת הזרחן החמצוני (OXPHOS) בתגובה לשינויים סביבתיים 4,5,7. SCs יכולים גם לתרום לשליטה בקצב ייצור מיני חמצן תגובתי ולהשתתף בייצוב ותחלופה של קומפלקסים בודדים 4,12,13,14. שינויים בסטטוס ההרכבה של SC תוארו בהקשר של מצבים פיזיולוגיים ופתולוגיים שונים15,16 ועם תהליך ההזדקנות17.
לפיכך, שינויים בדפוסי SC תוארו בשמרים בהתאם למקור הפחמן המשמש לצמיחה2 ובתאי יונקים בתרבית כאשר גלוקוז מוחלף בגלקטוז4. שינויים דווחו גם בכבד עכברים לאחר צום8 ובאסטרוציטים כאשר חמצון חומצות השומן המיטוכונדריאלי נחסם18. בנוסף, ירידה או שינויים ב- SCs ו- OXPHOS נמצאו בתסמונת בארת19, אי ספיקת לב20, מספר הפרעות מטבוליות21 ונוירולוגיות 22,23,24, וגידולים שונים 25,26,27,28 . השאלה אם שינויים אלה בהרכבה וברמות SC הם הגורם העיקרי או מייצגים השפעות משניות במצבים פתולוגיים אלה עדיין נחקרת15,16. מתודולוגיות שונות יכולות לתת מידע על הרכבה ותפקוד של SCs; אלה כוללים מדידות פעילות 8,29, ניתוח אולטרה-סטרוקטורלי30,31 ופרוטאומיקה32,33. חלופה שימושית שנמצאת בשימוש הולך וגובר ומהווה את נקודת המוצא לחלק מהמתודולוגיות שהוזכרו לעיל היא הקביעה הישירה של מצב הרכבה SC על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה (BN) שפותחה למטרה זו על ידי קבוצתו של Schägger34,35.
גישה זו דורשת פרוצדורות ניתנות לשחזור ויעילות כדי להשיג ולהמיס קרומי מיטוכונדריה וניתן להשלים אותה על ידי טכניקות אחרות כגון ניתוח פעילות בג'ל (IGA), אלקטרופורזה מממד שני וכתם מערבי (WB). מגבלה במחקרים על דינמיקת SC על ידי אלקטרופורזה BN יכולה להיות כמות התאים ההתחלתיים או דגימות רקמות. אנו מציגים סדרה של פרוטוקולים לניתוח הרכבה ותפקוד SC, המותאמים לשיטות הקבוצה של Schägger, שניתן ליישם על דגימות תאים או רקמות טריות או קפואות החל מ -20 מ"ג רקמה בלבד.

<table><tbody><tr><td>חומצה אצטית</td><td>PanReac</td><td>131008</td><td></td></tr><tr><td>חומצה אמינוקפרואית</td><td>פלוקה אנליטי</td><td>7260</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>ביס טריס</td><td>אקרונים אורגניים</td><td>327721000</td><td></td></tr><tr><td>בדיקת ברדפורד Biorad</td><td></td><td>5000002</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue G-250</td><td>Serva</td><td>17524</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie Blue R-250</td><td>Merck</td><td>1125530025</td><td></td></tr><tr><td>ציטוכרום c</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>C2506</td><td></td></tr><tr><td>דיאמינו&nbsp; בנזידין (DAB)</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5637</td><td></td></tr><tr><td>דיגיטונין</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D5628</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>PanReac</td><td>131669</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>ללא חומצות שומן BSA</td><td>Roche</td><td>10775835001</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>PanReac</td><td>A1067</td><td></td></tr><tr><td>הומוגנייזר עלי טפלון</td><td>Deltalab</td><td>196102</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I2399</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>PanReac</td><td>121512</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>PanReac</td><td>121509</td><td></td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4125</td><td></td></tr><tr><td>מתנול</td><td>Labkem</td><td>MTOL-P0P</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>PanReac</td><td>131404</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell</td><td>BioRad</td><td>1703930</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>MTCO1 נוגדן חד שבטי</td><td>Invitrogen</td><td>459600</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10107735001</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE 3 עד 12% מיני ג'ל חלבון</td><td>Invitrogen</td><td>BN1001BOX</td><td></td></tr><tr><td>תוסף NativePAGE Cathode Buffer (20x)</td><td>Invitrogen</td><td>BN2002</td><td></td></tr><tr><td>NativePAGE מאגר ריצה (20x)&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>BN2001</td><td></td></tr><tr><td>NDUFA9 נוגדן חד שבטי</td><td>Invitrogen</td><td>459100</td><td></td></tr><tr><td>Nitroblue מלח טטרזוליום (NBT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6876</td><td></td></tr><tr><td>Pb(NO3)2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>228621</td><td></td></tr><tr><td>PDVF ממברנה</td><td>Amersham</td><td>10600023</td><td></td></tr><tr><td>Phenazine methasulfate (PMS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9625</td><td></td></tr><tr><td>Pierce ECL מצע</td><td>תרמו מדעי</td><td>32106</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Merck</td><td>PMSF-RO</td><td></td></tr><tr><td>SDHA נוגדן חד שבטי</td><td>Invitrogen</td><td>459200</td><td></td></tr><tr><td>נתרן סוקסינט</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S2378</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטומיצין/פניצילין</td><td>PAN ביוטק</td><td>P06-07100</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S3089</td><td></td></tr><tr><td>Tris</td><td>PanReac</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>UQCRC1 נוגדן חד שבטי</td><td>Invitrogen</td><td>459140</td><td></td></tr><tr><td>XCell&nbsp; SureLock Mini-Cell</td><td>Invitrogen</td><td>&nbsp; EI0001</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

Isolation of Mitochondria for Mitochondrial Supercomplex Analysis from Small Tissue and Cell Culture Samples

במהלך העשורים האחרונים, הראיות שהצטברו על קיומם של סופרקומפלקסים נשימתיים (SCs) שינו את הבנתנו את ארגון שרשרת הובלת האלקטרונים במיטוכונדריה, והולידו את הצעת "מודל הפלסטיות". מודל זה מניח את הדו-קיום של פרופורציות שונות של SCs וקומפלקסים בהתאם לרקמה או למצב חילוף החומרים הסלולרי. האופי הדינמי של ההרכבה ב-SCs יאפשר לתאים לייעל את השימוש בדלקים זמינים ואת יעילות העברת האלקטרונים, למזער את ייצור מיני החמצן הריאקטיביים ולהעדיף את יכולתם של התאים להסתגל לשינויים סביבתיים. 
לאחרונה דווח על חריגות בהרכבת SC במחלות שונות כגון הפרעות נוירודגנרטיביות (אלצהיימר ופרקינסון), תסמונת בארת', תסמונת לי או סרטן. התפקיד של שינויים הרכבה SC בהתקדמות המחלה עדיין צריך להיות מאושר. עם זאת, הזמינות של כמויות מספיקות של דגימות כדי לקבוע את מצב הרכבה SC הוא לעתים קרובות אתגר. זה קורה עם ביופסיה או דגימות רקמה קטנות או שיש לחלק אותן לניתוחים מרובים, עם תרביות תאים שיש להם צמיחה איטית או מגיעים מהתקנים מיקרופלואידים, עם כמה תרביות ראשוניות או תאים נדירים, או כאשר יש לנתח את ההשפעה של טיפולים יקרים מסוימים (עם ננו-חלקיקים, תרכובות יקרות מאוד וכו '). במקרים אלה נדרשת שיטה יעילה וקלה ליישום. מאמר זה מציג שיטה המותאמת להשגת שברים מיטוכונדריאליים מועשרים מכמויות קטנות של תאים או רקמות כדי לנתח את המבנה והתפקוד של SCs מיטוכונדריאליים על ידי אלקטרופורזה טבעית ואחריה בדיקות פעילות בג'ל או כתם מערבי.

תפוקת המיטוכונדריה המתקבלת בעקבות הפרוטוקולים המתוארים לעיל משתנה בהתאם למספר גורמים כגון קו התא או סוג הרקמה, אופי הדגימות (כלומר, אם נעשה שימוש ברקמות טריות או קפואות), או יעילות תהליך ההומוגניזציה. יבולים צפויים של מיטוכונדריה מקווי תאים ורקמות שונים נאספים בטבלה 2. לאחר קבלת השברים המיטוכונדריאליים, השלב הבא הוא ניתוח דפוס SCs נשימתיים, המבוצע לאחר מסיסות הדגימה המיטוכונדריאלית הגולמית וההפרדה האלקטרופורטית על ידי BN-PAGE ואחריו ניתוח IGA או זיהוי חיסוני WB. איור 1 מראה את ההיבט של נתיבי ג'ל לא מוכתמים מיד לאחר הריצה, ואת תבנית הפסים לאחר צביעת קומאסי סטנדרטית של קו תאים בתרבית ודגימת מיטוכונדריה של כבד עכבר.
באיור 2A,B ניתן להבחין בהבדלים ברורים בין תבניות ההרכבה של SC בתאי אדם ועכבר לאחר שימוש במבחני IGA. לכן, קומפלקס חופשי I נצפה בתאי עכבר בעוד שהוא אינו ניתן לגילוי במיטוכונדריה אנושית. תבנית קומפלקס IV-IGA דומה מאוד בשני קווי התאים האנושיים (איור 2B), בעוד שהיא מציגה הבדלים בין שני קווי תאי העכבר שנותחו באיור 2A. הבדלים אלה נובעים מהעובדה שתאי BL6 מבטאים גרסה מוטנטית של SCAF18.
דפוסי SC, המתקבלים עם הפרוטוקול לבידוד מיטוכונדריאלי המתואר כאן לעבודה עם דגימות קטנות, נשמרים ביחס לפרוטוקולים "הקונבנציונליים" המשמשים לדגימות גדולות יותר. ניתן לראות זאת באיור 2C, על-ידי השוואת נתיבים 1 ו-6 (שהתקבלו לאחר בידוד מיטוכונדריאלי באמצעות פרוטוקול קונבנציונלי מ-3 גרם כבד ו-1.1 גרם BAT) עם, בהתאמה, נתיבים 2 ו-5 (שהתקבלו באמצעות הפרוטוקולים שהוצגו כאן מסביבות 0.1 גרם של שתי הרקמות). כפי שהוצע במודל הפלסטיות, החלק היחסי של מתחמי נשימה ו- SCs משתנה בהתאם לסוג התא ולמצב המטבולי. כפי שניתן לראות באיור 2C,D, הרקמות השונות מראות דפוסי הרכבה שונים של SC. לפיכך, מיטוכונדריה במוח מראים רמות נמוכות מאוד של קומפלקס I חופשי ושיעור גבוה יותר של SCs בהשוואה לרקמות אחרות, ו-BAT מאופיין ברמות נמוכות של CV (איור 2A) ובכמויות גבוהות של SC III + IV (איור 2D). מיטוכונדריה בלב מציגים רמות גבוהות של SCs ו-CV. דפוסי הרכבת CV דומים מאוד בין קו התאים בתרבית לבין דגימת מיטוכונדריה של כבד עכבר (איור 2E).
WB יכול גם לנתח את הרכבת SC כפי שמוצג באיור 3 עבור שתי דגימות שהתקבלו מבקרת הטחול ומתאי גידול. במקרה זה, 30-50 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי הם בדרך כלל מספיק כדי לזהות את קומפלקסים שונים SCs עם נוגדנים ספציפיים. איור 4 מראה כמה מהמלכודות העיקריות שיכולות להתרחש במהלך היישום של הפרוטוקולים האלה. שיפועי ג'ל שגויים יכולים לייצר דפוסי נדידה חריגים ולא רצויים כמו באיור 4A, נתיב 1, שבו ה-SCs נשארים קרובים לבאר בחלק העליון של הנתיב עקב ריכוז אקרילאמיד גבוה מהרגיל בג'ל. הדגירה של הדגימות, אפילו לזמנים קצרים יחסית, בטמפרטורות גבוהות (כאן 37°C ו-40°C למשך 10 דקות) גורמת להתכלות של SCs ו-CI (איור 4A , נתיבים 2-4). כמו כן, יחס דטרגנט לחלבון הוא קריטי לתוצאות טובות ורזולוציית ג'ל נאותה. מתחת ליחס של 2 גרם של דיגיטונין/גרם חלבון, רזולוציית הפס מופחתת בהדרגה ובריכוז הנמוך יותר (0.5 גרם/גרם) ניתן לראות רק כתם באזור המתאים ל-SCs (איור 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig01.jpg"> איור 1: תבנית של קומפלקסים וסופר-קומפלקסים מיטוכונדריאליים לאחר הפרדת BNGE של מיטוכונדריה חדירה לדיגיטונין מקו תאי תרבית (L929Balbc) ומכבד עכבר. הנתיבים משמאל (1 ו-2) מייצגים את ההיבט של הג'ל הלא מוכתם מיד לאחר הריצה, שם ניתן לזהות רק קורות חיים, ואילו הנתיבים מימין (3 ו-4) מראים את תבנית הפסים לאחר צביעת קומאסי. קיצורים: BNGE = אלקטרופורזה ג'ל מקורי כחול; CV = V מורכב; SCs = קומפלקסים-על. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig02.jpg"> איור 2: ניתוח IGA של מיטוכונדריה שבודדו מקווי תאים שונים ומרקמות עכבר שונות. (A,B) פעילות בג'ל של הקומפלקסים המצוינים במיטוכונדריה שבודדו מ-(A) עכבר או (B) קווי תאים אנושיים. L929Balbc הוא קו תאים טרנסוכונדריאלי שנוצר במעבדה שלנו על ידי העברת מיטוכונדריה מטסיות עכבר Balb/cJ לתאי ρ°L929neo כפי שתואר קודם40,41. פיברובלסטים BL6 הם קו תאים אימורטלי שנוצר במעבדה שלנו מביופסיה באוזן של עכבר BL6. (C) תבניות CI-IGA ממיטוכונדריה של עכברים שבודדו בשיטה קונבנציונלית המתחילה ב-3 גרם כבד (נתיב 1) ו-1.1 גרם BAT (נתיב 6) או בפרוטוקול המוצג כאן ומתחילה בכ-0.1 גרם רקמה בכל המקרים (נתיב 2, כבד; נתיב 3, לב; נתיב 4, מוח ונתיב 5 BAT). (D) תבניות CIV-IGA (מבוצעות לאחר CI-IGA המוצגות בלוח 2C, נתיבים 2-5) בכבד, בלב, במוח ובמיטוכונדריה של עכברים. (E) פעילות CV-IGA המנותחת בתאי תרבית עכבר ובכבד. בסביבות 60-75 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי בכל נתיב הועמסו. קיצורים: IGA = פעילות בג'ל; SCs = קומפלקסים-על; CI = קומפלקס I; BAT = רקמת שומן חומה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig03.jpg"> איור 3: זיהוי חיסוני WB של קומפלקסים מיטוכונדריאליים וסופרקומפלקסים שונים בדגימות טחול. לאחר הפרדת Blue Native PAGE של קומפלקסים מיטוכונדריאליים ו-SCs שהתקבלו מדגימות בקרת טחול (Spleen M9) וגידול (Tumor M9), הם הועברו לקרום PVDF והכלאה רציפה עם נוגדנים המזהים את תת-היחידות CI, CIII, CIV ו-CII שצוינו (לוחות A-D, בהתאמה). בסביבות 50 מיקרוגרם של חלבון מיטוכונדריאלי הועמסו בכל נתיב. כוכביות מציינות את האות שנותר מכתם מערבי קודם. קיצורים: SC = סופר-מורכב; CI = קומפלקס I; CIII = קומפלקס III; CIV = קומפלקס IV; CII = קומפלקס II. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66771/66771fig04v2.jpg"> איור 4: מלכודות בניתוח SC על-ידי Blue-Native PAGE. CI IGA-אנליזה של מיטוכונדריה שבודדו מ-(A) כבד עכבר טרי ו-(B) כבד חולדה קפוא בתנאי מסיסות שונים. (A) נתיב 1, ריכוז שיפוע ג'ל שגוי (8-13% במקום 3-13% הרגיל). נתיבים 2-4, דגימות מודגרות במשך 10 דקות על קרח או ב 37 ° C ו 40 ° C לפני הטעינה, בהתאמה. (B) תבנית אחרי IGA עבור CI של מיטוכונדריה המתקבלת מכבד חולדה קפוא באמצעות יחסי דיגיטונין/חלבון שונים למסיסות. קיצורים: SC = סופר-מורכב; PAGE = אלקטרופורזה ג'ל פוליאקרילאמיד; CI = קומפלקס I; IGA = פעילות בג'ל. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66771/66771fig04largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>בינוני</td>
			<td colspan="3">הרכב</td>
		</tr><tr><td>חיץ היפוטוני</td>
			<td colspan="3">10 מ"מ MOPS, 83 מ"מ סוכרוז, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>חיץ היפרטוני</td>
			<td colspan="3">30 mM MOPS, 250 mM סוכרוז, pH 7.2</td>
		</tr><tr><td>חוצץ הומוגניזציה A</td>
			<td colspan="3">10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0.32 M סוכרוז, pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>חוצץ הומוגניזציה AT</td>
			<td colspan="3">225 מ"מ מניטול, 1 מ"מ EGTA, 75 מ"מ סוכרוז, 0.01% BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>חוצץ הומוגניזציה AT2</td>
			<td colspan="3">225 מ"מ מניטול, 1 מ"מ EGTA, 75 מ"מ סוכרוז, 0.02% BSA pH 7.4</td>
		</tr><tr><td>מאגר דגימות BN</td>
			<td colspan="3">50 mM NaCl, 50 mM Imidazole, 2 mM חומצה Aminocaproic, 1 mM EDTA pH 7.0</td>
		</tr><tr><td>תמיסת דיגיטונין</td>
			<td colspan="3">10% דיגיטונין ב-50 מ"מ NaCl, 50 מ"מ אימידזול, 5 מ"מ אמינוקפרואיק, 4 מ"מ PMSF</td>
		</tr><tr><td>מאגר טעינה BN</td>
			<td colspan="3">5% קומאסי כחול G ב-0.75 מטר חומצה אמינוקפרואית</td>
		</tr><tr><td>חיץ קתודה BN A</td>
			<td colspan="3">50 mM טריצין, 15 mM Bis-Tris pH = 7.0 (4 ° C), 0.02% G-250 (Coomassie מבריק כחול G-250)</td>
		</tr><tr><td>חיץ קתודה BN B</td>
			<td colspan="3">50 מ"מ טריצין, 15 מ"מ ביס-טריס pH=7.0 (4 °C), 0.002% G-250</td>
		</tr><tr><td>מאגר אנודה BN</td>
			<td colspan="3">50 מ"מ ביס-טריס, pH=7.0</td>
		</tr><tr><td>מצע IGA קומפלקס I</td>
			<td colspan="3">5 מ"מ Tris-HCl pH 7.4, 0.1 מ"ג/מ"ל NADH, 2.5 מ"ג/מ"ל טטרזוליום Nitroblue (NBT)</td>
		</tr><tr><td>מצע IGA קומפלקס II</td>
			<td colspan="3">50 מ"מ אשלגן פוספט חוצץ pH 7.4, 20 mM נתרן סוקצינאט, 0.2 mM פנזין מתוסולפט (PMS), 2.5 מ"ג / מ"ל NBT</td>
		</tr><tr><td>מצע IGA קומפלקס III</td>
			<td colspan="3">50 mM אשלגן פוספט חיץ pH 7.2, 0.05% diaminobenzidine (DAB)</td>
		</tr><tr><td>מצע IGA קומפלקס IV</td>
			<td colspan="3">אותו פתרון כמו CIII בתוספת 50 מיקרומטר ציטוכרום c</td>
		</tr><tr><td>מצע IGA קומפלקס V</td>
			<td colspan="3">35 mM Tris, 270 mM גליצין pH 8.3, 14 mM MgSO4, 0.2% Pb(NO3)2, 8 mM ATP</td>
		</tr><tr><td>פתרון צביעה</td>
			<td colspan="3">צבע קומאסי R-250 ב-0.25% ב-40% מתנול ו-10% חומצה אצטית</td>
		</tr><tr><td>פתרון הקמה/תיקון</td>
			<td colspan="3">40% מתנול, 10% חומצה אצטית</td>
		</tr><tr><td>מאגר העברה</td>
			<td colspan="3">48 מ"מ טריס, 39 מ"מ גליצין, 20% מתנול</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מאגרים והרכב מדיה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>סוג תא/רקמה</td>
			<td>סכום התחלתי</td>
			<td>תפוקה צפויה (מיקרוגרם חלבון מיטוכונדריאלי)</td>
			<td>מספר נתיבים (50-60 מיקרוגרם לנתיב)</td>
		</tr><tr><td>תאים בתרבית</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>מד"א-MB-468</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>300-400 מיקרוגרם</td>
			<td>6-9</td>
		</tr><tr><td>נגזר 143B</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>200-350 מיקרוגרם</td>
			<td>4-7</td>
		</tr><tr><td>פיברובלסטים של עכבר</td>
			<td>100 μL vpc</td>
			<td>150-200 מיקרוגרם</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>לב</td>
			<td>100 מ"ג</td>
			<td>400-500 מיקרוגרם</td>
			<td>10-12*</td>
		</tr><tr><td>שרירי השלד</td>
			<td>100 מ"ג</td>
			<td>300-400 מיקרוגרם</td>
			<td>8-10*</td>
		</tr><tr><td>כבד</td>
			<td>100 מ"ג</td>
			<td>400-500 מיקרוגרם</td>
			<td>8-10</td>
		</tr><tr><td>טחול</td>
			<td>50 מ"ג</td>
			<td>150-250 מיקרוגרם</td>
			<td>3-5</td>
		</tr><tr><td>עטלף</td>
			<td>100 מ"ג</td>
			<td>200-300 מיקרוגרם</td>
			<td>4-6</td>
		</tr><tr><td>מוח</td>
			<td>100 מ"ג</td>
			<td>250-300 מיקרוגרם</td>
			<td>5-8</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: תפוקות צפויות של מיטוכונדריה מסוגי תאים שונים ומרקמות עכבר שונות. השברים המיטוכונדריאליים המתקבלים משרירי הלב או השלד טהורים יותר מאלה המתקבלים מרקמות אחרות. לכן, כמויות קטנות יותר ניתן לטעון בג'לים (*).

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

Over the last decades, the evidence accumulated about the existence of respiratory supercomplexes (SCs) has changed our understanding of the mitochondrial ...

המחקר שלנו מתמקד בהבנה טובה יותר של ביוגנזה מיטוכונדריאלית, בפרט, הארגון והרגולציה של מערכת OXPHOS, וגם בהגדרת התפקיד שהמיטוכונדריה ממלאים במחלות מסרטן ועד הפרעות נוירודגנרטיביות. מיטוכונדריה ממלאים תפקידים מרובים וחיוניים בתא, ומתנים את כל חילוף החומרים וההישרדות שלו. אנו מגדילים בהדרגה את הידע שלנו על מורכבות המיטוכונדריה, ותרומתה למנגנוני הסתגלות תאים בבריאות ובמחלות.תרמנו להקמת מודל ארגוני חדש למערכת OXPHOS, מודל הפלסטיות המשלב הצעות קודמות ומניח דו-קיום של קומפלקסים-על וקומפלקסים חופשיים בפרופורציות שונות כדי לייעל את תפקודו ולאפשר התאמות תאיות. הפרוטוקול שלנו מאפשר להתחיל מרקמות קטנות או דגימות תרבית תאים כדי לקבל מספיק כמויות חלבון מיטוכונדריאלי כדי לנתח קומפלקסים-על, הרכבה וסטטוס ותפקוד על ידי אלקטרופורזה מקורית כחולה או טכניקות אחרות. אנו יכולים לעשות זאת באופן משוחזר בזמן קצר עם ציוד פשוט יחסית עם עלויות נמוכות.

isolation-mitochondria-for-mitochondrial-supercomplex-analysis-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

סרטון זה מתאר את הליך בידוד המיטוכונדריה מרקמות סרטן השחלות האנושיות באמצעות צנטריפוגה במהירות דיפרנציאלית בשילוב עם צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. המיטוכונדריה המבודדת יכולה לשמש לניתוח פרוטאומי של פרוטאום מיטוכונדריאלי של סרטן השחלות האנושי.

בידוד מיטוכונדריאלי: טכניקה לבידוד מיטוכונדריה מדגימת רקמת סרטן השחלות האנושית

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא &lt;30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

כמו המיטוכונדריה הם רק אחוז קטן של תא צמח, הם צריכים טיהור למגוון רחב של מחקרים. המיטוכונדריה ניתן לבודד מתוך מגוון איברי הצמח על ידי המגון, ואחריו דיפרנציאלית וצפיפות צנטריפוגה מעבר צבע כדי לקבל חלק מיטוכונדריאלי נקיים במיוחד.

בידוד, מדידות הנשימה של המיטוכונדריה מ תודרנית לבנה

המיטוכונדריה המתמחה הריבוזומים זה שונה מהקבצים המקבילים בקטריאליים ו cytoplasmic. הנה אנחנו מראים כיצד ניתן להשיג mitoribosomes שלהם בתא הילידים HEK תאים. השיטה כוללת בידוד של המיטוכונדריה מתאי ההשעיה ולטיהור הסוגר mitoribosomes.

בידוד מהיר של Mitoribosome מתאי HEK

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

במאמר זה אנו מציגים אוסף של בדיקות למדידה ישירה של תפקוד המיטוכונדריה בתאי יונקים ללא תלות ביכולתם לצרוך חמצן מולקולרי.

בדיקות שאינן תלויות בחמצן למדידת תפקוד המיטוכונדריה ביונקים

אנו מציגים פרוטוקול דו-שלבי לבידוד מיטוכונדריה באיכות גבוהה התואם לגילוי וכימות חלבונים בקנה מידה של פרוטאום. הפרוטוקול שלנו אינו דורש הנדסה גנטית ולכן מתאים לחקר מיטוכונדריה מכל תא ורקמות ראשוניים.

בידוד דו-שלבי ללא תגים של מיטוכונדריה לשיפור גילוי וכימות חלבונים

מחקרים ביואנרגטיים ומטבוליים על מיטוכונדריה חשפו את תפקידם הרב-גוני במחלות רבות, אך שיטות הבידוד של אברונים אלה משתנות. השיטה המפורטת כאן מסוגלת לטהר מיטוכונדריה באיכות גבוהה ממקורות רקמה מרובים. האיכות נקבעת על ידי יחסי בקרת נשימה ומדדים אחרים המוערכים עם רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

למדו בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקסים נשימתיים מדגימות רקמה קטנות ותרביות תאים. שיטה זו מאפשרת חקר ביוגנזה מיטוכונדריאלית וארגון מערכת OXPHOS במחלות שונות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים

גלה סרטונים נוספים