הקמת מודל חולדה זעיר פולשני של תסחיף ריאתי באמצעות קרישי דם אוטולוגיים
25 באוקטובר 2024
מתוארת מתודולוגיה מפורטת להקמת מודל חולדה זעיר פולשני של תסחיף ריאתי באמצעות קרישי דם אוטולוגיים. ניתנות גם שיטות נוספות לכימות האזור האוטם ולהמחשת עץ העורקים הריאתי.
היקף המחקר שלנו הוא לשפר את האמינות והשחזור של מודלים של מכרסמים לתסחיף ריאתי המחקים פתופיזיולוגיה אנושית. אנו שואפים לענות על האופן שבו טכניקות זעיר פולשניות משמשות להשראת מודלים של PE, בתקווה שהן יקלו על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות. הפרוטוקולים שלנו מייצרים קרישי דם אוטולוגיים בצורה סטנדרטית ומושרים מודלים של PE מכרסמים כירורגיים עם פולשניות מינימלית, ובכך משפרים את האמינות והשחזור של ניסויים בבעלי חיים PE. גילינו כי רזולוציית הקרישים מהירה במכרסמים. זה מסביר מדוע קשה לבסס מודל יתר לחץ דם ריאתי טרומבואמבולי כרוני. טכניקות הדמיית הקרישים כאן ינחו את הפיתוח של מודל חיות CTAP אמין. אנו מעבדה משותפת הן של הנדסה ביו-רפואית והן של צוותי לב וכלי דם קליניים. עם מודל זה, המעבדה שלנו תתמקד בפיתוח אסטרטגיות חדשות למניעת פקקת וסיבוכים עבור PE המבוססות על פתרונות מתקדמים לביו-חומרים.
[קריין] כדי להתחיל, מקם את החיה המורדמת על משטח הניתוח במצב שכיבה. הארך את שתי ארבע הגפיים אופקית מהגוף והאריך את הגפיים האחוריות כדי לחשוף כראוי את אזור המפשעה. בעזרת סרט רפואי, אבטח את החיה במצב זה. השתמש במכונת גילוח חשמלית כדי לגלח את השיער סביב עצם החזה והמפשעה. לאחר מכן יש למרוח קרם להסרת שיער על שאריות השיער, ולחטא את העור שלוש פעמים עם יוד פובידון. הכנס מחט בגודל 27 המחוברת למזרק מיליליטר אחד אנכית לעומק של שמונה מילימטרים כדי לנקב את הווריד הנבוב הגולגולתי השמאלי או הימני. לאחר מכן החזק את המזרק ומשוך בעדינות את הבוכנה לאחור כדי ליצור לחץ שלילי בתוך הקנה. משוך את המחט בהדרגה עד שהדם זורם פנימה. לאחר מכן שמור על עמדה זו עד לאיסוף 0.3 מיליליטר דם. להכנת קרישי דם, דחף את הדם שנאסף לתוך צינור צנטריפוגה של 1.5 מיליליטר. לאחר מכן משוך את הדם לצינור הסיליקון של מחולל הפקקת מתוצרת עצמית עד שאורך עמוד הדם הוא 10 סנטימטרים. המתינו 30 דקות כדי לאפשר לדם להיקרש. לאחר מכן שטפו את עמוד הדם הפקקתי לצלחת פטרי המכילה מי מלח רגילים. לאחר מכן בעזרת מספריים עדינים חותכים את עמוד הפקקת לקרישי דם אחידים, כל אחד באורך ארבעה מילימטרים. שאב 15 עד 25 קרישים למזרק מתוצרת עצמית הממולא מראש בשני מיליליטר של מי מלח רגילים. לאחר חיטוי אזור הניתוח של החולדה המורדמת, בצע חתך עור של חמישה מילימטר מעל מקור כלי האפיגסטרי השטחיים באזור המפשעה. בעזרת מיקרוסקופ סטריאו בהגדלה פי 10, הפרד שכבה דקה של שומן תת עורי כדי לחשוף את כלי הדם האפיגסטריים השטחיים. בודד בזהירות את הווריד האפיגסטרי השטחי מרקמת העורק, העצב והשומן. לאחר מכן שלוט בצד הדיסטלי עם 8-0 תפר סטרילי ומהדק את התפר בעזרת מהדק מיקרו. שלוט בצד הפרוקסימלי עם 8-0 לולאת תפר סטרילית המחוברת למיקרו מהדק אחר. קושרים את הלולאה הדיסטלית ומעבירים את הווריד בעזרת צריבה לאחר מכן, בצע חתך רוחבי זעיר בצד הדיסטלי של הווריד המבודד ושטוף את הדם שנותר בלומן הווריד במי מלח רגילים. לאחר שהווריד נקי, השתמש בפינצטה מיקרו כדי להגדיל את החתך הוורידי. לצורך אמבוליזציה, הכנס בעדינות את המחט של המזרק מתוצרת עצמית לווריד דרך חתך הוורידים. אבטח את המחט בעזרת מהדק שלישי כדי למנוע ממנה להחליק מהווריד. לאחר מכן דחף לאט את הבוכנה כדי לתת כמות קטנה של מי מלח רגילים. המשך לדחוף את הבוכנה כדי לתת קרישים לווריד הירך דרך הגישה השטחית לווריד האפיגסטרי. קשרו את הווריד עם התפר הפרוקסימלי. לבסוף, תפר את החתך. לאחר המתת חסד של החולדה במינון יתר של איזופלורן, חתכו את הצלעות במספריים גדולות ופתחו את החזה תוך הימנעות מנזק לריאות ולכלי הדם הגדולים. כעת הכנס את המחט של מכשיר העירוי לחדר השמאלי. פתח את השסתום של מכשיר העירוי כדי לאפשר עירוי מי מלח הפריני. בעזרת מספריים חותכים את הווריד הנבוב התחתון ואת התוספת השמאלית כדי לאפשר ניקוז. שלוט במהירות הזלוף ב -50 מיליליטר לדקה. לאחר הזלוף, באמצעות מזרק של 10 מיליליטר מלא בתמיסת פרפורמלדהיד של ארבעה אחוזים, יש לנקב את תא המטען של עורק הריאה דרך החדר הימני. תקן את רקמת הריאה על ידי ביצוע שפע של ארבעה אחוזים פרפורמלדהיד דרך הריאות לנפח כולל של 30 מיליליטר. להדמיה של עץ עורקי ריאה, הוסף כמות שווה של מדלל לתרכובת יציקת הסיליקון. לאחר ערבוב התערובת, מוסיפים חומר ריפוי של חמישה אחוזים ומערבבים שוב את התערובת. ואז משוך מיליליטר אחד מהתערובת למזרק של מיליליטר אחד. מוציאים את האוויר ומכניסים את המחט לתא המטען של עורק הריאה דרך החדר הימני. לחץ בעדינות על הבוכנה כדי לאפשר לתערובת יציקת הסיליקון למלא את עץ עורק הריאה. מניחים את כל המסה בצלחת פטרי לפני שמאחסנים אותה במקרר של ארבע מעלות צלזיוס למשך הלילה כדי לאפשר לתערובת היציקה להתגבש. טבלו את הריאות ברצף בתמיסות אלכוהול אתילי של 25%, 50%, 75%, 95% ו-100% כל אחת למשך 24 שעות. טבלו את הריאות המיובשות במתיל סליצילאט למשך 24 שעות. מיד לאחר התסחיף, הריאות שחולצו הראו קרישי דם אוטולוגיים ואזורים עם אוטם ריאות. עומס גבוה יותר של תסחיפים הביא לשטח גדול יותר של אוטם ריאות. בהשוואה לדגימות ריאה שנלקחו מיד לאחר האמבוליזציה, דגימות הריאה שנאספו 24 שעות לאחר האמבוליזציה הראו ירידה ניכרת באזורי האוטם המעידים על פוטנציאל פיברינוליזה פנימי חזק בחולדות. איור זה מציג את עץ עורקי הריאה לאחר יציקה וניקוי רקמות לריאות תקינות ולריאות של תסחיף ריאתי.
סקירה כללית
מאמר זה מפרט מתודולוגיה להקמת מודל חולדה זעיר-פולשני של תסביב ריאתי (PE) באמצעות קרישי דם אוטולוגיים. כמו כן, הוא מתאר טכניקות לכימות של אזור האינפארקציה ולהדמיית עץ העורקים הריאתיים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- מחקר קרדיווסקולרי
- מודלים של בעלי חיים
רקע
- מודלים של מכרסמים חיוניים לחקר תסביב ריאתי.
- טכניקות זעיר-פולשניות יכולות לשפר את המהימנות של מודלים אלה.
- הבנת תהליך הפירוק של קרישי דם היא חיונית לפיתוח מודלים כרוניים.
- שיתוף פעולה בין צוותים של הנדסה ביו-רפואית לצוותים קליניים משפר את תוצאות המחקר.
מטרת המחקר
- לשיפור האמינות והשחזוריות של מודלים של PE.
- להקל על פיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשות עבור PE.
- לספק פרוטוקולים מפורטים להשראה של PE במכרסמים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- הכנת קרישי דם אוטולוגיים מדם שנאסף.
- טכניקות כירורגיות פולשניות ברמה מינימלית עבור אמבוליזציה.
- ויזואליזציה של עץ העורקים הריאתיים באמצעות יציקת סיליקון.
- כימות של אזורי אוטם ריאתי לאחר אמבוליזציה.
תוצאות עיקריות
- פירוק מהיר של קרישי דם במכרסמים מקשה על הקמת מודל של תסחיף ריאתי (PE) כרוני.
- עומסי תסחיפים גבוהים יותר נמצאים במתאם עם שטחי אוטם גדולים יותר.
- נצפה פוטנציאל פיברינוליזה פנימי משמעותי בחולדות.
- פותחו טכניקות ויזואליזציה יעילות עבור מבני העורקים הריאתיים.
מסקנות
- המודל המתואר משפר את חקר התסביב הריאתי.
- טכניקות זעיר-פולשניות עשויות להוביל לאסטרטגיות טיפוליות טובות יותר.
- מחקר עתידי יכול להתבסס על שיטות אלו להשגת תוצאות משופרות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
מודלים פרה-קליניים אמינים של תסחיף ריאתי חיוניים למחקר תרגומי ולהשפעה טיפולית במחלות קרדיווסקולריות. מודל חולדה זעיר-פולשני זה, המשתמש בקרישי דם אוטולוגים סטנדרטיים ובהערכה כמותית של השבץ (infarct), נותן מענה לאתגרי השחזור וההשוואה בין מחקרים בשלבים מוקדמים של גילוי תרופות. דיוק מודרני משופר תומך בביטחון חיזוי ובקבלת החלטות מותאמות סיכונים עבור התערבויות חדשניות לטיפול ב-PE.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של הפתופיזיולוגיה של PE במערכת מכרסמים מבוקרת וניתנת לשחזור.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי מידול דינמיקה של היווצרות ופירוק קרישי דם הרלוונטית לבני אדם.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור אסטרטגיות למניעת תסחיפים קרישיים וסיבוכים.
סריקה ופיתוח בדיקות
- מספקת פלטפורמה סטנדרטית להערכת תרופות מועמדות המכוונות ליצירת קרישי דם או לפירוקם.
- מספקת מדידות כמותיות של שטח האוטם להשוואת יעילות התרכובות.
- משפרת את השחזור של הבדיקה ואת ההשוואה של נתונים בין מחקרים באמצעות סטנדרטיזציה של הפרוטוקול.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם נקודות קצה רלוונטיות למחלה על ידי מידול של PE חריף ופיברונוליזה אינטרינזית in vivo.
- מאפשר רצף מגילוי מנגנוני ועד לתיקוף פרה-קליני של התערבויות מבוססות חומרי ביומטריים.
- תומך בקידום של טיפולים ב-PE עם התאמה לסיכונים, על ידי הבהרת מגבלות המודל עבור מחלה כרונית.
שילוב תהליכי עבודה (Pipeline) וזרימת עבודה
מודל זה משתלב ברצף השלב שבין הגילוי למחקרים פרה-קליניים עבור PE, ומגשר בין מחקרים מכניסטיים מוקדמים לבין הערכה של מועמדים.
- ביולוגיה של גילוי: השראה ומיגלוס סטנדרטיים של קרישי דם מבהירים את מנגנוני ה-PE ואת התגובה הביולוגית.
- סריקה: הערכה כמותית של התסמים מאפשרת השוואות יעילות חסונות בין תרכובות שונות.
- אנליטיקה: תומכת בניתוח סטטיסטי של גודל התסמים ופירוק הקרישיים לצורך קבלת החלטות מבוססת נתונים.
- מחקר תרגומי: מספקת פלטפורמה לבדיקה של התערבויות בביומטריאליים ובתרופות בהקשר הרלוונטי למחלה.
- שימוש חוזר ארגוני: סטנדרטיזציה של הפרוטוקול מאפשרת אימוץ רחב בקרב צוותי מחקר קרדיווסקולריים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בניבויים ומפחית עמימות מכניסטית במחקר PE.
- ערך תפעולי: משפר את השחזוריות, את יכולת ההרחבה (scalability) ואת ההשוואתיות בין מעבדות.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות של "המשך/עצור" (go/no-go) ומבצע אופטימיזציה של הקצאת משאבים עבור תוכניות טיפוליות של PE.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכון של מועמדים ל-PE וטכנולוגיות פלטפורמה.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות במיקרו-כירורגיה של מכרסמים ובטכניקות של גישה כלי דם.
- נחוש גישה לתשתיות של דימיון, פרפוזיה והבהרה של רקמות לצורך ויזואליזציה עורקית.
- מחייב הקפדה על הפרוטוקול לצורך סטנדרטיזציה בין צוותים ויכולת שחזור.
- ההתאמה למינים אחרים של מכרסמים או למודלים כרוניים של PE עשויה להיות מוגבלת בשל פירוק מהיר של הקריש.
- המודל מותאם ל-PE חריף ועשוי שלא לשחזר באופן מלא מחלה תרומבואמבולית כרונית.
