Name: בניית מודל קסנוגרפט אורתוטופי של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים המחקה את התקדמות המחלה ומנבא פעילויות תרופתיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-10T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: חקור מודל קסנוגרפט אורתוטופי לסרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים באמצעות שתלת ספירואידים רב-תאיים של תאי A549-iRFP. שיטה זו מאפשרת מעקב דינמי של התקדמות הגידול ותגובה לטיפול בסיספלטין בזאבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכה על ידי מענקי SAAG ו- SEED מאוניברסיטת האוקיינוס השקט. אנו מודים לד"ר ויליאם צ'אן על מתן גישה למערכת Odyssey Infrared Imaging 205 ולד"ר ג'ון לייבסי על מתן גישה לקורא הלוחות SpectraMax iD3. אנו מודים לד"ר מלאני פלמלי על הייעוץ הטכני בנוגע לפרוטוקולים של בעלי חיים.

המחקר בבעלי חיים בוצע באישור הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת האוקיינוס השקט (פרוטוקולים לבעלי חיים 19R10 ו-22R10). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בשמונה עכברים עירומים אתימיים זכרים בגילאי 5-6 שבועות, במשקל 20-25 גרם, שגודלו עם דיאטת המכרסמים הנזכרת ושוכנו בתנאים נטולי פתוגן (SPF). כלובים, מצעים ומי שתייה הוחלפו והוחלפו באופן קבוע. סכמה של חיסון גידולי בעכברים מוצגת באיור 1. עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים והמכשירים המשמשים בפרוטוקול זה.
1. הקמת MCS תלת מימדי של תאי A549-iRFP
<ol><li>לדגור על תאי A549-iRFP (אדנוקרצינומה של ריאות אנושיות) באטמוספירה לחה עם 5% CO2 ב-37°C ולגדל אותם ב-DMEM בינוני לצמיחה מלאה המכיל 10% נסיוב בקר עוברי, 1% פניצילין-סטרפטומיצין ו-1 מיקרוגרם/מ"ל פורומיצין.</li>
	<li>זרעו תאי A549-iRFP למיקרו-פלטה ספרואידית בעלת תחתית עגולה של 96 בארות בצפיפות זריעה של 4,000 תאים/באר, תוך שימוש ב-100 מיקרוליטר של מדיום גידול מלא בתוספת 0.3% קולגן.</li>
	<li>צנטריפוגה את microplates ב 300 × גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C כדי להקל על היווצרות MCS. בחן את המורפולוגיה של MCS תחת מיקרוסקופ כדי להבטיח צבירת תאים לאחר צנטריפוגה.</li>
	<li>לאחר 48 שעות, הוסף 100 μL של מדיום צמיחה מלא לכל באר כדי להשיג נפח כולל של 200 μL של מדיום צמיחה לכל באר.</li>
	<li>החלף 100 μL של מדיום גידול בכל באר עם מדיום צמיחה מלא טרי כל יומיים.</li>
</ol>2. אפיון A549-iRFP MCS
<ol><li>התבונן וצלם את המורפולוגיה של MCS באמצעות מיקרוסקופ והערך את נפח MCS על ידי סימולציה עם התוכנה המוזכרת מ- MATLAB בהתבסס על תמונות מיקרוסקופ ניגודיות פאזה.<ol><li>פתח תמונת MCS אחת בתוכנת ImageJ.</li>
		<li>השתמש בבחירות Freehand כדי לבחור את הקצה של MCS ולהוסיף אותו למנהל החזר ההשקעה.</li>
		<li>לחץ על ערוך | בחירה | צרו מסיכה.</li>
		<li>לחץ על ערוך | הפוך.</li>
		<li>לחץ על קובץ | שמירה בשם | טיף.</li>
		<li>פתח את תוכנת ReViSP.</li>
		<li>פתח את תמונת TIFF שנשמרה על-ידי לחיצה על עיון.</li>
		<li>לחץ על התחל כדי להשלים את סימולציית MCS.</li>
	</ol></li>
	<li>מדוד את האות הפלואורסצנטי iRFP באמצעות מערכת דימות אינפרא אדום בערוץ 700 ננומטר וכמת את האות הפלואורסצנטי באמצעות תוכנה (לדוגמה, Image Studio).<ol><li>תוכנת Open Image Studio.</li>
		<li>בכרטיסיה ערוצים, בחר 700 ועוצמה = 5.</li>
		<li>בכרטיסיה פקדי סריקה , בחר 84 מיקרומטר, בינוני, 0.0 מ"מ והפוך תמונה. שמור את כל השאר כברירת מחדל.</li>
		<li>לחץ על התחל כדי להתחיל בסריקה.</li>
	</ol></li>
	<li>הערך וכמת את כדאיות התא באמצעות בדיקת כדאיות התא התלת-ממדית בהתאם לפרוטוקול הספק.</li>
	<li>להעריך ולכמת חלבון תאי באמצעות בדיקת BCA בהתאם לפרוטוקול הספק.</li>
</ol>3. בחירת MCS לחיסון הגידול
הערה: לאחר ש-MCS נזרעים לתוך מיקרו-צלחות ספרואידיות ומגודלים במשך 2-3 שבועות עם חילופי מדיום גידול קבועים, בחר MCS עם המאפיינים המתאימים הבאים לחיסון הגידול.
<ol><li>התבוננו במורפולוגיה של MCS תחת מיקרוסקופ ובחרו MCS עם צורה עגולה עם קצוות חלקים באופן כללי, אבל עם 5-10 ניצנים מחוספסים (חצים באיור 2F) וקוטר בטווח של 700-800 מיקרומטר.</li>
	<li>מדוד את הפלואורסצנטיות של iRFP (עיין בשלב 2.2) ובחר את MCS שהאותות הפלואורסצנטיים שלו נמצאים בסטיית תקן אחת מהממוצע.</li>
</ol>4. חיסון MCS תוך ריאתי
הערה: יש להשתמש בתרסיס איזופרופיל אלכוהול 70% כדי לנקות את תחנת הניתוח ואת הכלים לפני הטיפול בבעלי החיים.
<ol><li>להרדים כל עכבר בהזרקת IP של 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-12 מ"ג/ק"ג קסילזין; צבטו את רגלי העכבר במלקחיים כדי להבטיח הרדמה מלאה.</li>
	<li>להזריק 10 μL של buprenorphine hydrochloride (0.3 מ"ג / מ"ל) תת עורית כדי להפחית את הכאב.</li>
	<li>החל משחה אופתלמית על העיניים כדי למנוע יובש.</li>
	<li>הניחו את העכבר בתנוחה גבית ואבטחו את הגפיים במצב מתיחה בעזרת קלטות.</li>
	<li>לעקר את העור האחורי עם מקלות יוד ואלכוהול.</li>
	<li>חתכו חתך של 0.5-1 ס"מ באמצעות מספריים כירורגיים בצד שמאל האחורי (איור 1B). השתמש בזהירות במלקחיים כדי להפריד את רקמות השריר והשומן עד שקיר החזה ותנועת הריאות נראים לעין.</li>
	<li>העבירו MCS נבחר אחד ממיקרו-צלחת לצלחת פטרי מזכוכית המכילה PBS קר כקרח, באמצעות פיפטה.</li>
	<li>חברו מחט של 20 גרם למזרק זכוכית של 100 מיקרוליטר, קררו אותם מראש על קרח ושאבו 20 מיקרוליטר של תערובת מקוררת מראש של PBS ומטריג'ל (1:1 v/v).</li>
	<li>השתמש במזרק כדי לשאוף במהירות MCS אחד מצלחת פטרי בנפח מינימלי של תערובת PBS-Matrigel, תוך שמירה על MCS בחלק המתכתי של המחט. הערה: שמור על אחיזה הדוקה במזרק ובבוכנה כדי למנוע מה-MCS להחליק החוצה מהמחט.</li>
	<li>הכנס בעדינות את המחט במאונך בין שתי עצמות צלעות לעומק ~3 מ"מ והזריק לאט את כל תערובת PBS ומטריג'ל 20 μL המכילה את MCS. הערה: יש להימנע משימוש בכוח מופרז במהלך ההחדרה כדי למנוע נזק לריאה, לכלי הדם או ללב.</li>
	<li>בזהירות להסיר את המחט ולהחיל משחה אנטיביוטית משולשת על הפצע.</li>
	<li>לאטום את החתך עם קליפים כירורגיים, אשר יוסרו לאחר 2 שבועות. הערה: אין לתפור את החתך מכיוון שקווי התפרים עלולים להפריע להדמיית פלואורסצנטיות. העכברים העירומים מסוגלים להחלים באופן טבעי לאחר הניתוח.</li>
	<li>הניחו את בעל החיים על כרית חום אינפרא אדום וכסו אותו במגבוני מעבדה כדי לשמור על טמפרטורת הגוף. לפקח על החיה לפחות 30-60 דקות עד שהוא מתעורר ונע כראוי.</li>
	<li>הזריקו 10 μL של buprenorphine hydrochloride (0.3 מ"ג / מ"ל) תת עורית 3 פעמים ביום במשך 48 השעות הראשונות כדי להפחית את הכאב.</li>
</ol>5. ניטור לאחר ניתוח
<ol><li>למדוד את משקל הגוף כל 3-4 ימים.</li>
	<li>מדוד את האות הפלואורסצנטי iRFP מהגידול xenograft כל 3-4 ימים על מערכת הדמיה של בעלי חיים קטנים בערוץ 700 ננומטר בארבע תנוחות: שמאל, ימין, גבי וגחוני, בעוד העכברים נשמרים תחת הרדמה על ידי שאיפת איזופלורן (קצב זרימה: 1.5-2 ליטר / דקה חמצן המכיל 1.5% איזופלורן) במשך 2-3 דקות.</li>
	<li>כמת את העוצמה הפלואורסצנטית נטו של סרטן xenograft in vivo באמצעות תוכנה (למשל, Image Studio).<ol><li>השתמש במלבן קבוע (A1, 200 x 125 פיקסלים) כחלון הדגימה לאזור החזה של העכברים.</li>
		<li>השתמש בפונקציית היד החופשית כדי לעקוב אחר צורת העכברים בתוך המלבן (A1) ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנט (F1) באזור A1.</li>
		<li>השתמש במלבן קטן יותר (A2, 25 x 40 פיקסלים) כדי למדוד את פלואורסצנטיות הרקע (F2) של העכברים באזור הירך.</li>
		<li>השתמש במשוואה (1) כדי לחשב את עוצמת הפלואורסצנט נטו של סרטן xenograft בכל עכבר: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/66787/66787eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol></li>
</ol>

חיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב תאיים למודל NSCLC אורתוטופי

<ol><li>Siegel, R. L., Miller, K. D., Jemal, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+statistics%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Cancer statistics.</a> CA Cancer J Clin. 70 (1), 7-30 (2020).</li>
<li>Bray, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+cancer+statistics+2018%3A+Globocan+estimates+of+incidence+and+mortality+worldwide+for+36+cancers+in+185+countries%5BTitle%5D)+AND+%22CA+Cancer+J+Clin%22%5BJournal%5D)">Global cancer statistics 2018: Globocan estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries.</a> CA Cancer J Clin. 68 (6), 394-424 (2018).</li>
<li>Travis, W. D., Brambilla, E., Riely, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+pathologic+classification+of+lung+cancer%3A+Relevance+for+clinical+practice+and+clinical+trials%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Oncol%22%5BJournal%5D)">New pathologic classification of lung cancer: Relevance for clinical practice and clinical trials.</a> J Clin Oncol. 31 (8), 992-1001 (2013).</li>
<li>Ducote, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+artificial+intelligence+to+identify+tumor+microenvironment+heterogeneity+in+non-small+cell+lung+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Invest%22%5BJournal%5D)">Using artificial intelligence to identify tumor microenvironment heterogeneity in non-small cell lung cancers.</a> Lab Invest. 103 (8), 100176(2023).</li>
<li>Lim, Z. F., Ma, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+insights+of+tumor+heterogeneity+and+drug+resistance+mechanisms+in+lung+cancer+targeted+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hematol+Oncol%22%5BJournal%5D)">Emerging insights of tumor heterogeneity and drug resistance mechanisms in lung cancer targeted therapy.</a> J Hematol Oncol. 12 (1), 134(2019).</li>
<li>Wang, D. C., Wang, W., Zhu, B., Wang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer+heterogeneity+and+new+strategies+for+drug+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pharmacol+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Lung cancer heterogeneity and new strategies for drug therapy.</a> Annu Rev Pharmacol Toxicol. 58, 531-546 (2018).</li>
<li>Peterson, J. K., Houghton, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+pharmacology+and+in+vivo+cancer+models+in+preclinical+and+clinical+drug+development%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cancer%22%5BJournal%5D)">Integrating pharmacology and in vivo cancer models in preclinical and clinical drug development.</a> Eur J Cancer. 40 (6), 837-844 (2004).</li>
<li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Surg+Oncol%22%5BJournal%5D)">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surg Oncol. 21 (1), 23-29 (2012).</li>
<li>Mclemore, T. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+intrapulmonary+model+for+orthotopic+propagation+of+human+lung+cancers+in+athymic+nude+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Novel intrapulmonary model for orthotopic propagation of human lung cancers in athymic nude mice.</a> Cancer Res. 47 (19), 5132-5140 (1987).</li>
<li>Zanoni, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+spheroid+models+for+in+vitro+therapeutic+screening%3A+A+systematic+approach+to+enhance+the+biological+relevance+of+data+obtained%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">3d tumor spheroid models for in vitro therapeutic screening: A systematic approach to enhance the biological relevance of data obtained.</a> Sci Rep. 6, 19103(2016).</li>
<li>Kim, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+tissue+culture+models+in+cancer+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cancer+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional tissue culture models in cancer biology.</a> Semin Cancer Biol. 15 (5), 365-377 (2005).</li>
<li>Chaicharoenaudomrung, N., Kunhorm, P., Noisa, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+cell+culture+systems+as+an+in+vitro+platform+for+cancer+and+stem+cell+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22World+J+Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional cell culture systems as an in vitro platform for cancer and stem cell modeling.</a> World J Stem Cells. 11 (12), 1065-1083 (2019).</li>
<li>Mehta, G., Hsiao, A. Y., Ingram, M., Luker, G. D., Takayama, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+and+challenges+for+use+of+tumor+spheroids+as+models+to+test+drug+delivery+and+efficacy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Opportunities and challenges for use of tumor spheroids as models to test drug delivery and efficacy.</a> J Control Release. 164 (2), 192-204 (2012).</li>
<li>Huang, B. W., Gao, J. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+3d+cultured+multicellular+spheroid+tumor+models+in+tumor-targeted+drug+delivery+system+research%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Application of 3d cultured multicellular spheroid tumor models in tumor-targeted drug delivery system research.</a> J Control Release. 270, 246-259 (2018).</li>
<li>Hirschhaeuser, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multicellular+tumor+spheroids%3A+An+underestimated+tool+is+catching+up+again%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Multicellular tumor spheroids: An underestimated tool is catching up again.</a> J Biotechnol. 148 (1), 3-15 (2010).</li>
<li>Sethi, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3d+tumor+tissue+analogs+and+their+orthotopic+implants+for+understanding+tumor-targeting+of+microenvironment-responsive+nanosized+chemotherapy+and+radiation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanomedicine%22%5BJournal%5D)">3d tumor tissue analogs and their orthotopic implants for understanding tumor-targeting of microenvironment-responsive nanosized chemotherapy and radiation.</a> Nanomedicine. 11 (8), 2013-2023 (2015).</li>
<li>Valta, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid+culture+of+lucap+136+patient-derived+xenograft+enables+versatile+preclinical+models+of+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Spheroid culture of lucap 136 patient-derived xenograft enables versatile preclinical models of prostate cancer.</a> Clin Exp Metastasis. 33 (4), 325-337 (2016).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrapulmonary+inoculation+of+multicellular+spheroids+to+construct+an+orthotopic+lung+cancer+xenograft+model+that+mimics+four+clinical+stages+of+non-small+cell+lung+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Intrapulmonary inoculation of multicellular spheroids to construct an orthotopic lung cancer xenograft model that mimics four clinical stages of non-small cell lung cancer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. , 10.1016/j.vascn.2020.106885 106885(2020).</li>
<li>Lemjabbar-Alaoui, H., Hassan, O. U., Yang, Y. W., Buchanan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+cancer%3A+Biology+and+treatment+options%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Lung cancer: Biology and treatment options.</a> Biochim Biophys Acta. 1856 (2), 189-210 (2015).</li>
<li>Detterbeck, F. C., Boffa, D. J., Kim, A. W., Tanoue, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eighth+edition+lung+cancer+stage+classification%5BTitle%5D)+AND+%22Chest%22%5BJournal%5D)">The eighth edition lung cancer stage classification.</a> Chest. 151 (1), 193-203 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים להצהיר.

הבנייה של A549-iRFP MCS היא הליך מעבדה פשוט וניתן לשכפול וניתן לתרגם אותו להיווצרות MCS עבור קווי תאים מרובים. MCS שנוצר בעזרת צנטריפוגה וקולגן מציג מבנה אינטגרלי יותר דמוי גידול מוצק בתוך 3-4 ימים. שיטה זו מבטיחה היווצרות של ספרואידים חזקים השומרים על המבנה האינטגרלי שלהם לתקופות ממושכות, בדרך כלל 2-3 שבועות או אפילו יותר עד שניצנים קטנים מתחילים להופיע. על ידי שימוש בצנטריפוגות וקולגן, תיקננו את היווצרות MCS, והבטחנו את העקביות והאמינות שלהם במודל הניסויי שלנו. גישה זו משפרת את יכולת השחזור של התוצאות שלנו וממזערת את השונות בקינטיקה של צמיחת גידולים, ובכך מספקת פלטפורמה איתנה יותר לחקר ביולוגיה של הגידול והתערבויות טיפוליות.
בניגוד לתרביות תאים חד-שכבתיות דו-ממדיות מסורתיות, MCS תלת-ממדי יכול לגדול על פני מסגרת זמן ארוכה הרבה יותר, לפחות 6 שבועות במחקר זה. כדי לעקוב אחר צמיחת סרטן והתקדמותו, מדידה כמותית דינמית לטווח ארוך מועילה מאוד. בדיקות MCS תלת-ממדיות קיימות רבות הן הרסניות במהלך המדידות, ובכך מגבילות את התועלת שלהן להערכות ארוכות טווח. האופי הלא הרסני של מדידת אותות פלואורסצנטיים iRFP מאפשר ניטור מתמשך וארוך טווח של צמיחת תאים סרטניים ב- MCS תלת-ממדי. תכונה זו חשובה במיוחד להערכת ההשפעות של חשיפה כרונית לחומרים אנטי-סרטניים וללכידת האבולוציה הדינמית של תאים סרטניים לאורך זמן. האותות הפלואורסצנטיים iRFP הנפלטים על-ידי A549-iRFP 3D MCS הציגו מתאם חזק עם מדידות כמותיות מסורתיות של גידול ספרואידים, כולל נפח ספרואידים, כדאיות התא ורמות חלבון תאי. זה מדגיש את האמינות של אותות פלואורסצנטיים כפרוקסי להערכת צמיחת תאים סרטניים ב- MCS. אורך הגל הארוך של האותות הפלואורסצנטיים iRFP מאפשר לכמת את צמיחת הסרטן והתקדמותו בבעלי חיים קטנים, שהוא קריטי לפיתוח פרה-קליני של תרופות אנטי-סרטניות.
כדי להבטיח את העקביות של מודל NSCLC אורתוטופי זה, MCS צריך להיות נבחר בקפידה עבור חיסון תוך ריאתי. גודל דומה ועוצמה פלואורסצנטית של MCS נחוצים כדי למזער את השונות; חיסון של MCS גדול יותר נוטה לגרום לשונות גדולה יותר בהתקדמות הגידול. בנוסף, שליטה בחספוס של משטח MCS ממלאת תפקיד קריטי בהפחתת השונות. בעוד שחלק מה-MCS שמרו על הקצוות החלקים שלהם ככל שהם גדלו, אחרים הציגו קצוות מחוספסים יותר ככל שהם גדלו. בידינו, MCS אינטגרלי, מוצק דמוי גידול לאחר 2-3 שבועות גידול בתרבית תאים עם 5-10 ניצנים בקצוות הניב גידול אחיד יותר בעכברים, בעוד שאלו ללא קצוות מחוספסים או אלה עם מבנים רופפים וניצנים רבים מדי הניבו דפוסים מגוונים יותר של צמיחת הגידול לאחר החיסון. 
במהלך תהליך העברת MCS, חיוני לטפל במחט 20 גרם בזהירות רבה. MCS צריך להישמר בתוך השיפוע או החלק המתכתי של המחט כדי להגביל נזק פוטנציאלי. בחירת גודל המחט נעשתה במכוון כדי לאזן בין הבטחת הכדאיות של MCS במהלך החיסון לבין מזעור הנזק הפוטנציאלי לריאות עכברים. גודלי מחטים גדולים יותר עלולים לגרום נזק לרקמות העכבר. אם MCS נתקע בתוך המחט או אם נקודות פלואורסצנטיות מרובות נצפות בימים הראשונים לאחר החיסון, זה עשוי להצביע על כך שה- MCS המחוסן ניזוק במהלך החיסון. עכברים שהציגו מאפיינים אלה לא נכללו במחקרים נוספים וסווגו כחיסון לא מוצלח.
הספרואידים הרב-תאיים (MCS) חוסנו בריאה השמאלית ולא בריאה הימנית על סמך שיקולים אנטומיים. לריאה השמאלית יש שתי אונות המוערמות זו על גבי זו, מה שמספק אזור מטרה עקבי ונגיש יותר בהשוואה לריאה הימנית, שבה שלוש אונות ממוקמות זו לצד זו. לפיכך, הריאה השמאלית מאפשרת חיסון אמין ביותר באזור מסוים, כלומר האונה השמאלית העליונה, אשר מסייע להפחית שינויים בהתפתחות הגידול והתקדמותו. 
מלבד פלואורסצנטיות iRFP בחזה, משקל הגוף של העכברים נושאי הגידול משמש אינדיקטור מאשש חשוב לנטל הגידול. ככל שסרטן הקסנוגרפט התקדם לאחר חיסון MCS, העכברים הפגינו תחילה התנהגות נורמלית, כולל אכילה, שתייה ופעילויות כשהם ערים, עד ליום 40 בערך, כאשר נטל הגידול הכבד, כפי שמוצג על ידי פלואורסצנטיות iRFP חזקה בחזה, הביא לירידה ניכרת במשקל הגוף ולאובדן ההתנהגות הרגילה. בהתאם להנחיות ההומניות, בעלי החיים עברו המתת חסד תוך ירידה של 15-20% במשקל הגוף. בעוד העיתוי של הירידה במשקל השתנה בין קבוצות, זה תואם את אובדן התנהגות נורמלית של בעלי חיים ולכן, יכול לשמש גם אינדיקטור אמין לבריאות בעלי חיים.
התקדמות הסרטן במודל האורתוטופי של NSCLC נוטרה בעיקר באמצעות הדמיית פלורסנט בצד שמאל וגחון, אשר הראתה צמיחה עקבית ויציבה של הגידול לאחר חיסון MCS. פלואורסצנטיות מצד הגחון הראתה עלייה איטית יותר מאשר בצד שמאל, כנראה בגלל (1) עומק ההזרקה ו-(2) נוכחות גידולים אורתוטופיים ותת עוריים בשלבי סרטן מתקדמים. באופן ספציפי, MCS חוסן דרך עצמות הצלעות לתוך בית החזה, אשר הניח אותו על פני השטח הגבי של הריאה השמאלית, ובכך נדרש זמן השהיה עבור MCS לגדול למשטח הגחוני של הריאה השמאלית כדי להיות דמות. ככל שהגידול גדל, הוא התפשט מדי פעם על פני השטח הפנימיים של דופן בית החזה, ובכך קירב אותו לסורק הפלואורסצנטי כדי לתת אותות גבוהים יותר להדמיה בצד שמאל. לכן, הדמיה פלואורסצנטית בצד הגחוני הציגה בצורה מדויקת יותר את הגידול בריאה אך בדרך כלל לקח זמן רב יותר לזהות את הגידול. בתום ההדמיה הפלואורסצנטית in vivo , בעלי החיים הוקרבו ועברו דיסקציה של חזה פתוח והדמיית ex vivo , שלא רק אישרה את התבססות הגידול האורתוטופי מחיסון MCS, אלא גם הציגה תכונות אנטומיות מרובות שחזרו את ארבעת השלבים הקליניים של NSCLC בבני אדם. 
במחקר יעילות הפיילוט, המתאם החזק בין הדמיית ex vivo של הריאות לבין הדמיה in vivo של עכברים נושאי גידול מאשש את האמינות של מתודולוגיית ההדמיה הפלואורסצנטית הדינמית in vivo . המודל האורתוטופי של NSCLC הגיב באופן אמין לטיפולים אנטי-סרטניים הן על ידי צמיחת הגידול האיטית יותר כאינדיקטור מרכזי ליעילות טיפולית והן על ידי אובדן משקל הגוף כאינדיקטור מרכזי לרעילות תרופות. תגובות אלה הדגימו את המודל ככלי רב ערך להערכה פרה-קלינית ופיתוח של תרופות אנטי-סרטניות. גרורות, סימן ההיכר של סרטן ריאות, שוחזרו נאמנה במודל, וחשוב מכך, עוכבו באופן אמין על ידי התרופה האנטי-סרטנית ציספלטין. צמיחה איטית יותר של הגידול נצפתה עם שתי זריקות בלבד של ציספלטין במחקר פיילוט זה, דבר המצביע על כך שהשפעה אנטי-סרטנית משמעותית יותר של ציספלטין תנבע ממשטר רלוונטי יותר מבחינה קלינית של ארבע מנות שבועיות. 
המודל האורתוטופי של NSCLC בדו"ח זה טומן בחובו מספר יתרונות חשובים על פני מספר מודלים נפוצים של סרטן ריאות בבעלי חיים. בהשוואה למודלים התת-עוריים של סרטן ריאות, מודל זה מציע מיקרו-סביבה רלוונטית יותר סביב הגידולים; בהשוואה למודל העכבר המהונדס גנטית, מודל זה מציע הליכים ניסיוניים נוחים יותר והתקדמות גידול והישרדות בעלי חיים הניתנים לשחזור. השוואה מקיפה בין מודל זה לבין מודלים אחרים של סרטן ריאות זמינה בפרסום הקודם שלנו18. בדומה למודלים אחרים של בעלי חיים, מגבלה אחת של מודל זה היא היעדר מערכת חיסון מלאה, שהיא מרכיב חשוב בסרטן אנושי. בנוסף, MCS המחוסן במודל זה מפתח מדי פעם את הגידול הראשוני xenograft על פני השטח הפנימיים של דופן בית החזה. לכן, הליכים ניסיוניים כדי לזהות ולמזער בקלות התפתחות כזו צריך להיכלל במחקרים עתידיים כדי לשפר את המודל הזה. יתר על כן, מחקרים המערבים את שני המינים יבוצעו כדי להשיג הבנה מקיפה יותר של ביולוגיה של הגידול ותגובות הטיפול ב- NSCLC. לסיכום, מודל קסנוגרפט סרטן הריאה האורתוטופי של דו"ח זה מהווה כלי חלוצי וחזק לשחזור התקדמות סרטן הריאה ולהערכת טיפולים אנטי-סרטניים. מודל זה טומן בחובו פוטנציאל עצום לקידום הבנתנו את הפתולוגיה של NSCLC ולפיתוח ההתערבויות הטיפוליות המתאימות.

מבין כל ההפרעות האונקולוגיות, סרטן הריאות לא רק גורם לאובדן החיים הגבוה ביותר, אלא גם טוען למספר השני בגובהו של חולים חדשים מדי שנה בארה"ב1. ממאירות הרסנית זו עומדת כמכשול מרכזי בשירותי הבריאות המודרניים, ודוחקת להבנה עמוקה יותר של הביולוגיה המורכבת שלה ולשיטות טיפוליות יעילות יותר2. סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) מהווה 85% ממקרי סרטן הריאה ונוטה להתפתח לגידולים מוצקים3. אחד האתגרים החשובים ביותר בסרטן הריאה הוא המיקרו-סביבה הדינמית וההטרוגנית של הגידול, המשפיעה עמוקות על התקדמות הסרטן ועל תגובותיו להתערבויות טיפוליות 4,5,6. הבנה מעמיקה יותר של יחסי הגומלין בין תאים סרטניים לבין המיקרו-סביבה שלהם בשלבים שונים של NSCLC דורשת מודלים פתולוגיים מעודנים המשחזרים את המאפיינים ההיסטולוגיים של התקדמות NSCLC.
בהקשר זה, מודלים אורתוטופיים של בעלי חיים מתגלים כאפיק מבטיח למחקר NSCLC. בניגוד למודלים תת-עורייםנפוצים של קסנוגרפט 7, מודלים אורתוטופיים כוללים תאים סרטניים המחוסנים ישירות לאיבר המוצא. עבור סרטן ריאות, משמעות הדבר היא השתלת תאים סרטניים ישירות לתוך רקמת הריאה 8,9. כתוצאה מכך, מודלים אורתוטופיים של סרטן ריאות מחקים טוב יותר את המיקרו-סביבה הטבעית של הגידול, כולל הרקמות, כלי הדם והמרכיבים החיסוניים השכנים, ובכך משפרים את הרלוונטיות הפיזיולוגית והקלינית שלהם.
ספרואידים רב-תאיים תלת-ממדיים (MCS) מייצגים גישה מבטיחה נוספת לשחזור תכונות של סביבת הגידול. רוב סוגי הסרטן מאופיינים במיקרו-סביבה הגידולית המורכבת שלהם, כולל אינטראקציות תא-תאים שונות, המטריצה החוץ תאית, והשיפועים בחמצן ובחומרי מזון10,11. תרביות תאים דו-ממדיות מסורתיות חסרות את המורכבות המרחבית והמבנית כדי לשחזר תכונות ספציפיות אלהלגידול 12. לעומת זאת, MCS בגודל המתאים מתאפיין במבנה הטרוגני עם ליבה היפוקסית ונמקית, אשר משחזרת לא רק את המיקרו-סביבה התוך-גידולית אלא גם את המחסום הפיזיולוגי מפני חדירת תרופות, שהוא מנגנון עיקרי של עמידות לתרופות בטיפול אנטי-סרטני 13,14,15.
תוך ניצול המודלים האורתוטופיים של בעלי חיים וטכניקות הטיפוח של MCS, MCS חוסנו לעכברים מדוכאי חיסון כדי לבנות בהצלחה מודלים אורתוטופיים של סרטן השד וסרטן הערמונית16,17. במאמר זה אנו מדווחים על המתודולוגיה המפורטת לבנייה ואפיון של מודל קסנוגרפט אורתוטופי של סרטן ריאות. שיטה זו משתמשת בחיסון תוך-ריאתי של MCS תלת-ממדי שמקורו בתאי סרטן ריאה אנושיים פלואורסצנטיים (A549-iRFP)18. מודל זה מציע הזדמנות יוצאת דופן לצפות בהתקדמות in vivo של סרטן ריאות דרך שלבים המקבילים באופן הדוק לארבעת השלבים הקליניים של NSCLC. יתר על כן, סרטן xenograft של מודל זה הגיב לתרופה נגד סרטן ריאות מבוססת קלינית, cisplatin.

<table><tbody><tr><td>100 ומיקרו; L מזרק זכוכית</td><td>המילטון</td><td>חלק/REF #80601</td><td></td></tr><tr><td>20 גרם מחט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק בע"מ.</td><td>14 826D</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות מיקרופלייט ספרואיד מצורף נמוך במיוחד&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>15-100-173</td><td></td></tr><tr><td>A549-iRFP</td><td>מדעי החיים&nbsp;</td><td>CL082-STAN</td><td></td></tr><tr><td>AIN-93M דיאטת מכרסמים בוגרים&nbsp;</td><td>מחקר דיאטות בע"מ</td><td></td><td></td>D10012M</tr><tr><td>עכבר עירום אתימי</td><td>מעבדות צ'ארלס ריבר, בע"מ</td><td>קוד זן: 490; הומוזיגוט</td><td></td></tr><tr><td>BCA</td><td>Pierce</td><td>23227</td><td></td></tr><tr><td>בופרנורפין הידרוכלוריד</td> פטרסון מספר NDC <td>וטרינרי:</td><td>42023-179-05</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo 3D Cell Testability Assay Promega</td><td></td><td>G9683</td><td></td></tr><tr><td>קולגן</td><td>Gibco</td><td>A1064401&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Corning</td><td>MT10013CV</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי (FBS)</td><td>Cytiva HyClone</td><td>SH3039603</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>כלי קוד פתוח (https://imagej.net/ij/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Image Studio&nbsp;</td><td>LI-COR</td><td>גרסה 5.2</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Patterson מספר NDC וטרינרי:</td><td>17033-0091-25</td><td></td></tr><tr>מספר NDC <td>וטרינרי</td><td>של קטמין</td> פטרסון<td>: 50989-0161-06</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ&nbsp;</td><td>מספר דגם Keyence</td><td>: BZ-X710</td><td></td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>CB-40234</td><td></td></tr><tr><td>Odyssey Infrared Imaging 205 System&nbsp;</td><td>מספר דגם LI-COR</td><td>: 9140</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>MT21040CV</td><td></td></tr><tr><td>Pearl Trilogy מערכת הדמיה של בעלי חיים קטנים&nbsp;</td><td>מספר דגם LI-COR</td><td>: 9430</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין&nbsp;</td><td>קורנינג</td><td>MT30002CI</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Thermo Fisher Scientific Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AAJ67236XF תוכנת ReViSP מבית MATLAB&nbsp;</td><td>כלי קוד פתוח ב-Sourceforge (https://sourceforge.net/projects/revisp/)</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>קליפים כירורגיים - מערכת AutoClip</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>12020-00</td><td></td></tr><tr>מספר NDC <td>וטרינרי</td><td>קסילזין</td> פטרסון<td>: 61133-6017-01</td><td></td></tr></tbody></table>

בניית מודל קסנוגרפט אורתוטופי של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים המחקה את התקדמות המחלה ומנבא פעילויות תרופתיות

Construction of An Orthotopic Xenograft Model of Non-Small Cell Lung Cancer Mimicking Disease Progression and Predicting Drug Activities

סרטן ריאות של תאים לא קטנים (NSCLC) הוא מחלה קטלנית ביותר עם מיקרו-סביבה סרטנית מורכבת והטרוגנית. כיום, מודלים נפוצים של בעלי חיים המבוססים על חיסון תת-עורי של תרחיפים של תאים סרטניים אינם משחזרים את המיקרו-סביבה של הגידול ב- NSCLC. במאמר זה אנו מתארים מודל סרטן ריאות אורתוטופי של מורין המשתמש בחיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב-תאיים תלת-ממדיים (MCS). באופן ספציפי, תאי NSCLC אנושיים פלואורסצנטיים (A549-iRFP) גודלו בתרבית במיקרו-צלחות בעלות חיבור נמוך של 96 בארות עם קולגן במשך 3 שבועות כדי ליצור MCS, אשר חוסנו לאחר מכן באופן בין-קוסטלי לתוך הריאה השמאלית של עכברים עירומים אתימיים כדי לבסס את מודל סרטן הריאה האורתוטופי.
בהשוואה לקו התאים המקורי של A549, MCS של קו התאים A549-iRFP הגיב באופן דומה לתרופות נגד סרטן. האות הפלואורסצנטי באורך הגל הארוך של תאי A549-iRFP נמצא בקורלציה חזקה עם סמנים נפוצים של צמיחת תאים סרטניים, כולל נפח ספרואידים, כדאיות התא ורמת החלבון התאי, ובכך מאפשר ניטור דינמי של צמיחת הסרטן in vivo על ידי הדמיה פלואורסצנטית. לאחר החיסון לעכברים, A549-iRFP MCS xenograft התקדם באופן אמין דרך שלבים דומים מאוד לשלבים הקליניים של NSCLC, כולל הרחבת הגידול הראשוני, הופעתם של גידולים משניים שכנים, וגרורות של תאים סרטניים לריאה הימנית הנגדית ולאיברים מרוחקים. יתר על כן, המודל הגיב לתרופה נגד סרטן ריאות, ציספלטין עם הרעילות הצפויה והתקדמות סרטן איטית יותר. לכן, מודל קסנוגרפט אורתוטופי זה של NSCLC ישמש פלטפורמה לשחזור התקדמות המחלה ולהקל על פיתוח תרופות אנטי-סרטניות פוטנציאליות.

אפיון MCS A549-iRFP A549-iRFP MCS תורבתו בהצלחה במיקרו-צלחות ספרואידים בעזרת קולגן וצנטריפוגה. כאשר MCS הגיע לקוטר של כ-500 מיקרומטר לאחר שבוע אחד, הן A549 והן A549-iRFP MCS נחשפו למגוון תרופות ותכשירים נגד סרטן במשך 3 ימים ולאחר מכן נשמרו במדיום גידול ללא תרופות במשך 4 ימים נוספים. A549-iRFP MCS הציג דפוס תגובה הדומה מאוד לזה של תאי האב A549. A549 ו-A549-iRFP MCS הראו עקומות מנה-תגובה דומות וערכי IC50 דומים לציספלטין, אחת מתרופות הקו הראשון נגד סרטן ריאות (איור 2A). הכדאיות של A549 ו-A549-iRFP MCS עוכבה בדרגות דומות על-ידי תרופות או פורמולציות אנטי-סרטניות אחרות (איור 2B).
A549-iRFP MCS נוטרו במשך תקופה של עד 6 שבועות על ידי פלואורסצנטיות iRFP, כדאיות התאים ורמות חלבון תאי. נפח ה-MCS הוערך על-ידי סימולציית תוכנה המבוססת על תמונות מיקרוסקופ בניגודיות פאזה, והמורפולוגיה המדומה הציגה צורות דומות לאלה שצולמו במיקרוסקופ ובאות פלואורסצנטי (איור 2C). כדאיות התא של A549-iRFP MCS כומתה על ידי בדיקת כדאיות תאים תלת-ממדית, והבדיקה אומתה עם MCS בגדלים שונים בקוטר של 350 עד 950 מיקרומטר. לא נצפו הבדלים משמעותיים ביחסי נפח שונים בין מדיום הגידול המכיל MCS לבין מגיב הבדיקה, ובין זמני טלטול שונים של 5 דקות ו-10 דקות. (איור משלים S1). כל ארבעת הסמנים הביולוגיים גדלו עם הזמן, עם שינויים גדולים יותר בנקודות זמן מאוחרות יותר (איור 2D). הפלואורסצנטיות של iRFP הראתה מתאם חזק עם שלוש המדידות הכמותיות המסורתיות יותר של MCS: נפח (Pearson r = 0.9307, p &lt; 0.0001), כדאיות התא (Pearson r = 0.7666, p &lt; 0.0001) וחלבון תאי (Pearson r = 0.7317, p &lt; 0.0001) (איור 2E).
התקדמות הגידול בעכברים לאחר גידול של 2-3 שבועות, A549-iRFP MCS עם מאפיינים מתאימים, כולל מורפולוגיה, קוטר MCS, קצוות מחוספסים כראוי ואות פלואורסצנטי (לפרמטרים מפורטים, ראה פרוטוקול סעיף 3), נבחרו לחיסון הגידול. לאחר ניתוח חיסון הגידול, משקל הגוף של עכברים נושאי גידול נמדד כל 3 ימים והוצג כיחס השינוי בהשוואה למשקל ביום 0 ממש לפני הניתוח. משקל הגוף של העכבר ירד מעט לאחר הניתוח והתאושש במהירות תוך שבוע. ללא טיפול, משקל הגוף עלה בהדרגה עד ~יום 40 אך ירד באופן דרסטי (~15%) בשבוע שלאחר מכן, מה שהוביל להמתת חסד (מנת יתר של הרדמה פי שלושה: 80 מ"ג/ק"ג קטמין ו-12 מ"ג/ק"ג קסילזין באמצעות הזרקת IP) של עכברים בהתאם להנחיות IACUC (איור 3A). עכברים נושאי גידול צולמו כל 3 ימים בארבע תנוחות: צד שמאל, צד גבי, צד ימין וצד גחון. מבין אלה, השמאלי (שבו הגידול מחוסן) והגחוני (שבו ניתן לצפות בשני צידי הריאות) נבחרו כתנוחות מפתח לכימות עוצמת הפלואורסצנט נטו על פי משוואה (1) (איור 3B,C). עוצמת הפלואורסצנטיות נטו משתי התנוחות הראתה מגמה דומה של התקדמות הגידול, כאשר הפלואורסצנטיות מצד הגחון גדלה מעט לאט יותר מאשר בצד שמאל.
קסנוגרפט MCS במודל אורתוטופי זה התקדם דרך שלבים נפרדים המשקפים את ארבעת השלבים הקליניים של NSCLC (איור 3D)18,19,20. בסביבות היום ה-8 לאחר החיסון נגד MCS, הופיעה פלורסנציה מרוכזת בריאה השמאלית, המסמלת התבססות של גידול מקומי בהתאם לשלב 1 NSCLC במסגרות קליניות. בערך ביום ה-11, הפלואורסצנטיות התעצמה ו/או התפזרה על פני מספר אתרים בריאה השמאלית, מה שמצביע על נוכחות גידול(ים) הדומים לשלב 2 NSCLC. לאחר מכן, בערך ביום ה-18, נצפו אותות פלואורסצנטיים מוגברים מהצד הגחוני, דבר המרמז על התקדמות דמוית שלב 3 של הקסנוגרפט. יתר על כן, בדיקה אנטומית והדמיית ex vivo גילו צמיחת גידול על פני הלב, סימן היכר משמעותי של NSCLC שלב 3. בערך ביום ה-27 שלאחר החיסון נגד MCS, הופיעה פלואורסצנטיות מחוררת משני צידי הריאה, והאנטומיה של בית החזה הפתוח חשפה גידול מחורר בלב, קנה הנשימה וכלי דם מרכזיים, דבר המעיד על גרורות סרטניות הדומות לשלב 4 של NSCLC.
תגובה של עכברים נושאי גידול לציספלטין מחקר יעילות פיילוט נערך על מודל אורתוטופי זה של סרטן ריאות. עשרה ימים לאחר חיסון הגידול הוזרקו 5 מ"ג/ק"ג ציספלטין או מי מלח רגילים דרך וריד הזנב של עכברים נושאי גידול, זריקה אחת בשבוע, בסך הכל שתי זריקות. תמונות הצד הגחוני של עכברים נושאי גידול מוצגות באיור 4A. משקל הגוף ופלואורסצנטיות הגידול נוטרו כל 3-4 ימים. בהשוואה לקבוצת המלח הרגילה, העכברים בקבוצת הציספלטין איבדו משקל גוף משמעותי לאחר כל זריקת ציספלטין, אך התאוששו בשבועות שלאחר הטיפול בציספלטין (איור 4B). עוצמת הפלואורסצנטיות נטו בקבוצת הציספלטין הראתה מגמת עלייה איטית יותר מאשר בקבוצת המלח (איור 4C). בתום הניטור הפלואורסצנטי in vivo, בעלי החיים הוקרבו וריאותיהם נותחו וצולמו על ידי פלואורסצנציה. לאחר נורמליזציה על ידי חלבון הרקמה הכולל, עוצמת הפלואורסצנטיות של הריאות שנותחו מעכברים בקבוצת הציספלטין אושרה כנמוכה מזו של קבוצת המלח הרגילה. (איור 4E). בהדמיה פלואורסצנטית גחונית (איור 4A), התמונות במלבנים האדומים מציינות את הפעם הראשונה שבה פלואורסצנטיות הגידול הודגמה הן בריאות השמאלית והן בריאה הימנית, שהיא אינדיקטור מרכזי לגרורות סרטניות בשלב IV NSCLC. ציספלטין, אחת מתרופות הקו הראשון לסרטן ריאות, האטה את גרורות הגידול מהריאה השמאלית לריאה הימנית (איור 4D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה של המחקר. (A) זריעת תאי A549-iRFP לתוך מיקרו-צלחות ספרואידיות ליצירת MCS בעזרת קולגן וצנטריפוגה. (B) חיסון תוך-ריאתי של A549-iRFP MCS עם מאפיינים מתאימים לריאה השמאלית של עכבר כדי לבנות את מודל הקסנוגרפט של סרטן הריאה האורתוטופי, המחקה את ארבעת השלבים של סרטן הריאה במסגרות קליניות. המזרק הלבן המכיל MCS אחד מצביע על חיסון הגידול ואילו שני המזרקים האדומים מציינים טיפול תרופתי הניתן דרך וריד הזנב. קיצור: MCS = ספרואיד רב-תאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig02.jpg"> איור 2: אפיון של A549-iRFP MCS. (A) עקומות מנה-תגובה של A549-iRPF MCS ו-A549 MCS לציספלטין לאחר חשיפה של 3 ימים וצמיחה ללא תרופות במשך 4 ימים (ממוצע ± SD, N = 3-4). (B) כדאיות התא של A549-iRFP MCS לאחר חשיפה של 3 ימים לטיפולים אנטי-סרטניים (ציספלטין, פקליטקסל או שתי פורמולציות תרופתיות שפותחו בבית) וצמיחה ללא תרופות במשך 4 ימים (ממוצע ± SD, N = 3-4). (C) מחקרים מורפולוגיים של MCS מייצג A549-iRFP לאחר 1-6 שבועות של תרבית במיקרוסקופ פאזת ניגוד (C1, סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר), מיקרוסקופ קונפוקלי פלואורסצנטי (C2) והדמיית תוכנה (C3). (D) שינוי דינמי של הפלואורסצנטיות של iRFP, הנפח, כדאיות התא והחלבון התאי של A549-iRFP MCS במשך 1-6 שבועות (N = 10 עבור פלואורסצנטיות iRFP ונפח; N = 5 עבור כדאיות התא וחלבון תאי). (E) מתאם של פלואורסצנטיות iRFP של MCS A549-iRFP עם שלוש מדידות הגידול המסורתיות האחרות (נפח, כדאיות תאים וחלבון תאי) במשך 1-6 שבועות (N = 60). (F) דוגמה של A549-iRFP MCS של מאפיינים מתאימים לחיסון הגידול (סרגל קנה מידה = 500 מיקרומטר). קיצור: MCS = ספרואיד רב-תאי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig03.jpg"> איור 3: התקדמות הגידול במודל המורין האורתוטופי של NSCLC. (A) שינוי במשקל הגוף של עכברים לאחר חיסון הגידול (ממוצע ± SEM, N = 5). (B) שינוי דינמי של עוצמת הפלואורסצנטיות נטו בעכברים נושאי גידול בהתבסס על הדמיה בצד שמאל (N = 5). (C) שינוי דינמי של עוצמת הפלואורסצנטיות נטו בעכברים נושאי גידול בהתבסס על הדמיה בצד הגחון (N = 5). (D) התקדמות סרטן המחקה את ארבעת השלבים הקליניים של NSCLC. הדמיה בצד שמאל, הדמיה בצד הגחון, תצפית אנטומית (חיצים צהובים מצביעים על גידולים בריאה ועל פני הלב), והדמיית ex-vivo של עכברים נושאי גידול מייצגים בארבעה שלבים. נתון זה נלקח מתוך Huang et al.18. קיצור: NSCLC = סרטן ריאות של תאים לא קטנים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66787/66787fig04.jpg"> איור 4: תגובת עכברים נושאי גידול לציספלטין. (A) הדמיה בצד הגחון של עכברים נושאי גידול לאחר טיפול במי מלח או ציספלטין (תמונות במלבנים אדומים מציינות מתי ניתן להמחיש לראשונה את פלואורסצנטיות הגידול הן בריאות השמאלית והן בריאה הימנית). (B) שינוי במשקל הגוף של עכברים נושאי גידול לאחר טיפולי מי מלח או ציספלטין (ממוצע ± SEM, N = 3-4). (C) שינוי דינמי של עוצמת פלואורסצנטית נטו בעכברים נושאי גידול לאחר טיפולי מלח או ציספלטין בהתבסס על הדמיה בצד הגחון (ממוצע ± SEM, N = 3-4). (D) אחוז העכברים המראים פלואורסצנטיות של הגידול הן בריאות השמאלית והן בריאה הימנית. (E) עוצמה פלואורסצנטית מנורמלת של ריאות שנותחו מעכברים שהוקרבו בסוף הדמיה פלואורסצנטית in vivo (ממוצע ± SEM, N = 3-4). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים S1: בדיקת כדאיות תאים תלת-ממדית ב-MCS A549-iRFP בקטרים שונים. (A) ~ 350 מיקרומטר; (B) ~ 550 מיקרומטר; (C) ~ 750 מיקרומטר; (D) ~ 950 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66787/66787_Supplementary%20Figure%20S1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

מחקר זה מציג מודל אורתוטופי של סרטן ריאות מסוג תאים לא קטנים (NSCLC) המבוסס על חיסון תוך ריאתי של ספרואידים רב-תאיים של תאי A549-iRFP פלואורסצנטיים. המודל משחזר שלבים קליניים של NSCLC ומגיב לציספלטין, על פי ניטור דינמי in vivo של פלואורסצנטיות באורך גל ארוך.

Non-small cell lung cancer (NSCLC) is a highly lethal disease with a complex and heterogeneous tumor microenvironment. Currently, common animal models ...

construction-an-orthotopic-xenograft-model-non-small-cell-lung-cancer

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

כתב יד זה מפרט שיטה המשמשת ליצירת קסנוגרפלים שמקורם בחולי סרטן הערמונית (PDX) מתאי גידול במחזור (CTCs). יצירת מודלים PDX מ-CTCs מספקת מודל ניסיוני חלופי לחקר סרטן הערמונית; הגידול המאובחן השכיח ביותר וסיבת מוות שכיחה מסרטן אצל גברים.

דור של חולה סרטן הערמונית נגזר מודלי xenograft ממחזור תאים סרטניים

אנו מציגים מודל תלת מימדי (תלת מימדי) של סרטן ריאות המבוסס על פיגום קולגן ביולוגי כדי לחקור את הרגישות לטיפולים ממוקדי תאים לא קטנים-סרטן-ריאות (NSCLC). אנו מדגימים טכניקות קריאה שונות לקביעת מדד ההתפשטות, האפופטוזיס ומצב המעבר האפיתלי-מזנכימלי (EMT). הנתונים שנאספו משולבים במודל סיליקו לחיזוי רגישות לתרופות.

רקמת 3D משולב תכנון הנדסי<em&gt; במבחנה</em&gt; /<em&gt; סיליקו</em&gt; דגם גידול ריאות לניבוי יעילות טיפול תרופתי רקעים מוטציוני ספציפיים

סרטן הערמונית הוא הגורם השני בשכיחותו למקרי מוות הקשורים לסרטן בארצות הברית. מודל סרטן אורתוטופי מספק גישה שימושית להבנת הביולוגיה של סרטן הערמונית ולהערכת היעילות של משטרי טיפול. פרוטוקול זה מתאר את השלבים המפורטים הדרושים להקמת מודל עכבר אורתוטופי לסרטן הערמונית.

דגם Murine Orthotopic פרה-קליני של סרטן ערמונית האדם

ניצול גידולים שמקורם המטופל במודל פרה-קליני תת עורית הוא דרך מצוינת ללמוד את היעילות של טיפולים חדשניים, גילוי סמן ביולוגי חזוי, ושבילי סמים עמידים. מודל זה, בתהליך פיתוח התרופות, יש חשיבות רבה לקביעת גורלו של טיפולים חדשניים נגד סרטן רבים לפני למחקר קליני.

פיתוח ותחזוקה של גידול נגזר החולה פרה xenograft דגם לחקירת Novel טיפולים נגד סרטן

אנו מתארים שיטה כדי לשפר באופן משמעותי את engraftment orthotopic של סרטן ריאות תאים לריאות מאתר על ידי מיזוג מראש את דרכי הנשימה עם פציעה. גישה זו ויכול להיות מיושם גם ללמוד אינטראקציות סטרומה בתוך הריאות microenvironment, הפצתו גרורתי, morbidities משותף של סרטן ריאות, לייצר ביעילות רבה יותר החולה נגזר xenografts.

מיזוג מראש את דרכי הנשימה של עכברים עם Bleomycin מגדיל את היעילות של Orthotopic ריאות סרטן תא Engraftment

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לנצל מונחה אולטרה סאונד הזרקה של נוירובלסטומה (NB) ותאים של יואינג סרקומה (ES) (שהוקמה שורות תאים ותאים סרטניים נגזר החולה) באתרים הרלוונטיים ביולוגית ליצירת במודלים פרה אמין עבור סרטן מחקר.

ניצול של אולטרסאונד מודרכת מכוון רקמות השרשה הסלולר להקמתה של גידול גרורתי רלוונטי מבחינה ביולוגית Xenografts

כאן נתאר מודל השתלת orthotopic syngeneic פולשנית של תאים אדנוקרצינומה של הריאה העכבר כמודל זמן - ו בהפחתת עלויות ללמוד סרטן ריאות שאינם קטנים התא.

Orthotopic השתלת ריאות Syngeneic תאים אדנוקרצינומה ללמוד ביטוי PD-L1

פרוטוקול זה מתאר את הדור של החולה הנגזר הנושא מודלים מבע על ידי פנים-ומבחינה משפטית הקניית תאים קרצינומה של תא ברמה גבוהה urothelial או פנים-rectally הזרקת תאים סרטניים המעי הגס לתוך סוכרת שמנים/חמור משולב כשל חיסוני (הנהון/SCID) עכברים לגידול הגידול הראשוני גרורות מתחת להשפעה של תאים סטרומה בצומת הלימפה, אשר מחקה את ההתקדמות של מחלות גרורתית האדם.

מטופל-נגזר אורתוטופית מודלים של תאים האדם Urothelial קרצינומה של סרטן המעי הגס ואת הגידול גרורות ספונטנית

הפרוטוקול הנוכחי מבסס ומאפיין מודל קסנוגרפט נגזר ממטופל (PDX) של קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס (ATC) וקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר (HNSCC), כאשר מודלים של PDX הופכים במהירות לסטנדרט בתחום האונקולוגיה התרגומית.

הקמה ואפיון של מודלים של קסנוגרפט שמקורם במטופל של קרצינומה אנפלסטית של בלוטת התריס וקרצינומה של תאי קשקש בראש ובצוואר

פיתוח מודלים אורתוטופיים של גידולי מוח בילדים דורש דיוק קפדני, תוך שימוש במכשיר סטריאוטקסי להשתלת תאים סרטניים בצורה מדויקת. המתודולוגיה המוצגת כאן מתארת את השלבים הכרוכים בהכנת תאי גידול במוח, ביצוע זריקות תוך גולגולתיות ויישום מערכת ניטור לאחר ניתוח להערכת השתלת גידול מוח.

הקמת מודלים אורתוטופיים של קסנוגרפט שמקורם בחולה לגידולי מוח באמצעות מכשיר סטריאוטקסי

אתגר מרכזי בפיתוח טיפולים חדשים לסרטן ריאות כולל מידול המיקרו-סביבה של הגידול כאשר מחלה אזורית מתקדמת למחלה גרורתית. כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה להקמת מודל סינגני אורתוטופי של סרטן ריאות המאפשר מעקב in vivo אחר המחלה לאורך זמן.

שיטה זעיר פולשנית ליצירת מודל עכבר אורתוטופי סינגני של סרטן ריאות

חקור מודל קסנוגרפט אורתוטופי לסרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים באמצעות שתלת ספירואידים רב-תאיים של תאי A549-iRFP. שיטה זו מאפשרת מעקב דינמי של התקדמות הגידול ותגובה לטיפול בסיספלטין בזאבים.

בניית מודל קסנוגרפט אורתוטופי של סרטן ריאה מסוג תאים לא קטנים המחקה את התקדמות המחלה ומנבא פעילויות תרופתיות

גלה סרטונים נוספים