Name: היווצרות אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוגלים תלת מימדיים של פיברין (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-04T13:20:00.000+00:00
Duration: 3 min 31 s
Description: למד ליצור אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין. שיטה זו תומכת בהבשלה של תאים אפיתליים תימיים ומאפשרת חקר מנגנוני סבלנות עצמית ואוטואימוניות במעבדה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>יצירה מחדש של המיקרו-סביבה התימנית עם אורגנואידים שמקורם ב-iPSC

<ol><li>Starr, T. K., Jameson, S. C., Hogquist, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+and+negative+selection+of+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Positive and negative selection of T cells.</a> Annu Rev Immunol. 21, 139-176 (2003).</li>
<li>Carpenter, A. C., Bosselut, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decision+checkpoints+in+the+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Decision checkpoints in the thymus.</a> Nat Immunol. 11 (8), 666-673 (2010).</li>
<li>Miller, J. F. A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+function+of+the+thymus+and+its+impact+on+modern+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The function of the thymus and its impact on modern medicine.</a> Science. 369 (6503), eaba2429 (2020).</li>
<li>Haddad, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+thymus-colonizing+cells+during+human+development%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Dynamics of thymus-colonizing cells during human development.</a> Immunity. 24 (2), 217-230 (2006).</li>
<li>Cumano, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+molecular+insights+into+immune+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">New molecular insights into immune cell development.</a> Annu Rev Immunol. 37, 497-519 (2019).</li>
<li>Bautista, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptional+profiling+of+human+thymic+stroma+uncovers+novel+cellular+heterogeneity+in+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptional profiling of human thymic stroma uncovers novel cellular heterogeneity in the thymic medulla.</a> Nat Commun. 12 (1), 1096(2021).</li>
<li>Kadouri, N., Nevo, S., Goldfarb, Y., Abramson, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cell+heterogeneity%3A+TEC+by+TEC%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cell heterogeneity: TEC by TEC.</a> Nat Rev Immunol. 20 (4), 239-253 (2020).</li>
<li>Alves, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+progression+of+cortical+and+medullary+thymic+epithelial+microenvironments%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Serial progression of cortical and medullary thymic epithelial microenvironments.</a> Eur J Immunol. 44 (1), 16-22 (2014).</li>
<li>Baik, S., Jenkinson, E. J., Lane, P. J. L., Anderson, G., Jenkinson, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+both+cortical+and+Aire%2B+medullary+thymic+epithelial+compartments+from+CD205%2B+progenitors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of both cortical and Aire+ medullary thymic epithelial compartments from CD205+ progenitors.</a> Eur J Immunol. 43 (3), 589-594 (2013).</li>
<li>Tavian, M., Peault, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryonic+development+of+the+human+hematopoietic+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Embryonic development of the human hematopoietic system.</a> Int J Dev Biol. 49 (2-3), 243-250 (2005).</li>
<li>Abramson, J., Anderson, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Thymic epithelial cells.</a> Annu Rev Immunol. 35 (1), 85-118 (2017).</li>
<li>Anderson, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projection+of+an+immunological+self+shadow+within+the+thymus+by+the+aire+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Projection of an immunological self shadow within the thymus by the aire protein.</a> Science. 298 (5597), 1395-1401 (2002).</li>
<li>Sharma, H., Moroni, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+advancements+in+regenerative+approaches+for+thymus+rejuvenation%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Sci%22%5BJournal%5D)">Recent advancements in regenerative approaches for thymus rejuvenation.</a> Adv Sci. 8 (14), 2100543(2021).</li>
<li>Alenghat, F. J., Ingber, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanotransduction%3A+all+signals+point+to+cytoskeleton%2C+matrix%2C+and+integrins%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">Mechanotransduction: all signals point to cytoskeleton, matrix, and integrins.</a> Sci STKE. 2002 (119), 6(2002).</li>
<li>Pinto, S., Schmidt, K., Egle, S., Stark, H. -J., Boukamp, P., Kyewski, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+organotypic+coculture+model+supporting+proliferation+and+differentiation+of+medullary+thymic+epithelial+cells+and+promiscuous+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">An organotypic coculture model supporting proliferation and differentiation of medullary thymic epithelial cells and promiscuous gene expression.</a> J Immunol. 190 (3), 1085-1093 (2013).</li>
<li>Hun, M., Barsanti, M., Wong, K., Ramshaw, J., Werkmeister, J., Chidgey, A. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+thymic+extracellular+matrix+improves+in+vivo+thymic+organoid+T+cell+output%2C+and+drives+in+vitro+thymic+epithelial+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Native thymic extracellular matrix improves in vivo thymic organoid T cell output, and drives in vitro thymic epithelial cell differentiation.</a> Biomaterials. 118, 1-15 (2017).</li>
<li>Asnaghi, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thymus+extracellular+matrix-derived+scaffolds+support+graft-resident+thymopoiesis+and+long-term+in+vitro+culture+of+adult+thymic+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Funct+Mater%22%5BJournal%5D)">Thymus extracellular matrix-derived scaffolds support graft-resident thymopoiesis and long-term in vitro culture of adult thymic epithelial cells.</a> Adv Funct Mater. 31 (20), 2010747(2021).</li>
<li>Villegas, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cultured+human+thymic-derived+cells+display+medullary+thymic+epithelial+cell+phenotype+and+functionality%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Cultured human thymic-derived cells display medullary thymic epithelial cell phenotype and functionality.</a> Front Immunol. 9, 1663(2018).</li>
<li>Hauri-Hohl, M., Zuklys, S., Holländer, G. A., Ziegler, S. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+regulatory+role+for+TGF-%CE%B2+signaling+in+the+establishment+and+function+of+the+thymic+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">A regulatory role for TGF-β signaling in the establishment and function of the thymic medulla.</a> Nat Immunol. 15 (6), 554-561 (2014).</li>
<li>Campinoti, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+a+functional+human+thymus+by+postnatal+stromal+progenitor+cells+and+natural+whole-organ+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of a functional human thymus by postnatal stromal progenitor cells and natural whole-organ scaffolds.</a> Nat Commun. 11 (1), 6372(2020).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Reports%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic organoids from human pluripotent stem cells.</a> Stem Cell Reports. 18 (4), 829-840 (2023).</li>
<li>Fan, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioengineering+thymus+organoids+to+restore+thymic+function+and+induce+donor-specific+immune+tolerance+to+allografts%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Bioengineering thymus organoids to restore thymic function and induce donor-specific immune tolerance to allografts.</a> Mol Ther. 23 (7), 1262-1277 (2015).</li>
<li>Provin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combinatory+differentiation+of+human+induced+pluripotent+stem+cells+generates+thymic+epithelium+that+supports+thymic+crosstalk+and+directs+dendritic-+and+CD4%2FCD8+T-cell+full+development%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Combinatory differentiation of human induced pluripotent stem cells generates thymic epithelium that supports thymic crosstalk and directs dendritic- and CD4/CD8 T-cell full development.</a> bioRxiv. 2023, 572664(2023).</li>
<li>Parent, A. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+thymic+epithelium+from+human+embryonic+stem+cells+that+supports+host+T+cell+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Generation of functional thymic epithelium from human embryonic stem cells that supports host T cell development.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 219-229 (2013).</li>
<li>Sun, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+differentiation+of+human+embryonic+stem+cells+into+thymic+epithelial+progenitor-like+cells+reconstitutes+the+thymic+microenvironment+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Directed differentiation of human embryonic stem cells into thymic epithelial progenitor-like cells reconstitutes the thymic microenvironment in vivo.</a> Cell Stem Cell. 13 (2), 230-236 (2013).</li>
<li>Inami, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+induced+pluripotent+stem+cells+to+thymic+epithelial+cells+by+phenotype%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of induced pluripotent stem cells to thymic epithelial cells by phenotype.</a> Immunol Cell Biol. 89 (2), 314-321 (2011).</li>
<li>Gras-Pena, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+stem+cell-derived+thymic+epithelial+cells+enhance+human+T+cell+development+in+a+xenogeneic+thymus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Human stem cell-derived thymic epithelial cells enhance human T cell development in a xenogeneic thymus.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (5), 1755-1771 (2022).</li>
<li>Lai, L., Jin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+thymic+epithelial+cell+progenitors+by+mouse+embryonic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cells%22%5BJournal%5D)">Generation of thymic epithelial cell progenitors by mouse embryonic stem cells.</a> Stem Cells. 27 (12), 3012-3020 (2009).</li>
<li>Ramos, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+functional+human+thymic+cells+from+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Allergy+Clin+Immunol%22%5BJournal%5D)">Generation of functional human thymic cells from induced pluripotent stem cells.</a> J Allergy Clin Immunol. 149 (2), 767-781 (2022).</li>
<li>Provin, N., Giraud, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiation+of+pluripotent+stem+cells+into+thymic+epithelial+cells+and+generation+of+thymic+organoids%3A+Applications+for+therapeutic+strategies+against+APECED%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Differentiation of pluripotent stem cells into thymic epithelial cells and generation of thymic organoids: Applications for therapeutic strategies against APECED.</a> Front Immunol. 13, 930963(2022).</li>
<li>Montel-Hagen, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+recapitulation+of+murine+thymopoiesis+from+single+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">In vitro recapitulation of murine thymopoiesis from single hematopoietic stem cells.</a> Cell Rep. 33 (4), 108320(2020).</li>
<li>Park, J. -E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+cell+atlas+of+human+thymic+development+defines+T+cell+repertoire+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A cell atlas of human thymic development defines T cell repertoire formation.</a> Science. 367 (6480), 3224(2020).</li>
<li>Flippe, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+and+reproducible+differentiation+of+hematopoietic+and+T+cell+progenitors+from+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Rapid and reproducible differentiation of hematopoietic and T cell progenitors from pluripotent stem cells.</a> Front Cell Dev Biol. 8, 577464(2020).</li>
<li>Padonou, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aire-dependent+transcripts+escape+Raver2-induced+splice-event+inclusion+in+the+thymic+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+Rep%22%5BJournal%5D)">Aire-dependent transcripts escape Raver2-induced splice-event inclusion in the thymic epithelium.</a> EMBO Rep. 23 (3), e53576(2022).</li>
<li>Han, J., Zúñiga-Pflücker, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-oxygen+submersion+fetal+thymus+organ+cultures+enable+FOXN1-dependent+and+-independent+support+of+T+lymphopoiesis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">High-oxygen submersion fetal thymus organ cultures enable FOXN1-dependent and -independent support of T lymphopoiesis.</a> Front Immunol. 12, 652665(2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Aprotinin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>616370</td><td></td></tr><tr><td>BMP4</td><td>Miltenyi</td><td>130-111-165</td><td></td></tr><tr><td>CCR7 (CD197)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: 3D12; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD14</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>שיבוט: M5E2; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD19</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט PE</td>: <td>HIB19; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD205</td><td>BioLegend</td><td>FITC</td><td>שיבוט: MG38; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD3</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט PE</td>: <td>HIT3a; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD34</td><td>BD Biosciences</td><td>FITC</td><td>שיבוט: 8G12; דילול: 1: 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט PE</td>: <td>RPA-T4; דילול: 1: 100</td></tr><tr><td>CD4</td><td>BD Biosciences</td><td>BV711</td><td>שיבוט: L200; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD45</td><td>BD Biosciences</td><td>PerCP</td><td>שיבוט: HI30; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD56</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט PE</td>: <td>B159; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD62L</td><td>BD Biosciences</td><td>BV605</td><td>שיבוט: DREG-56; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD69</td><td>BD Biosciences</td><td>BV510</td><td>שיבוט: FN50; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD7</td><td>BD Biosciences</td><td>APC</td><td>שיבוט: M-T701; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>PeCy7</td><td>שיבוט: RPA-T8; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>CD8</td><td>BD Biosciences</td><td>שיבוט PE</td>: <td>HIT8a; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>Dynabeads Pan Mouse IgG</td><td>Invitrogen</td><td>11041</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Miltenyi</td><td>130-097-751</td><td></td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>BD Biosciences</td><td>PE</td><td>Clone: HEA-125; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>EPCAM (CD326)</td><td>Miltenyi</td><td>BV711</td><td>שיבוט: EBA-1; דילול: 1: 200</td></tr><tr><td>FGF10</td><td>Miltenyi</td><td>130-127-858</td><td></td></tr><tr><td>FGF8</td><td>Biotechne R& D</td><td>423-F8</td><td></td></tr><tr><td>פיברינוגן</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>341578</td><td></td></tr><tr><td>FLT3 L</td><td>פפרוטק</td><td>AF-300-19</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax</td><td>Gibco</td><td>35050-61</td><td></td></tr><tr><td>IGF1</td><td>Miltenyi</td><td>130-093-886</td><td></td></tr><tr><td>IL7</td><td>Peprotech</td><td>AF-200-07</td><td></td></tr><tr><td>RANK L</td><td>Biotechne R& D</td><td>6449-TEC</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת ליזה של תאי דם אדומים</td><td>Miltenyi</td><td>130-094-183</td><td></td></tr><tr><td>RPMI1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td></td></tr><tr><td>SCF</td><td>Peprotech</td><td>AF-300-07</td><td></td></tr><tr><td>Thrombin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>605190</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>2605010</td><td></td></tr><tr><td>XVIVO10</td><td>Lonza</td><td>LONBE04-380Q</td><td></td></tr></tbody></table>

היווצרות אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין

Formation of Human Thymus Organoids in Three-Dimensional Fibrin Hydrogels

זרימת העבודה של הפרוטוקול מסוכמת באיור 4. עבור מודל תרבית אורגנואידים תלת-ממדי זה, אימצנו הידרוג'ל תרומבין ופיברינוגן ששימש בעבר את הצוות שלנו כדי לשמור על mTECs עכבר ראשוניים במשך כמה ימים, הודות לרמזים הפיזיים והמכניים שהוא סיפק34. לאחר פילמור, הג'ל אמור להציג מבנה רשת רופף דמוי ספוג (איור 5).
לאחר שלב הזריעה וההתקשרות הראשוני, האורגנואידים גדלו והתפתחו בהדרגה הן על פני השטח והן בתוך השכבות העליונות של הג'ל. בהתאם לתכונות הג'ל, תנאי הזריעה ומספר האורגנואידים שנזרעו על הג'ל, האורגנואידים יצרו מבנים כדוריים עד מלבניים (איור 6) ומדי פעם התמזגו ליצירת מבנים גדולים יותר. שתי תת-רמות מסוימות של הארגון נצפו בתוך האורגנואידים לאחר השבוע הראשון של התרבית: ראשית, צפינו במבנים ארוכים דמויי הקרנה של פני התא שנוצרו על-ידי תאים גדולים המקרינים מהאורגנואידים ומאכלסים את ההידרוג'ל לכל הכיוונים (איור 6 ואיור 7). שנית, צפינו במבנים דמויי צביר שנוצרו על-ידי תאים קטנים יותר שהתרכזו סביב הקרנות התאים האלה. אף על פי שלא הצלחנו לבודד את שני סוגי התאים כדי לאשש את השערת המחקר, תופעה זו מזכירה סידורים תלת-ממדיים שנמצאים בתוך קליפת המוח התימית, שנוצרו על-ידי אינטראקציה של cTECs בודדים עם מספר גדול של תאי T מתפתחים קטנים בהרבה, הידועים כקומפלקסים של תאי אחות תימיים11 (איור 8).
בכמה נקודות זמן במהלך שלב תרבית האורגנואידים, הערכנו את ההרכב התאי של האורגנואידים התימיים לפי ציטומטריית זרימה וזיהינו כמה תאים מרכזיים: TEC (מאופיין כ-EPCAM+ CD45-), תימוציטים (EPCAM- CD45+ CD3+) (איור 9), כמו גם תא EPCAM- CD45+ CD3 הכולל תת-קבוצות המטופויטיות תימיות שאינן תימוציטים. פרטים נוספים ניתן למצוא ב Provin et al.23.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig01.jpg"> איור 1: אפיון התמיינות iPSC ל-TEP. (A) דוגמה להתמיינות iPSC ל-TEP ב-D13, מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, 400x. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. (B) דוגמה לתרשים נקודה, היחס של תאי EPCAM+ בין תאי DAPI ביום 14 להתמיינות, תמונה מתוך FlowJo 10.0.7. (C) צביעה חיסונית כנגד DAPI (כחול), PAX9 (אדום) ו-KRT8 (ירוק), אימונופלואורסנציה והדמיה קונפוקלית ביום ה-16 של התמיינות iPSC ל-TEP. חיצים לבנים מצביעים על דוגמאות לצביעה נגד PAX9. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר (D) רמת ביטוי של FOXN1 (RQ ל-GAPDH) במהלך הבחנה בין iPS ל-TEP. TEC: ייחוס בקרה חיובית, TECs אנושיים ראשוניים שבודדו מדגימות בלוטת התימוס בילדים. גרף מפריזמה (GraphPad גרסה 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig02.jpg"> איור 2: מערך ניסיוני ליצירת הידרוג'ל, זריעת אורגנואידים ופיזור מדיום תרבית. (A) צלחת תרבית עם הידרוג'לים יצוקים לתוספות תלויות המונחות בשורה העליונה והתחתונה. (B) זריעת אורגנואידים: חרוט הפיפטה החתוך המכיל אורגנואיד אחד מונח מעל ההידרוג'ל מבלי לגעת בו, והאורגנואיד נזרע בעדינות על פני השטח של הג'ל. (ג) מדיום התרבות מופקד היטב בתרבות על ידי מיקום קצה הפיפטה בין זרועות התוספת התלויה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig03.jpg"> איור 3: D0 של תרבית אורגנואידים תימיים לפני הזריעה (ימים 13-15 של הפרוטוקול המלא). (A) אורגנואיד המיוצר באמצעות TECs הנגזרים מקו Lon71.019 iPS. (B) אורגנואיד המיוצר עם TECs הנגזרים מקו MIPS203.003 iPS. מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, 1000x. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig04.jpg"> איור 4: ייצוג מסכם של כל שלבי הפרוטוקול. דגימות בלוטת התימוס בילדים נאספו ומנותקות, ו-ETPs ראשוניים של Lin- CD34+ CD7+ מוינו לפי ציטומטריית זרימה. התמיינות תאי iPS נעשתה לקראת זהות TEP. ETPs ו-TEPs שמקורם ב-iPS אוגמו ונזרעו בצלחות בעלות קישור נמוך של 96 בארות ונצברו לאורגנואידים תימיים בן לילה. הידרוג'ל פיברין הוכנו מאפרוטנין, פיברינוגן ותרומבין ונוצקו לתוספות תלויות. לאחר פילמור, האורגנואידים נזרעו על גבי ההידרוג'לים, ומדיום התרבית שלב 1 נוסף לבארות. האורגנואידים נשמרו בתרבית עד 6 שבועות. נוצר ב- BioRender, רישיון פרסום AG26EFCZOM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig05.jpg"> איור 5: ארגון ומבנה ההידרוג'ל. מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, 1000x. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig06.jpg"> איור 6: אורגנואידים בוגרים ומבנה תלת-ממדי. (A) אורגנואיד תימי ביום ה-24 לתרבית תלת-ממדית, קו MIPS203.003 iPS. (B) תמונה מורכבת של אורגנואיד תימי ביום ה-32 לתרבית תלת-ממדית, קו Lon71.019 iPS. מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig07.jpg"> איור 7: פרטי מבנה של אורגנואידים תימיים. (A) אורגנואיד תימי ביום 32 לתרבית תלת-ממדית, קו L71.019 iPS. (B) אורגנואיד תימי ביום ה-27 של תרבית תלת-ממדית, קו L80.002 iPS. מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, 400x. פסי קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig08.jpg"> איור 8: פרט מבנה של אורגנואיד תימי ביום ה-32 של התרבית התלת-ממדית. חיצים לבנים מצביעים על צבירים של תימוציטים קטנים המתרבים בסמיכות לתאי TEC. מיקרוסקופ ניגודיות פאזה הפוכה, 400x. סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig08large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66795/66795fig09.jpg"> איור 9: פרופורציה של תא T בתוך אורגנואידים תימיים. (A) דוגמה לתרשים נקודה, פרופורציה של תאי CD45+ CD3+ בתוך התאים החיים (DAPI-) באורגנואידים תימיים ביום 35 של תרבית תלת ממדית, תמונה מתוך FlowJo 10.0.7. מקטע CD45+ CD3 מכיל תאים המטופויטיים שאינם תימוציטים. (B) חלקם של תאי CD45+ CD3+ בתוך תאים חיים באורגנואידים תימיים בימים 17, 24/25, 32 ו-39/40 של תרבית תלת-ממדית, n=2 בגרף טכני כפול או משולש מפריזמה (GraphPad גרסה 8.0.1). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66795/66795fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>יחידה</td>
			<td>שלב 1 בינוני יום 14 עד יום 18</td>
			<td>שלב 2 בינוני יום 19 ואילך</td>
		</tr><tr><td>בסיס</td>
			<td></td>
			<td>XVIVO10</td>
			<td>XVIVO10</td>
		</tr><tr><td>BMP4</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>50</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF8</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>FGF10</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>IGF1</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>EGF</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>10</td>
			<td></td>
		</tr><tr><td>דרגה L</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>50</td>
			<td>50</td>
		</tr><tr><td>IL7</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>FLT3 L</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>5</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>SCF</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>10</td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td>גלוטמקס</td>
			<td>נ"ג/מ"ל</td>
			<td>1%</td>
			<td>1%</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: תוספים וריכוזיהם בהתאמה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td>
			<td>אפרוטינין (μL)</td>
			<td>טרומבין (μL)</td>
			<td>פיברינוגן (μL)</td>
			<td>שלב 1 בינוני</td>
			<td>אורגנואידים (יחידה)</td>
		</tr><tr><td>24 צלחת באר</td>
			<td>5</td>
			<td>75</td>
			<td>75</td>
			<td>1</td>
			<td>3 עד 5</td>
		</tr><tr><td>12 צלחת באר</td>
			<td>9.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>138.2</td>
			<td>1.8</td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td>6 צלחת באר</td>
			<td>16</td>
			<td>240.8</td>
			<td>240.8</td>
			<td>3.2</td>
			<td>8 עד 9</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 2: יחסי הרכיבים הנדרשים להכנת הידרוג'לים ולזריעת אורגנואידים בצלחות בנות 6, 12 ו-24 בארות.

Generation of a functional and self-tolerant T cell repertoire is a complex process dependent on the thymic microenvironment and, primarily, on the ...

formation-human-thymus-organoids-three-dimensional-fibrin

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

בסרטון זה הכנת 2-dGuo שטופלו reaggregate תרבויות התימוס מודגם.

Reaggregate תרבויות קורנית

חקר תאי אפיתל תימיים מדולריים במבחנה לא הצליח ברובו, מכיוון שמערכות התרבית הדו-ממדיות הנוכחיות אינן מחקות את תרחיש in vivo. מערכת התרבית התלת-ממדית המתוארת כאן - מודל תרבית אורגנוטיפית של עור שונה - הוכיחה את עצמה כעדיפה בסיכום התפשטות mTEC, התמיינות ותחזוקה של ביטוי גנים מופקר.

דגם 3D Organotypic משותף תרבות תמיכה למניעת הפצת נשק מדולרי הרתי אפיתל תאים, התמיינות וביטוי גנים מופקר

סרטון זה מדגים פרוטוקול להעשרת תאי אפיתל תימיים (TECs) עם שיפוע צפיפות לבידוד FACS. הוא גם מראה את השימוש בפפטידים EAK16-II/EAKIIH6 כדי לקדם את היווצרות הצבירה של TEC. המיקרו-סביבות של הידרוג'ל EAK16-II/EAKIIH6 מספקות את התצורה התלת-ממדית הדרושה לשמירה על ההישרדות והתפקוד של ה-TEC.

קידום Aggregation 3-D של תאי אפיתל הרתי המטוהר FACS עם EAK 16-II / EAKIIH6 עצמית להרכבת הידרוג&#39;ל

מטרת פרוטוקול זה היא להסביר ולהדגים את התפתחותו של מודל מיקרופלואידי תלת מימדי (3D) של רקמת לב אנושית מיושרת מאוד, המורכבת מקרדיומיוציטים שמקורם בתאי גזע במשותף עם פיברובלסטים לבביים (CFs) בתוך הידרוג'ל ביומימטי, מבוסס קולגן, ליישומים בהנדסת רקמת לב, הקרנת תרופות ומידול מחלות.

פיתוח רקמת לב אנושית מאורגנת תלת מימדית בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית

כאן אנו מדגימים מודל אורגנואיד תלת שלבי (הרחבה דו-ממדית [2D], גירוי דו-ממדי, הבשלה תלת-ממדית [3D]) המציע כלי מבטיח למחקר בסיסי בגידים ושיטה פוטנציאלית ללא פיגומים להנדסת רקמות גידים.

הדגמה של תרבית יריעות תאים בהרכבה עצמית ויצירה ידנית של אורגנואיד תלת-ממדי דמוי גיד/רצועה באמצעות פיברובלסטים עוריים אנושיים

פרוטוקול זה מציג שיטה ליצירת אורגנואידים וסקולריים באמצעות תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים.

יצירת אורגנואידים וסקולריים מתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי אדם

פרוטוקול זה מתאר שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים של שד אנושי המשקפים תכונות מרכזיות של מורפוגנזה של השד במערכת תרבית תלת-ממדית מבוקרת.

שיטה מוגדרת מבוססת הידרוג'ל ליצירת אורגנואידים תלת-ממדיים של שד אנושי המשחזרים מורפוגנזה של השד

מתוך כוונה לאפיין שינויים ב-miRNAs על תאי גזע עצביים אנושיים מובחנים (hNSCs) אנו מתארים התמיינות hNSC במערכת תלת מימדית, הערכת שינויים בביטוי microRNA על ידי מערך miRNA PCR, וניתוח חישובי לחיזוי יעד miRNA ואימותו על ידי בדיקת לוציפראז כפולה.

בידול של קו תאי גזע עצבי אדם בשלוש תרבויות ממדים, גני ניתוח של MicroRNA והמשוער יעד

קוצים הדנדריטים של נוירונים פירמידה הם האתרים של רוב סינפסות המעוררות בקליפת המוח של יונקים. שיטה זו מתארת ​​ניתוח כמו 3D של מורפולוגיות עמוד השדרה בנוירונים glutamatergic הפירמידה אנושיים בקליפת המוח שמקורם בתאי גזע pluripotent מושרה.

כימות תלת ממדיות של קוצים הדנדריטים מפירמידת נוירונים שמקורם בתאי גזע האנושי המושרה pluripotent

פרוטוקול זה מתאר את המדידה של מחסום האפיתל חדירות בטיפול תרופתי בזמן אמת הבאים בהאדם organoids מעיים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי ולחיות התא מיקרוסקופ.

בזמן אמת מדידה של מחסום האפיתל חדירות ב Organoids מעיים אנושיים

למד ליצור אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין. שיטה זו תומכת בהבשלה של תאים אפיתליים תימיים ומאפשרת חקר מנגנוני סבלנות עצמית ואוטואימוניות במעבדה.

היווצרות אורגנואידים של בלוטת התימוס האנושית בהידרוג'לים תלת מימדיים של פיברין

גלה סרטונים נוספים