Name: ויטריפיקציה של רקמת קליפת המוח השחלתית להשגת מצב זגוגי של צבירה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-09T13:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: למד את פרוטוקול הויטריפיקציה של רקמת קליפת השחלה לשימור פוריות בחולות צעירות עם סרטן. השיטה משמרת זקיקים ביעילות רבה יותר מהקפאה איטית ומאפשרת הריונות מוצלחים בעתיד.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת כדאיות זקיקים ברקמות קליפת המוח השחלתית האנושית המבחנה

<table><tbody><tr><td>בקבוקונים של 1.8 מ"ל</td><td>VWR International GmbH</td><td>479-6837</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל פיפטה סרולוגית</td><td>Sarstedt</td><td>86.1254.001</td><td></td></tr><tr><td>4 צלחת באר</td><td>Gynemed</td><td>GYOOPW-FW04</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור</td><td>Sarstedt</td><td>62.559.001</td><td></td></tr><tr><td>6 לוחות באר</td><td>Sarstedt</td><td>83.3920</td><td></td></tr><tr><td>Bacillol AF</td><td>Hartmann</td><td>973385</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Merck</td><td>17783</td><td></td></tr><tr><td>קולגנאז סוג 1A</td><td>Merck</td><td>C2674</td><td></td></tr><tr><td>Cryosure DMSO</td><td>WAK Chemie</td><td>WAK-DMSO-10</td><td></td></tr><tr><td>Custodiol</td><td>Dr. Franz K&ouml; hler Chemie</td><td>00867288</td><td></td></tr><tr><td>DPBS CTS</td><td>Gibco Life technologies</td><td>A12856-01</td><td></td></tr><tr><td>ErgoOne pipette</td><td>aid Starlab</td><td>S7166-0010</td><td></td></tr><tr><td>אתילן גליקול</td><td>סיגמא אולדריץ'</td><td>102466</td><td></td></tr><tr><td>Euronda מיכל עיקור euronda</td><td></td><td>282021</td><td></td></tr><tr><td>G-MOPS+</td><td>Vitrolife</td><td>10130</td><td></td></tr><tr><td>מתכת רשתות</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S0770</td><td></td></tr><tr><td>Metzenbaum מספריים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>501262102</td><td></td></tr><tr><td>N-Bath System</td><td>Nterilizer</td><td>N-Bath 3.0</td><td></td></tr><tr><td>Polyvinylpyrrolidone (PVP)</td> <td>SAGE</td><td>ART-4005</td><td></td></tr><tr><td>תוסף תחליף סרום (SSS)</td> <td>Fujifilm Irvine Scientific</td><td>99193</td><td></td></tr><tr><td></td> <td>סטריליתSarstedt</td><td>75.562.105</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים סטריליים</td><td>קארל רוט</td><td>KL05.1</td><td></td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>Merck</td><td>S0389</td><td></td></tr></tbody></table>

ויטריפיקציה של רקמת קליפת המוח השחלתית להשגת מצב זגוגי של צבירה

Vitrification of Ovarian Cortex Tissue to Achieve a Glassy State of Aggregation

פרוטוקול זה מציג את הנהלים להכנת אמצעי ויטריפיקציה, מכשירי טעינה, ויטריפיקציה, הכנת אמצעי התחממות מהירה, התחממות מהירה וקביעת כדאיות זקיקים. השוואה ישירה של כדאיות זקיקים וגורמים אנגיוגניים בין הקפאה איטית לוויטריפיקציה אומתה ופורסמה31,32.
ההצלחה הכוללת של פרוטוקול הוויטריפיקציה המתואר הוערכה על ידי השוואת ספירת הזקיקים החיוניים לפני ואחרי ויטריפיקציה/התחממות מהירה. מערך הניסוי מוצג באיור 1, והתוצאות מוצגות באיור 6. ב-50 חולים נצפתה ספירה ממוצעת של 77.98 זקיקים חיוניים לפני ויטריפיקציה ו-62.99 לאחר ויטריפיקציה/התחממות מהירה, המשקפת שיעור הישרדות של 80.8%. זה לא היה שונה באופן משמעותי על פי מבחן וילקוקסון33.
רשתות מתכת מותאמות אישית עם מספריים חדים לגודל של 25 מ"מ x 8 מ"מ, אשר מתאים למכסים של קריובלים של 1.8 מ"ל, כפי שמוצג באיור 2A,C. לאחר עיקור באמצעות אוטוקלאבינג בקיטור, הרשתות והמכסים של בקבוקונים בנפח 1.8 מ"ל מורכבים מתחת לספסל זרימה למינרי, כפי שמצוין באיור 2B. מערך זה מספק אחיזה בטוחה בפקק ללא צורך בפעולות נוספות ומציע שטח מספיק לרקמות בגדלים שונים. בדרך כלל, חתיכות רקמה של 5 מ"מ x 10 מ"מ להשתלה וחתיכות בקוטר 2 מ"מ להערכת ספירת זקיקים חיונית לאחר הפשרה מהירה הן זגוגיות. שני הגדלים מתאימים באופן מושלם לרשתות המתכת.
שיווי משקל עם תמיסות ויטריפיקציה (VS1, VS2 ו-VS3) מתבצע בצלחת בת 6 בארות על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר מתחת לספסל זרימה למינרי, כפי שמוצג באיור 3. מסגרות הזמן בתכנית מבטיחות ספיגה יעילה של אתילן גליקול cryoprotectant. מומלץ להשתמש בצלחת בעלת 6 בארות מעל כלי דם בודדים מכיוון שהיא מאפשרת תנועה מהירה של הרקמה בין תמיסות ומסייעת במניעת ערבובים.
עבור ויטריפיקציה אנכית מהירה בחנקן נוזלי, רקמת קליפת המוח השחלתית נחתכת לחתיכות מתאימות (איור 4A). דגימות מקליפת המוח של השחלות ממוקמות על מכשירי העמסה (איור 4B,C) ושקועות אנכית בחנקן נוזלי (איור 4D) כדי להשיג מצב זכוכית של צבירה באמצעות ויטריפיקציה. רשתות המתכת שנבחרו מאפשרות טיפול אנכי ברקמה, כפי שניתן לראות באיור 4D. בנוסף, רשתות המתכת מוליכות תרמית מאוד, ומבטיחות קצבי קירור מהירים מ -22 ° C ל -196 ° C, המהווה שלב חשוב ביותר בתהליך הוויטריפיקציה.
להתחממות מהירה, RWS מוכן בכוס סטרילית בטמפרטורה של 37°C. ES, RS1 ו-RS2 מוכנים בצלחת של 6 בארות על שייקר נדנדה בטמפרטורת החדר, כפי שמוצג באיור 5. הנפח הגבוה של RWS שחומם מראש מונע מהתמיסה להתקרר יתר על המידה עם הוספת הרקמה המזוגגת ומבטיח סביבה חמה באופן עקבי לרקמה לאורך כל תהליך ההתחממות המהירה.
כדי להעריך ולהבטיח תקני איכות גבוהים, אגרופי ביופסיה בגודל 2 מ"מ x 2 מ"מ מוכתמים בקלצין לפני ויטריפיקציה ולאחר התחממות מהירה כדי לקבוע את כדאיות הזקיקים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי34,35 (איור 6). זקיקים בני קיימא פולטים פלואורסצנטיות ירוקה ב-495 ננומטר לאחר ספיגה תוך-תאית של קלצאין. לחלופין, ניתן להעריך את כדאיות הזקיקים (טבלה 3) באמצעות צבעים אדומים ניטרליים36.
על ידי ביצוע השלבים המתוארים בפרוטוקול זה, רקמת השחלה הופכת למצב זכוכית של צבירה, המאפשר שיעורי הישרדות גבוהים לאחר התחממות מהירה, כפי שאושר על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig01.jpg"> 
איור 1: עיצוב המחקר. דגימות קליפת המוח של השחלות מ-50 מטופלות נבדקו לפני (טרי) ואחרי ויטריפיקציה והתחממות מהירה עבור מספר הזקיקים הקיימים. עבור כל קבוצה, שתי פיסות רקמה בקוטר 2 מ"מ גודלו בתרבית במשך 24 שעות לפני הערכת ספירת הזקיקים. הרקמה עוכלה עם collagenase ומוכתמת בקלצין כדי להעריך את הכדאיות. מספר הזקיקים בני קיימא נקבע באמצעות מיקרוסקופ. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig02.jpg"> 
איור 2: הכנת מכשירי טעינה. רשתות מתכת נחתכו לגודל של 8 מ"מ x 25 מ"מ (A). רשתות המתכת המותאמות אישית עוקרו על ידי אוטוקלאבינג (B). רשתות המתכת המעוקרות הוכנסו למכסים של בקבוקונים בנפח 1.8 מ"ל, מוכנים לשימוש (C). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig03.jpg"> 
איור 3: הכנת תמיסות ויטריפיקציה. פתרונות ויטריפיקציה (VS) הוכנו והועברו לצלחת 6 בארות. הבארות מציגות את הנפח של כל תמיסה ואת זמני הדגירה האינדיבידואליים המשמשים בפרוטוקול הוויטריפיקציה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig04.jpg"> 
איור 4: עיבוד וויטריפיקציה של קליפת המוח השחלתית. רקמת קליפת המוח השחלתית עובדה לשימור בהקפאה על ידי הסרת המדולה וחיתוך הרקמה לחתיכות בגודל 5 מ"מ x 10 מ"מ (A). לאחר הדגירה בתמיסות הוויטריפיקציה המוצגות באיור 3, הרקמה הועמסה על מכשיר טעינת הוויטריפיקציה (B,C). עבור ויטריפיקציה אנכית מהירה של דגימות קליפת השחלות, הכובעים עם הרקמה הטעונה הוכנסו במהירות לחנקן נוזלי מעוקר (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig05.jpg"> 
איור 5: הכנת פתרונות התחממות מהירה. תמיסת התחממות מהירה (RWS), תמיסת שיווי משקל (ES) ותמיסות שטיפה (RS) 1 ו-2 הוכנו והועברו לצלחת בעלת 6 בארות. הכלים והבארות מראים את הנפח של כל פתרון ואת זמני הדגירה המתאימים. שים לב כי RWS נשמר ב 37.2 ° C על צלחת חימום. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66801/66801fig06.jpg"> 
איור 6: ספירת כדאיות. כדי להעריך את מספר הזקיקים קיימא, חתיכות רקמה בקוטר 2 מ"מ עוכלו עם collagenase ומוכתמות עם calcein. התמונות המייצגות מראות (A) צביעת קלצאין של 3 זקיקים שנמצאו לפני ויטריפיקציה. (B) זקיק בר קיימא שהתאושש לאחר ויטריפיקציה והתחממות מהירה. (C) זקיק בר קיימא שהוחזר לפני הקפאה איטית. (D) זקיקים ברי קיימא שנמצאו לאחר הקפאה והפשרה איטיות. כדאיות זקיקים מסומנת על ידי calcein, צבע פלואורסצנטי ירוק הפולט פלואורסצנטיות ירוקה כאשר מומר אנזימטית על ידי תאים קיימא ב 495 ננומטר. סרגל קנה מידה = 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66801/66801fig06large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>VS 1 (15 מ"ל)</td>
			<td>אתילן גליקול</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>אס.אס.אס</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>12 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>לעומת 2 (15 מ"ל)</td>
			<td>אתילן גליקול</td>
			<td>20%</td>
			<td>3 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>אס.אס.אס</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>10.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>VS 3 (15 מ"ל)</td>
			<td>אתילן גליקול</td>
			<td>35%</td>
			<td>5.25 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>אס.אס.אס</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>סוכרוז</td>
			<td>0.5 מול/ל'</td>
			<td>2.57 גרם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>PVP</td>
			<td>5 % (ללא רב)</td>
			<td>0.75 גרם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>מודעה 15 מ"ל</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: הרכב פתרונות ויטריפיקציה (VS).
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>RWS (30 מ"ל)</td>
			<td>סוכרוז</td>
			<td>0.8 מול/ליטר</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>8.22 גרם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>אס.אס.אס</td>
			<td>10%</td>
			<td>3 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>מודעה 30 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ES (15 מ"ל)</td>
			<td>סוכרוז</td>
			<td>0.4 מול/ל</td>
			<td>2.05 גרם</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>אס.אס.אס</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>מודעה 15 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RS 1&amp;2 (15 מ"ל)</td>
			<td>אס.אס.אס</td>
			<td>10%</td>
			<td>1.5 מ"ל</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>G-MOPS+</td>
			<td></td>
			<td>מודעה 15 מ"ל</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 2: הרכב תמיסת התחממות מהירה (RWS), תמיסת שיווי משקל (ES) ותמיסות שטיפה (RS). טבלה זו מספקת את הרכיבים והריכוזים עבור תמיסת ההתחממות המהירה (RWS), תמיסת שיווי משקל (ES) ותמיסות שטיפה (RS) המשמשות בעיבוד שלאחר ויטריפיקציה.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>פרמטר</td>
			<td>טריים</td>
			<td>מרווח זמן</td>
			<td>התחממות מהירה לאחר ויטריפיקציה</td>
			<td>מרווח זמן</td>
			<td>n</td>
			<td>*ערך P</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td>SD</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ספירת כדאיות זקיקים [n]</td>
			<td>77.98</td>
			<td>0-386</td>
			<td>62.99</td>
			<td>0.5-349</td>
			<td>50</td>
			<td>0.130</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>77.95</td>
			<td></td>
			<td>80.02</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>*מבחן Wilcoxon</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 3: תוצאות מייצגות של כדאיות זקיקים. טבלה זו מציגה את התוצאות של הערכות כדאיות זקיקים לפני שימור בהקפאה ולאחר התחממות מהירה. שתי פיסות רקמה בקוטר 2 מ"מ לכל מטופל שימשו לספירת מספר הזקיקים הקיימים לפני ואחרי ויטריפיקציה/התחממות מהירה. דגימות רקמה מזווגים של 50 חולים נותחו באמצעות מבחן Wilcoxon.

Ovarian tissue cryopreservation (OTC) is an important option for fertility preservation. For patients whose gonadotoxic treatments cannot be postponed or ...

vitrification-ovarian-cortex-tissue-to-achieve-glassy-state

Research

JoVE Journal

Medicine

רפואה

כאן אנו מציגים עיבוד של בהירות פסיבי, שיטת שחזור תלת-ממד עבור ויזואליזציה של השחלות להערכת, נימים הזקיקים השחלות העכבר ללא פגע.

שחזור תלת מימדי של הארכיטקטורה כלי הדם של השחלה העכבר בהירות-והפנים פסיבי

כתב יד זה מתאר פרוטוקול עבור אמצעי האחסון המינימלי של ויטריפיקציה של חתולים בלתי בוגרים עם מדיה מתוצרת מעבדה על תמיכות מסחריות. הוא מכסה כל צעד מ oocyte בידוד מ vivo גונדות לשעבר כדי ויטריפיקציה והתחממות.

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

תרבות מבינטית של קליפת המוח השחלות שור ואת ההשפעה של דיאטה תזונתית מדרגות צעד על microenvironment השחלות מוצג. חתיכות קליפת המוח השחלתית היו מתורבתים במשך שבעה ימים, סטרואידים, ציטוקינים, ושלבי זקיק הוערכו. טיפול דיאטה מדרגות-צעד היה סטרואידוגנזה מוגברת וכתוצאה מכך התקדמות זקיק בתרבות.

תרבית רקמת קליפת המוח השחלות

שימור קריופרציה של Oocyte מוכר על ידי מספר חברות מדעיות בינלאומיות כסטנדרט הזהב לשימור פוריות אצל נשים לאחר הפוסט-פוסט-פוריות. אסטרטגיות קליניות ומעבדות מתאימות מבטיחות יעילות מרבית, יעילות ובטיחות של טיפולי שימור פוריות.

שימור פוריות באמצעות ויטריפיקציה של אוציט: פרספקטיבות קליניות ומעבדתיות

הפרוטוקול נועד לספק שיטה סטנדרטית לרטט של ביציות כבשים בוגרות וצעירות. הוא כולל את כל השלבים מהכנת אמצעי ההבשלה במבחנה לתרבות שלאחר ההתחממות. אוציטים עוברים רטט בשלב MII באמצעות Cryotop כדי להבטיח את עוצמת הקול החיונית המינימלית.

ויטריפיקציה של אין ויטרו התבגר אוציטס שנאספו מן השחלות למבוגרים טרום-פוברטל בכבשים

צוות ייעודי יכול להציע למטופלות מאייר-רוקיטנסקי-קוסטר-האוזר את האפשרות לבצע גירוי שחלות מבוקר ושימור ביציות בהקפאת בזמן הווגינופלסטיקה הלפרוסקופית.

שליפת ביציות לפרוסקופיות ושימור בהקפאה במהלך וגינופלסטיקה לטיפול בתסמונת מאייר-רוקיטנסקי-קוסטר-האוזר

פרוטוקול זה מתאר מודל תרבית תלת מימדי חדש (3-D) המשתמש בהידרוג'ל היאלורונן המקושר לטירמין כדי לעטוף ולתרבית זקיקים פרה-אנטרליים משחלת העכבר. אנו מפרטים גם שתי גישות לשימור הקפאה של זקיקי השחלות על ידי ויטריפיקציה.

יישום של הידרוג'ל היאלורונן חדשני לתרבית זקיקים תלת מימדית ומתודולוגיה לשימור הקפאה של זקיקי שחלות עכבר

מצב כפול הדמיה המערכת פותחה עבור הערכה ללא מגע של חמצון הרקמות עורית ותפקוד כלי הדם.

Dual-mode הדמיה של חמצון רקמות עורית ועל תפקוד כלי הדם

מאמר זה מדגים גישה ויזואלית חדשנית (photovoice או צילום ההתמחרות) כדי להשיג תהליך הוגן טיפול קליני בחולים החיים עם מצבים בריאותיים כרוניים, להאיר פערים בידע קליני, ליצור מערכות יחסים טיפולית טובה יותר, לזהות המטופל במרכז מטרות אפשרויות הריפוי .

באמצעות שיטות חזותית הנרטיב להשגת הליך הוגן בטיפול קליני

Assay אישור mesothelial המתוארת כאן מנצלת את התאים שכותרתו fluorescently ואת זמן לשגות מיקרוסקופיה וידאו להמחיש כמותית למדוד את יחסי הגומלין של סרטן השחלות spheroids תאיים ו monolayers התא mesothelial. Assay מתווך זה מדגים את השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

למד את פרוטוקול הויטריפיקציה של רקמת קליפת השחלה לשימור פוריות בחולות צעירות עם סרטן. השיטה משמרת זקיקים ביעילות רבה יותר מהקפאה איטית ומאפשרת הריונות מוצלחים בעתיד.

ויטריפיקציה של רקמת קליפת המוח השחלתית להשגת מצב זגוגי של צבירה

גלה סרטונים נוספים