Name: טיפול סיסטמי בעכברות לאחר לידה, נוער ועכברים בוגרים על ידי הזרקת סינוס רטרובולברית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-05-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 2 min 39 s
Description: למדו פרוטוקול הזרקת סינוס רטרובולברית בעכברים לטיפול גני במחלות מטבוליות. השיטה מאפשרת מסירה יעילה של תרפיות גן בעכברים קטנים ומקדמת מחקר קליני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מעריכים את הסיוע של צוות מתקן העכבר NHGRI, המעבדה לפתולוגיה מולקולרית של NCI, ובמיוחד אנדרו וורנר. R.J.C. נתמך על ידי תוכנית המחקר Intramural של NHGRI באמצעות 1ZIAHG200318-16 ועבודה זו מומנה חלקית על ידי המרכז הלאומי לקידום מדעי התרגום (NCATS). איור 2C נוצר באמצעות BioRender.

פרוטוקול זה והסרטון הנלווה אליו מיועדים למרחב הזרקת רטרובולבר של עכברים בוגרים לאחר לידה, נעורים ובוגרים בהזרקת סינוס רטרובולברי; הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (ACUC) של המכון הלאומי לחקר הגנום האנושי תחת פרוטוקול מספר G-03-4. למוסדות אחרים עשויות להיות דרישות והגבלות שונות, וייתכן שיהיה צורך לשנות פרוטוקול זה לאישור במכון שלך. קבל אישור מיחידת ACUC של המוסד שלך לפני ביצוע הליך זה או כל הליך אחר בבעלי חיים.
1. הכנה לפני הזרקה
<ol><li>יש לדלל את ה-AAV לנפח ולריכוז הרצויים בהזרקה עם מלח סטרילי חוצץ פוספט (PBS) בצינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי של 1.5 מ"ל לכל הזרקה. הוסף נפח נוסף של 50% לכל הזרקה כדי לאפשר מילוי מדויק של המזרק הסטרילי החד פעמי. הערה: כאן אנו מדללים כתב AAV8-CAG-eGFP כדי לספק מנה של 1 × 1013גנומים נגיפיים לכל ק"ג של מסת גוף (vg / kg) בנפח של 50 μL. כמות AAV ב 50 μL להיות מוזרק מחושב באמצעות המשקל של החיה בזמן ההזרקה. בסרטון זה, AAV מוזרק דרך מסלול retrobulbar כדי לשכפל העברה מערכתית בבני אדם. וקטורים אחרים של ריפוי גנטי (כלומר, לנטיוירוס, אדנווירוס), טיפולי RNA ומולקולות קטנות יכולים להיות מועברים באופן מערכתי באמצעות הליך זה.</li>
	<li>ודא שמערכת ההרדמה של בעלי חיים במעבדה (LAAS) מוגדרת ומתפקדת כראוי בהתאם להוראות היצרן. הערה: אם נעשה שימוש בשיטת הרדמה חלופית, ודא כי ההרדמה מוכנה לפני תחילת הזרקות. הליך הזרקת רטרובולבר צריך להיות תואם לרוב חומרי ההרדמה (למשל, ריסון כימי בהזרקה כמו קטמין וקסילזין).</li>
	<li>לפני מילוי המזרק הסטרילי החד-פעמי (כאן, מזרק אינסולין, 31 גרם, אורך 8 מ"מ, קיבולת 3/10 מ"ל), הזיזו את הבוכנה למעלה ולמטה מספר פעמים כדי להבטיח שניתן יהיה לדכא את הבוכנה בצורה חלקה. לאחר מכן, מלא את המזרק לנפח הרצוי, וודא שאין בועות אוויר. הערה: ניתן להזריק נפחים של עד 150 μL; המעבדה שלנו מזריקה בדרך כלל נפח של 50 μL.</li>
</ol>2. הרגעה עכברית באמצעות מתן גז איזופלורן עם מערכת הרדמה של חיות מעבדה (LAAS)
<ol><li>ודא שהגז זורם רק לתא האינדוקציה. סגור את הסטופקוק הדו-כיווני למעגל ללא נשימה מחדש (NRB).</li>
	<li>הפעל את ידית זרימת החמצן הירוקה בחזית מד הזרימה כך שיהיה קצב זרימה של 1 ליטר לדקה.</li>
	<li>סובבו את האיזופלורן ל-≤4% על ידי לחיצה על הידית בחלק העליון של הוופורייזר וסיבוב החוגה לריכוז הרצוי.</li>
	<li>מקם את העכבר בתא ההשראה השקוף. שימו לב היטב לנשימה ולתנועה של החיה. ברגע שהחיה שכובה, סובבו את ידית הוופורייזר ל-2-2.5% איזופלורן.</li>
	<li>פתח את הסטופק הדו-כיווני למעגל NRB המחובר למסיכת הפנים וסגור את זרימת הגז לתיבת האינדוקציה.</li>
	<li>הסר את בעל החיים והכנס אותו למסכת הפנים של מעגל NRB.</li>
	<li>הפחיתו את הגדרת ריכוז האיזופלורן ל-1.5%-1.75%, כפי שנקבע על ידי תגובה לגירויים (למשל, צביטת בוהן או לחיצת כפות).</li>
	<li>עקוב תמיד ברציפות אחר נשימת העכבר וצבע הקרום הרירי (במידת האפשר). אם נשימתו של בעל החיים נעשית מאומצת או שצבע הקרום הרירי אינו ורוד, הפחיתו את ריכוז חומר ההרדמה.</li>
	<li>שמור על חום בעל החיים לאורך כל ההליך. השתמש במחמם ידיים עטוף במגבת נייר המונחת מתחת לכרית התחתונה וממוקמת ישירות מתחת לעכבר.</li>
	<li>כבה את החמצן ואת הוופורייזר לאחר השלמת ההליך.</li>
</ol>3. הזרקת החיה
<ol><li>אם אתה ימני, הזריק את עינו הימנית של העכבר ומקם את העכבר על צדו השמאלי כשהחוטם מצביע לכיוון יד ימין. אם אתה שמאלי, הזריק את עינו השמאלית של העכבר ומקם את העכבר על צדו הימני כשהחוטם מצביע לכיוון יד שמאל.</li>
	<li>החל טיפה אחת או שתיים של הרדמה אופתלמית על גלגל העין, אשר יש להזריק. לאחר מכן, הסר כל תמיסת הרדמה אופתלמית עודפת באמצעות פד גזה סופג סטרילי. הפעילו לחץ עדין עם קצות האצבעות על העור, הגב והגחון לעין כדי להבליט חלקית את גלגל העין של העכבר מהשקע (איור 2A,B). הערה: היזהר לא להפעיל לחץ מוגזם על כלי צוואר הרחם שמסביב בעת הבלטת העין מכיוון שהדבר יעכב את זרימת הדם וההזרקה. בנוסף, הפעלת לחץ על קנה הנשימה עלולה למנוע מהעכבר לנשום. ודא שהעכבר יכול לנשום לאורך כל ההליך.</li>
	<li>השאירו את המחט במצב משופע בזווית של כ-30° והניחו אותה בתוך הקנטוס המדיאלי (איור 2C). הערה: עומק מיקום המחט כדי להגיע לסינוס retrobulbar ישתנה בהתאם לגודל החיה. הימצאות המחט במצב משופע במהלך ההזרקה מפחיתה את הסיכון לנזק עיני. היזהרו לא למקם את המחט עמוק מדי ולנקב את ארובת העין. הזריקה אמורה להימשך פחות מדקה.</li>
	<li>לאט ובצורה חלקה להפעיל לחץ על הבוכנה מזרק כדי לספק את ההזרקה. זה יקטין את הסיכוי של אקסטרווסציה.</li>
	<li>הסר את המחט לאט ובצורה חלקה.</li>
	<li>הסר את מסכת הפנים מהעכבר כדי לאפשר התאוששות מהרדמה.</li>
</ol>4. לאחר הזרקה
<ol><li>כבה את החמצן ואת הוופורייזר לאחר השלמת ההליך.</li>
	<li>השתמש גזה סטרילית כדי להסיר דם אם דימום שיורי מתרחשת.</li>
	<li>ודא שהעכבר נמצא באזור חם (כ -37 מעלות צלזיוס), אך לא חם מדי, כדי למנוע היפותרמיה במהלך ההתאוששות מהרדמה.</li>
	<li>התבוננו בעכבר בבידוד עד להחלמה מוחלטת לפני החזרת העכבר לכלוב ולמתלה. הערה: בידוד העכבר במהלך ההתאוששות מונע מחבריו לכלוב לפצוע את העכבר המורדם במהלך ההתאוששות.</li>
</ol>

העברה מערכתית יעילה בעכברים באמצעות טכניקת הזרקת רטרובולבר

<ol><li>Perlman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+models+of+human+disease%3A+An+evolutionary+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Evol+Med+Public+Health%22%5BJournal%5D)">Mouse models of human disease: An evolutionary perspective.</a> Evol Med Public Health. 2016 (1), 170-176 (2016).</li>
<li>Samelson-Jones, B. J., George, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus+gene+therapy+for+hemophilia%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Med%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus gene therapy for hemophilia.</a> Annu Rev Med. 74, 231-247 (2023).</li>
<li>Yardeni, T., Eckhaus, M., Morris, H. D., Huizing, M., Hoogstraten-Miller, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar injections in mice.</a> Lab Anim (NY). 40 (5), 155-160 (2011).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+for+methylmalonic+acidemia+using+the+novel+adeno-associated+viral+vector+44.9%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy for methylmalonic acidemia using the novel adeno-associated viral vector 44.9.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 61-72 (2022).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+aav9+gene+therapy+improves+the+lifespan+of+mice+with+niemann-pick+disease%2C+type+c1%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Systemic aav9 gene therapy improves the lifespan of mice with niemann-pick disease, type c1.</a> Hum Mol Genet. 26 (1), 52-64 (2017).</li>
<li>Venturoni, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+advantage+of+corrected+hepatocytes+in+a+juvenile+model+of+methylmalonic+acidemia+following+liver+directed+adeno-associated+viral+mediated+nuclease-free+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Metab%22%5BJournal%5D)">Growth advantage of corrected hepatocytes in a juvenile model of methylmalonic acidemia following liver directed adeno-associated viral mediated nuclease-free genome editing.</a> Mol Genet Metab. 137 (1-2), 1-8 (2022).</li>
<li>Ilyinskii, P. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immtor+nanoparticles+enhance+aav+transgene+expression+after+initial+and+repeat+dosing+in+a+mouse+model+of+methylmalonic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Immtor nanoparticles enhance aav transgene expression after initial and repeat dosing in a mouse model of methylmalonic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 22, 279-292 (2021).</li>
<li>Davidson, C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improved+systemic+aav+gene+therapy+with+a+neurotrophic+capsid+in+niemann-pick+disease+type+c1+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Improved systemic aav gene therapy with a neurotrophic capsid in niemann-pick disease type c1 mice.</a> Life Sci Alliance. 4 (10), e202101040(2021).</li>
<li>Chandler, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systemic+gene+therapy+using+an+aav44.9+vector+rescues+a+neonatal+lethal+mouse+model+of+propionic+acidemia%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Systemic gene therapy using an aav44.9 vector rescues a neonatal lethal mouse model of propionic acidemia.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 181-190 (2023).</li>
<li>Rocha-Ferreira, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+neonatal+rodent+model+of+retroorbital+vein+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A neonatal rodent model of retroorbital vein injection.</a> J Vis Exp. (204), e65386(2024).</li>
<li>Bohnert, B. N., Artunc, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+nephrotic+syndrome+in+mice+by+retrobulbar+injection+of+doxorubicin+and+prevention+of+volume+retention+by+sustained+release+aprotinin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Induction of nephrotic syndrome in mice by retrobulbar injection of doxorubicin and prevention of volume retention by sustained release aprotinin.</a> J Vis Exp. (135), e57642(2018).</li>
<li>Bohnert, B. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrobulbar+sinus+injection+of+doxorubicin+is+more+efficient+than+lateral+tail+vein+injection+at+inducing+experimental+nephrotic+syndrome+in+mice%3A+A+pilot+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Retrobulbar sinus injection of doxorubicin is more efficient than lateral tail vein injection at inducing experimental nephrotic syndrome in mice: A pilot study.</a> Lab Anim. 53 (6), 564-576 (2019).</li>
<li>Meijer, M. K., Spruijt, B. M., Van Zutphen, L. F., Baumans, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+restraint+and+injection+methods+on+heart+rate+and+body+temperature+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Effect of restraint and injection methods on heart rate and body temperature in mice.</a> Lab Anim. 40 (4), 382-391 (2006).</li>
<li>Nohara, M., Tohei, A., Sato, T., Amao, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+response+to+restraint+stress+by+salivary+corticosterone+levels+in+adult+male+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vet+Med+Sci%22%5BJournal%5D)">Evaluation of response to restraint stress by salivary corticosterone levels in adult male mice.</a> J Vet Med Sci. 78 (5), 775-780 (2016).</li>
<li>Schoch, A., Thorey, I. S., Engert, J., Winter, G., Emrich, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+routes+of+antibody+administration+in+pharmacokinetic+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus routes of antibody administration in pharmacokinetic studies.</a> Lab Anim (NY). 43 (3), 95-99 (2014).</li>
<li>Steel, C. D., Stephens, A. L., Hahto, S. M., Singletary, S. J., Ciavarra, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+lateral+tail+vein+and+the+retro-orbital+venous+sinus+as+routes+of+intravenous+drug+delivery+in+a+transgenic+mouse+model%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Anim+%28NY%29%22%5BJournal%5D)">Comparison of the lateral tail vein and the retro-orbital venous sinus as routes of intravenous drug delivery in a transgenic mouse model.</a> Lab Anim (NY). 37 (1), 26-32 (2008).</li>
<li>Zincarelli, C., Soltys, S., Rengo, G., Rabinowitz, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+aav+serotypes+1-9+mediated+gene+expression+and+tropism+in+mice+after+systemic+injection%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">Analysis of aav serotypes 1-9 mediated gene expression and tropism in mice after systemic injection.</a> Mol Ther. 16 (6), 1073-1080 (2008).</li>
</ol>

למחברים אין שום דבר רלוונטי לפרסום הזה לחשוף.

בעוד הזרקת רטרובולבר היא שיטה אמינה להעברת מולקולות קטנות, חלבונים וטיפולים גנומיים, תרגול הטכניקה עם צבע הוא הכרחי כדי להבטיח כי אספקה מערכתית אמינה וניתנת לשכפול מושגת. השימוש בצבע מומלץ מאוד לתרגול הזרקות רטרובולבר בעכברים לפני השימוש במסלול העברה זה בניסויים. ניתן לבדוק את הצבעים באופן חזותי ברקמות העכבר כדי להבטיח אספקה מערכתית עקבית.
בהדגמה שלנו של טכניקת הזרקת retrobulbar, גז isoflurane שימש להרדים את העכברים לפני ההליך. ניתן להשתמש בצורות אחרות של הרדמה לפני ההליך, אך חשוב לוודא שהעכבר אינו מתאושש מהטשטוש לפני השלמת ההזרקה. למרבה המזל, ההזרקה בפועל אורכת בדרך כלל פחות מדקה והזמן שבו העכבר צריך להיות מורדם לחלוטין הוא קצר. העכבר צריך להיות מורדם לחלוטין במהלך ההזרקה, ואת ההרדמה יש לקרוא אם העכבר הופך להכרה לפני ההזרקה. מכיוון שישנם סיכונים הקשורים לשימוש בהרדמה, יש למזער את משך הזמן שהעכבר מורדם. לא היו לנו בעיות בשימוש באיזופלורן כדי להרדים עכברים חולים קטנים עם חומצה מתילמלונית ופרופיונית. עם זאת, דגמים מסוימים של עכברים עשויים להיות רגישים יותר לטשטוש ולהרדמה מסוימת. יש לשקול בעיה פוטנציאלית זו לפני ניסיון להשתמש בסדציה במחקר. לבסוף, השימוש בטשטוש בשילוב עם הזרקת רטרובולבר מפחית מאוד את המצוקה לכאורה שהעכבר מפגין בתהליך ההזרקה בהשוואה ל- TVI שם לא נעשה שימוש נפוץ בטשטוש.
לא ראינו בעיות הקשורות לאחר הזרקה, אם כי זיהום הוא סיכון פוטנציאלי עם כל זריקה. כדי להפחית את הסיכוי להדבקה, מזרק חד פעמי סטרילי ו- PBS סטרילי כדי לדלל את AAV מטוהר משמשים. כל העכברים במתקן בעלי החיים שלנו נבדקים מדי יום לאיתור סימנים לבעיות בריאותיות פוטנציאליות ומקבלים טיפול וטרינרי כדי לטפל בכל בעיה בריאותית בעת הצורך.
החלופה להזרקת סינוס רטרובולבר והשיטה הנפוצה יותר להעברה מערכתית לעכברים צעירים ובוגרים היא TVI. הזרקת TVI ורטרובולבר לסינוסים גורמת להתפלגות ביולוגית דומה במקרה של מולקולות קטנות ונוגדנים, ועל ידי אקסטרפולציה, אותו הדבר צפוי עבור וקטורים נגיפיים15,16. עם זאת, לא ניתן למצוא דוגמאות להשוואה בין העברה מערכתית של וקטורים של ריפוי גנטי על ידי TVI לבין הזרקת סינוס רטרובולברי בספרות. לדעתנו, זריקות סינוס רטרובולבריות קלות יותר לביצוע בעכברים עם פנוטיפ גדילה מופחת ו/או קטלניות מוקדמת.
TVI נחשב לעתים קרובות כמקביל יותר להעברה מערכתית בבני אדם, למרות שלבני אדם יש סינוס רטרובולברי אך אין לו זנב. בהיבט אחד, הזרקת סינוס רטרובולברי דומה להזרקה מערכתית אנושית בכך שהמזרק נכנס למערכת הוורידית העליונה בדומה להזרקה שהועברה לאדם על ידי צנתר מרכזי מוחדר היקפית (PICC Line) או צנתר תוך ורידי שהוכנס לזרוע. לעומת זאת, המזרק נכנס למערכת הוורידית התחתונה של עכבר לאחר הזרקת ורידים בזנב. למרבה הצער, אף אחת מהשיטות הללו אינה משכפלת במדויק את השיטות(ות) המשמשות להעברה מערכתית בבני אדם, אך שתיהן שיטות יעילות להעברה מערכתית בעכברים.

מודלים מורינים של מחלות גנטיות משמשים בדרך כלל כדי להדגים את היעילות של מולקולות קטנות, גנטיקה, טיפולים תאיים1. בעכברים, השיטה הנפוצה ביותר לשכפול העברה מערכתית לבני אדם היא הזרקת וריד הזנב (TVI), המבוצעת בדרך כלל בעכברים בוגרים בסביבות גיל 6-8 שבועות כדי להבטיח שהוריד גדול מספיק כדי לגשת אליו. TVI שימש בהצלחה במספר רב של מחקרים פרה-קליניים הוכחת עקרונות של מחלות גנטיות, כגון המופיליה, אשר תמכו בניסויים קליניים בבני אדם עבור ריפוי גנטי2. אולם למודלים רבים של מחלות גנטיות יש פנוטיפים של גדילה ו/או קטלניות מוקדמת, אשר מונעים מהם להגיע לגיל או לגודל של עכבר בוגר (איור 1). טיפול בעכברים כאלה באמצעות TVI יכול להיות קשה מאוד, אם לא בלתי אפשרי, תלוי בגיל הקטלניות ו / או בגודל המרבי שבעלי החיים יכולים להשיג.
לעומת זאת, הזרקה סיסטמית של חומר טיפולי על ידי הזרקת סינוס רטרובולבר (המכונה לעתים קרובות ובטעות רטרו-אורביטל) יכולה להיעשות די בקלות בעכברים ללא קשר לגיל או לגודל3. זריקות רטרובולבר של וירוס הקשור לאדנו (AAV) שימשו בהצלחה במודלים מורינים צעירים עם עיכוב גדילה של מחלות גנטיות, כגון חומצה מתילמלונית (MMA) ומחלת נימן-פיק מסוג C 4,5,6,7,8. (הליך זה יכול לשמש גם להזרקת יילודים 3,4,9,10; עם זאת, טכניקה זו אינה מפורטת בפרוטוקול זה או בסרטון הנלווה.) אפילו חומרים רעילים מאוד כמו דוקסורוביצין יכולים להיות מועברים בבטחה על ידי הזרקת רטרובולבר 11,12. בניגוד ל-TVI, עכברים מורדמים במהלך הזרקות סינוס רטרובולברי, מה שהופך את ההליך לפחות מלחיץ על העכבר ומקל על המפעיל שאינו צריך לרסן פיזית את העכבר13,14. חשש נוסף הוא ש-TVI משתמש לעתים קרובות במנורת חום כדי להרחיב את וריד הזנב, מה שעלול לגרום להתייבשות בעכברים צעירים ועלול להיות בעייתי במודלים של מחלות גנטיות החשודות יותר ללחץ הקשור לחום. בעיה נוספת שיכולה להתעורר בעת שימוש ב- TVI היא שווריד הזנב יכול להיות מאתגר במיוחד לדמיין על עכברים בעלי פיגמנטציה גבוהה. עם זאת, בדומה ל-TVI, זריקות רטרובולבר לסינוסים מביאות לפיזור ביולוגי מערכתי רחב15,16.

<table><tbody><tr><td>AAV8-CAG-eGFP</td><td>Univ. Penn. Vector Core</td> הזמנה <td>מיוחדת</td><td>מקורות חלופיים של מדווחי AAV ומדווחי AAV אלטרנטיביים זמינים</td></tr><tr><td>טיפים למחסום (מסנן), 20 &mu; AM12645</td><td>ThermoFisher</td><td></td> בגודל L <td>לדילול AAV כדי להפחית את נפח הזרקה וריכוז</td></tr><tr><td>טיפים למחסום (מסנן), 100 &mu; גודל L (סטרילי)</td> <td>ThermoFisher</td><td>AM12648</td><td>לדילול AAV כדי להפחית את נפח וריכוז ההזרקה</td></tr><tr><td>מעגל ייצור כפול&nbsp;</td><td>ניתן להשתמש בשיטת הרדמה חלופית</td> <td>VetEquip</td><td>921400</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic P20 Gilson</td><td></td><td>F123600</td><td>לדילול AAV כדי להפחית את נפח וריכוז ההזרקה</td></tr><tr><td>Gilsen PIPETTEMAN Classic&nbsp; P100 פיפטה</td><td>גילסון</td><td>F123615</td><td>לדילול AAV כדי להפחית את נפח וריכוז ההזרקה</td></tr><tr><td>מחממי ידיים (HOTHANDS)</td><td>ULINE</td><td>S-1497B</td><td>לשמירה על חום העכבר בזמן הרדמת</td></tr><tr><td>מזרקי אינסולין, 31 גרם, &nbsp; אורך 8 מ"מ, קיבולת 3/10 מ"ל</td><td>328438 בקטון דיקסון</td><td></td><td>בשימוש בווידאו; מזרק אחד לכל הזרקה</td></tr><tr><td>איזופלורן (פלוריסו)</td><td>VETONE</td><td>502017</td><td>ניתן להשתמש בהרדמה אלטרנטיבית</td></tr><tr><td>Medline Protection Plus רפידות תחתונות חד פעמיות</td><td>ThermoFisher</td><td>23-666-062</td><td>כדי להניח עכבר על הזרקה מתמשכת</td></tr><tr><td>מיכל Oak Ridge Phlebotomy Sharps עם מכסה שקוף</td><td>ThermoFisher</td><td>22-730-434</td><td>לסילוק מחטים</td></tr><tr><td>פוספט מלוח PBS, pH 7.4</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>לדילול AAV לריכוז ולנפח הרצויים</td></tr><tr><td>Snap Cap צינורות מיקרוצנטריפוגה עם שמירה נמוכה (סטריליים)</td> <td>ThermoFisher</td><td>3451</td><td>לדילול AAV כדי להפחית את נפח ההזרקה והקונטרציה</td></tr><tr><td>ספוג גזה סטרילי 4"x"4</td><td>Covidien</td><td>3033</td><td></td></tr><tr><td>Trecaine Hydrochloride Ophthalmic (0.5%)</td><td>Ocenanside Pharmaceuticals</td><td>AK102D5DS</td> מזרק טוברקולין <td>מקומי&nbsp; הרדמה</td></tr> עם <tr><td>27.0 גרם (או קטן יותר)</td><td>כל</td><td>לא</td><td>חלופה למזרק אינסולין המשמש בסרטון</td></tr><tr><td>VetEquip' s מדריך למשתמש ומדריך הפעלה למערכת הרדמה של חיות מעבדה שולחניות וניידות.&nbsp;</td><td>VetEquip</td><td>chrome-extension://efaidnbmnnnibpcajpcglclefindmkaj/https://www.vetequip.com/pdfs/LAAS%20Manual.pdf</td><td>קישור למדריך למשתמש ומדריך</td></tr></tbody></table>

טיפול סיסטמי בעכברות לאחר לידה, נוער ועכברים בוגרים על ידי הזרקת סינוס רטרובולברית

Systemic Treatment for Postnatal, Juvenile, and Runted Adult Mice by Retrobulbar Sinus Injection

בעוד שהזרקות ורידי זנב משמשות לעתים קרובות כנתיב מסירה מערכתי בעכברים בוגרים, זריקות רטרובולבר הן שיטה חלופית למסירה מערכתית עם פחות מגבלות. ראשית, הזרקות ורידי זנב (TVIs) מוגבלות לעכברים בוגרים שבהם גודל וריד הזנב מתאים לגישה. להיות מוגבל לטיפול בעכברים בוגרים יכול להיות בעייתי כאשר מתמודדים עם מודלים עכברים שאינם שורדים לבגרות. שנית, TVI אינם ישימים עבור מודלים של עכברים עם פנוטיפים של פיגור גדילה שבהם העכברים לעולם אינם מגיעים לגודל של עכברי בר בוגרים. לכן, זריקות retrobulbar ניתן להשתמש בהצלחה לטיפול בעכברים צעירים ובוגרים כאחד. לבסוף, זריקות רטרובולבר מבוצעות תחת הרדמה, וזה פחות מלחיץ על העכברים מאשר TVI המבוצעות בדרך כלל ללא הרדמה. מאמר זה מציג פרוטוקול והוראות מפורטות להזרקות רטרובולבר שניתן להשתמש בהן להעברה מערכתית לעכברים קטנים וצעירים.

הזרקת סינוס רטרובולבר שימשה בהצלחה להעברה מערכתית של מולקולות קטנות, נוגדנים ונגיף הקשור לאדנו (AAV)4,5,9,15,16. באיור 3, הכבד של עכבר שטופל ב-PBS (רכב) וכבד עכבר שטופל ב-AAV8 מוצגים כדוגמה להזרקה וביטוי של AAV לאחר הזרקת רטרובולבר. AAV8, כמו וקטורי AAV טבעיים רבים, הוא גביעוני כבד. לכן, צפויה התמרה משמעותית של הכבד בעכבר שקיבל מינון מערכתי של 5 × 1012ק"ג/ק"ג17. המספר הגדול של הפטוציטים המבטאים RNA של מתיל-מלוניל-CoA מוטאז (MMUT) שנראה באיור 3, אשר מבוטא על-ידי טרנסגן AAV, מצביע על הזרקה רטרואורביטלית מוצלחת.
<img alt="השוואה בין חומצה פרופיונית לעומת עכברים מסוג בר, הפרש משקל, 4 שבועות, תוצאת מחקר." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: עכבר עם פיגור גדילה עם חומצה פרופיונית. זוהי דוגמה לפיגור גדילה קיצוני שיכול להתרחש במודלים מורינים של מחלות גנטיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תהליך הזרקת עין עכבר; תרשים ממחיש את מערך הזרקת העיניים בניסוי מעבדה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: תמונות ותרשים של הזרקת סינוס רטרובולברי. (A) תמונה של מיקום האצבע על פרווה כדי לבלוט את גלגל העין (מסומן בחץ לבן). (B) תמונה של בליטת גלגל העין (מסומנת בחץ לבן) לאחר הפעלת לחץ כלפי מטה על הפרווה לפני מיקום המחט והזרקתה. (C) דיאגרמה של כיוון שיקוע המחט (שיפוע כלפי מטה ביחס לגלגל העין), זווית המחט (30°) ומיקום מחט סינוס רטרובולברי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תמונת מיקרוסקופ, ניתוח מבנה תאי; אימונוהיסטוכימיה; זיהוי ביטוי חלבון." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66809/66809fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: הכלאה באתרו של RNA לאחר הזרקת סינוס רטרובולברי עם AAV8. תמונות של (A) 10x כבד שטופל ברכב, (B) 10x כבד שטופל ב-AAV8, (C) 20x כבד שטופל ברכב, ו-(D) 20x כבד שטופל ב-AAV8 מוכתם עבור MMUT RNA. עכברים עם חומצה מתילמלונית טופלו במינון של 5 × 1012 vg / kg של AAV8-LPS-MMUT או בקרת רכב (PBS) בגיל חודש. רקמת הכבד נאספה חודש לאחר הטיפול. ממ"ט RNA מוכתם חום (חצים שחורים מציינים אזורים של צביעה חיובית). כבד מוכתם בהמטוקסילין. פסי קנה מידה = 100 מיקרומטר 10x לתמונות, 50 מיקרומטר לתמונות 20x (B). קיצורים: AAV = וירוס הקשור לאדנו; LPS = מקדם ספציפי לכבד; MMUT = methylmalonyl-CoA mutase. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66809/66809fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

מאמר זה מספק פרוטוקול וסרטון נלווה להזרקת סינוס רטרובולברי של עד נפח כולל של 150 μL עבור עכברים בוגרים לאחר לידה, צעירים ובוגרים. הליך זה מתאים במיוחד להזרקת עכברים קטנים (15 גרם) כאשר הזרקת וריד הזנב אינה אפשרית.

While tail vein injections are frequently used as a systemic route of delivery in adult mice, retrobulbar injections are an alternative method for ...

systemic-treatment-for-postnatal-juvenile-runted-adult-mice

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

טכניקה ניתוחית זו ממחישה את הזריקה של וקטורים בריפוי גנטי ותאי גזע לתוך חלל subretinal של עין העכבר.

הזרקת subretinal של וקטורי ריפוי גנטי ותאי גזע לעיניים המאוסות

כאן אנו מדגימים טכניקה להתמרה עצבית נרחבת על ידי הזרקה תוך-חדרית של נגיף הקשור לאדנו למוח העכבר היילוד.  שיטה זו מספקת דרך מהירה וקלה להשיג ביטוי לכל החיים של טרנסגנים המועברים באופן ויראלי.

הזרקת נגיפי Intracerebroventricular של ילודים עכבר המוח לתמרה עצבית מתמשכת ונרחבת

מודלים של בעלי חיים למחלות ילדים יכולים לחוות התפרצות מוקדמת והתקדמות מחלה אגרסיבית. מבחינה קלינית משלוח טיפול רלוונטי למודלים של עכברים צעירים יכול להיות קשה מבחינה טכנית. פרוטוקול זה מתאר שיטת הזרקה תוך ורידית לא פולשנית לעכברים שזה עתה נולדו בתוך שני הימים לאחר הלידה הראשונה של חיים.

זריקות תוך ורידים בעכברים בילוד

כאן, אנו מתארים שיטה פשוטה של הזרקה תוך חדרית ותוך וסקולרית של חלקיקים נגיפיים או מיקרו-חרוזים פלואורסצנטיים למוח העכבר היילוד. ניתן לזהות את דפוס הלוקליזציה של הנגיף והננו-חלקיקים על ידי הערכה מיקרוסקופית או על ידי הכלאה באתר.

הזרקת intracerebroventricular ו intravascular של חלקיקים נגיפיים ו פלורסנט microbeads לתוך המוח בילוד

זריקות תת-רשתית הן הטכניקה הנפוצה ביותר להעברת חומרים טיפוליים גדולים כגון חלבונים ווקטורים נגיפיים לקולטני האור ולאפיתל הפיגמנט ברשתית. שיטה חלופית בעכברים המכוונת בהצלחה לחלל התת-רשתית עם נזק אגבי מינימלי וזמני התאוששות מהירים מתוארת כאן.

שיטת הזרקה אלטרנטיבית והמאומתת עבור גישת שטח subretinal<i&gt; דרך</i&gt; בגישה אחורית Transcleral

כאן, אנו מתארים את אינדוקציה של תסמונת נפרוטית ניסויי בעכברים 129S1/SvImJ על ידי זריקה retrobulbar מהירה של דוקסורוביצין. נתייחס גם עכברים נפרוטית עם שחרור מתמשכת כדורי המכיל aprotinin לעכב את השתן סרין פרוטאז פעילות ולמנוע נתרן השמירה.

אינדוקציה של תסמונת נפרוטית בעכברים על ידי הזרקת Retrobulbar של דוקסורוביצין ומניעה של שימור נפח על ידי שחרור מתמשכת Aprotinin

פרוטוקול זה מדגים שיטה חדשנית ליישום טיפולים גנטיים על תת-אוכלוסיות של תאים בחולדות ילודים בגילאים שלאחר הלידה 5-10 ימים על ידי הזרקת משנה כימוגנטית אנטרוגרדית לקליפת המוח הסומטומוטורית ורקומבינאז Cre הניתן להובלה רטרוגרדית לחוט השדרה הצווארי.

התמקדות במערכת הקורטיקוספינלית בחולדות ילודים עם וקטור דו-ויראלי באמצעות ניתוח משולב של המוח ועמוד השדרה

פרוטוקול זה נועד להדגים מסלול מתן ורידי הניתן לשחזור שניתן להשתמש בו בחולדות ובעכברים לאורך תקופת היילוד. הליך זה חשוב למחקרי מכרסמים פרה-קליניים המעוניינים לשקף מתן תרופתי ביחידות לטיפול בילודים בעיקר באמצעות מתן תוך ורידי.

מודל מכרסם יילוד של הזרקת ורידים רטרואורביטלית

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

מחקר זה מציג מתודולוגיה להעברת טיפולים לרשתית ולעצבי הראייה של החולדה הבוגרת. בנוסף, מוצגת שיטה ייחודית לאחזור רקמות לאיסוף מלמעלה למטה של עצב הראייה והרשתית בחולדה בוגרת.

מתן טיפולי בעיניים ושליפת רקמות מתקדמת בחולדות בוגרות

למדו פרוטוקול הזרקת סינוס רטרובולברית בעכברים לטיפול גני במחלות מטבוליות. השיטה מאפשרת מסירה יעילה של תרפיות גן בעכברים קטנים ומקדמת מחקר קליני.

טיפול סיסטמי בעכברות לאחר לידה, נוער ועכברים בוגרים על ידי הזרקת סינוס רטרובולברית

גלה סרטונים נוספים