Name: זרימת עבודה מבוססת אינטרנט לבחירת משפרים ספציפיים לגנים ולרקמות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-07-18T13:10:10.000+00:00
Duration: 8 min 12 s
Description: למד לזהות משפרים ספציפיים לרקמות לגנים באמצעות כלי דפדפן חינמיים ונתוני Hi-C ציבוריים. שיטה זו מאפשרת לביולוגים לחקור רגולציה גנומית ללא ידע בתכנות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Barral, A., Déjardin, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+signatures+of+enhancers+and+their+dynamic+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The chromatin signatures of enhancers and their dynamic regulation.</a> Nucleus. 14 (1), 2160551(2023).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Bickmore, W., Dean, A., Nobrega, M. A., Bejerano, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers%3A+five+essential+questions%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancers: five essential questions.</a> Nat Rev Genet. 14 (4), 288-295 (2013).</li>
<li>Kleinjan, D. A., van Heyningen, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-range+control+of+gene+expression%3A+emerging+mechanisms+and+disruption+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">Long-range control of gene expression: emerging mechanisms and disruption in disease.</a> Am J Hum Genet. 76 (1), 8-32 (2005).</li>
<li>Kvon, E. Z., Waymack, R., Gad, M., Wunderlich, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+redundancy+in+development+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Enhancer redundancy in development and disease.</a> Nat Rev Genet. 22 (5), 324-336 (2021).</li>
<li>Smith, E., Shilatifard, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+biology+and+enhanceropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Enhancer biology and enhanceropathies.</a> Nat Struct Mol Biol. 21 (3), 210-219 (2014).</li>
<li>Sur, I., Taipale, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+enhancers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">The role of enhancers in cancer.</a> Nat Rev Cancer. 16 (8), 483-493 (2016).</li>
<li>Panigrahi, A., O'Malley, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+enhancer+action%3A+the+known+and+the+unknown%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of enhancer action: the known and the unknown.</a> Genome Biol. 22 (1), 108(2021).</li>
<li>Bulger, M., Groudine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+mechanistic+diversity+of+distal+transcription+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Functional and mechanistic diversity of distal transcription enhancers.</a> Cell. 144 (3), 327-339 (2011).</li>
<li>Krivega, I., Dean, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancer+and+promoter+interactions-long+distance+calls%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Enhancer and promoter interactions-long distance calls.</a> Curr Opin Genet Dev. 22 (2), 79-85 (2012).</li>
<li>Zhang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+connectivity+maps+reveal+dynamic+promoter-enhancer+long-range+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chromatin connectivity maps reveal dynamic promoter-enhancer long-range associations.</a> Nature. 504 (7479), 306-310 (2013).</li>
<li>Fang, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mapping+of+long-range+chromatin+interactions+by+proximity+ligation-assisted+ChIP-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Mapping of long-range chromatin interactions by proximity ligation-assisted ChIP-seq.</a> Cell Res. 26 (12), 1345-1348 (2016).</li>
<li>Park, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq%3A+advantages+and+challenges+of+a+maturing+technology%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology.</a> Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).</li>
<li>Thurman, R. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+accessible+chromatin+landscape+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The accessible chromatin landscape of the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 75-82 (2012).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+and+predictive+chromatin+signatures+of+transcriptional+promoters+and+enhancers+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Distinct and predictive chromatin signatures of transcriptional promoters and enhancers in the human genome.</a> Nat Genet. 39 (3), 311-318 (2007).</li>
<li>Visel, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ChIP-seq+accurately+predicts+tissue-specific+activity+of+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ChIP-seq accurately predicts tissue-specific activity of enhancers.</a> Nature. 457 (7231), 854-858 (2009).</li>
<li>Belton, J. -M., McCord, R. P., Gibcus, J. H., Naumova, N., Zhan, Y., Dekker, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hi-C%3A+a+comprehensive+technique+to+capture+the+conformation+of+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Hi-C: a comprehensive technique to capture the conformation of genomes.</a> Methods. 58 (3), 268-276 (2012).</li>
<li>de Wit, E., de Laat, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+decade+of+3C+technologies%3A+insights+into+nuclear+organization%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">A decade of 3C technologies: insights into nuclear organization.</a> Genes Dev. 26 (1), 11-24 (2012).</li>
<li>Gao, T., Qian, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EnhancerAtlas+2.0%3A+an+updated+resource+with+enhancer+annotation+in+586+tissue%2Fcell+types+across+nine+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">EnhancerAtlas 2.0: an updated resource with enhancer annotation in 586 tissue/cell types across nine species.</a> Nucleic Acids Res. 47 (D1), D117-D123 (2019).</li>
<li>Erwin, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+diverse+datasets+improves+developmental+enhancer+prediction%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Integrating diverse datasets improves developmental enhancer prediction.</a> PLoS Comput Biol. 10 (6), e1003677(2014).</li>
<li>Heintzman, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+modifications+at+human+enhancers+reflect+global+cell-type-specific+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Histone modifications at human enhancers reflect global cell-type-specific gene expression.</a> Nature. 459 (7243), 108-112 (2009).</li>
<li>Spicuglia, S., Vanhille, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+signatures+of+active+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">Chromatin signatures of active enhancers.</a> Nucleus. 3 (2), 126-131 (2012).</li>
<li>Borsari, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhancers+with+tissue-specific+activity+are+enriched+in+intronic+regions%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Enhancers with tissue-specific activity are enriched in intronic regions.</a> Genome Res. 31 (8), 1325-1336 (2021).</li>
<li>Smemo, S., Campos, L. C., Moskowitz, I. P., Krieger, J. E., Pereira, A. C., Nobrega, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulatory+variation+in+a+TBX5+enhancer+leads+to+isolated+congenital+heart+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Mol+Genet%22%5BJournal%5D)">Regulatory variation in a TBX5 enhancer leads to isolated congenital heart disease.</a> Hum Mol Genet. 21 (14), 3255-3263 (2012).</li>
<li>Boogerd, C. J., Evans, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TBX5+and+NuRD+divide+the+heart%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Cell%22%5BJournal%5D)">TBX5 and NuRD divide the heart.</a> Dev Cell. 36 (3), 242-244 (2016).</li>
<li>Dickel, D. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+compendium+and+functional+assessment+of+in+vivo+heart+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Genome-wide compendium and functional assessment of in vivo heart enhancers.</a> Nat Commun. 7 (1), 12923(2016).</li>
<li>Pennacchio, L. A., Visel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Limits+of+sequence+and+functional+conservation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Limits of sequence and functional conservation.</a> Nat Genet. 42 (7), 557-558 (2010).</li>
<li>Local, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+H3K4me1-associated+proteins+at+mammalian+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Identification of H3K4me1-associated proteins at mammalian enhancers.</a> Nat Genet. 50 (1), 73-82 (2018).</li>
<li>Creyghton, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histone+H3K27ac+separates+active+from+poised+enhancers+and+predicts+developmental+state%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Histone H3K27ac separates active from poised enhancers and predicts developmental state.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (50), 21931-21936 (2010).</li>
<li>Visel, A., Minovitsky, S., Dubchak, I., Pennacchio, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VISTA+Enhancer+Browser-a+database+of+tissue-specific+human+enhancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">VISTA Enhancer Browser-a database of tissue-specific human enhancers.</a> Nucleic Acids Res. 35 (Database), D88-D92 (2007).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>עמדת עבודה למחשב</td><td>לא ישים</td><td>לא ישים</td><td>מחשב התומך בדפדפן אינטרנט, מערכת הפעלה Windows/Mac/Linux</td></tr><tr><td>פורטל הנתונים של 4DN</td><td>פורטל הנתונים של 4DN</td><td>https://data.4dnucleome.org/</td><td></td></tr><tr><td>גלקסיה</td><td>גלקסיה</td><td>https://usegalaxy.org/published/history?id=aff5db4e07064445</td><td></td></tr><tr><td>גיטהאב</td><td>גיטהאב</td><td>https://github.com/Ramialison-Lab/EnhancerWorkflow</td><td></td></tr><tr><td>ויסטה&nbsp;</td><td>דפדפן משפר לב VISTA</td><td>https://portal.nersc.gov/dna/RD/heart/</td><td></td></tr></tbody></table>

זרימת עבודה מבוססת אינטרנט לבחירת משפרים ספציפיים לגנים ולרקמות

A Web-Based Workflow for Selecting Gene- and Tissue-Specific Enhancers

כדי להמחיש את השימוש בפרוטוקול המוצג, חקרנו את הגן TBX5 בלב האדם, וחקרנו משפרים הקשורים ל-TBX5 באמצעות זרימת העבודה המקיפה הכוללת נתוני H3K4me1, H3K27ac ו-Hi-C. TBX5 הוא גן התורם להתפתחות הגפיים והלב, כולל היווצרות ארבעת החדרים והפרדת מחיצה24. מוטציה בגן זה היא הגורם העיקרי לתסמונת הולט-אורם (HOS), הגורמת להפרעות בגפיים ולמחלת לב מולדת (CHD), כולל פגמים במחיצה24. המוטציה של משפרי לב הקשורים ל-TBX5 עשויה להשפיע באופן קריטי על CHD24. מחקר קודם גילה שלושה משפרי TBX5 ידועים ברקמה ספציפית ללב אנושי - כלומר "משפר 2", "משפר 9" ו"משפר 16" (קובץ משלים 2), שהוכחו כבעלי פנוטיפים השוואתיים בעכברים טרנסגניים23.
חקרנו אזורים מועשרים ב-H3K4me1 ו-H3K27ac בין RBM19 ל-TBX3, שהם שני גנים מאגפים במורד הזרם ובמעלה הזרם של TBX5 בבני אדם, כדי לאחזר משפרים משוערים בלוקוס TBX5 (איור 1 ואיור 2). כדי לזהות משפרים ספציפיים ללב, נבחרו תאי שריר הלב. האזורים המשוערים של משפר הלב TBX5 אוחזרו כקואורדינטות (chr12: התחלה-סוף), וזוהו 22 אזורים הקשורים ל-H3K4me1 ו-H3K27ac (איור 3 וקובץ משלים 3). משפרי לב משוערים TBX5 אוחזרו ממסד הנתונים הגנומי של EnsEMBL כדי להצליב נתוני Hi-C המוחזקים במסד הנתונים של 4DNucleome (איור 4). זה נעשה כדי לאמוד אינטראקציות אפשריות בין משפרים פוטנציאליים למקדם הלב TBX5 . בעקבות הפרוטוקול המתואר כאן, 21 מתוך 22 אזורים גנומיים אושרו לקיים אינטראקציה עם מקדם TBX5 (chr12: 114400143-114410103) בתאי שריר הלב (קובץ משלים 4). היה אזור אחד שלא הייתה לו אינטראקציה פיזית עם המקדם (איור 4, שלב 4.8). לבסוף, השווינו פרוטוקול זה עם משפרים מאומתים ביולוגית אלה ומסד הנתונים הנוכחי של משפרי לב, VISTA Cardiac Enhancers Browser, וחשפנו משפרים נוספים שאינם נלכדים כרגע על ידי מסד הנתונים25.
ביצענו השוואה צולבת של 21 משפרי TBX5 שאוחזרו על ידי הפרוטוקול המוצג כאן עם מסדי נתונים קיימים. אחזרנו 4 משפרי TBX5 מדפדפן משפר הלב של VISTA (קובץ משלים 5)25. מבין 4 משפרי הלב שזוהו על ידי VISTA, 3 משפרים, hs2329, mm1282 ו-m370 חפפו לאזורים שזוהו על ידי פרוטוקול זיהוי משפרים מבוסס אינטרנט זה (איור 5). כל אחד מהמשפרים החזויים שיתף גם את האזורים הגנומיים עם משפרים שאומתו בעבר בניסוי מ-Smemo et al.23, Enhancer 2 (chr12:114025907-114026275, GRCh38) ו-Enhancer 16 (chr12:114415466-114420433, GRCh38), בעוד שהם לא הראו חפיפה עם Enhancer 9 (chr12:114263402-114266886, GRCh38). אחד המשפרים שזוהו על ידי VISTA, hs498 לא חפף לאף משפר חזוי על ידי פרוטוקול זה או המשפרים המאומתים בניסוי של Smemo et al.23 (איור 5), למרות שהאזור הראה חפיפה חלקית עם סימני H34Kme1 (איור 5). באופן דומה, משפר 9 לא חפף עם המשפרים החזויים על ידי צינור זה אלא היה קשור לסימני H3K4me1 (איור 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig1.jpg"> 
איור 1: מדריך צעד-אחר-צעד לאיתור ה-GoI בדפדפן הגנום EnsEMBL. המשתמש פותח תחילה את דף הבית של EnsEMBL (1.1), בוחר את המין (אנושי) ומזין את הגן בשורת החיפוש (1.2-1.3). מרשימת התוצאות נבחר מזהה הגן המתאים (1.4), הפותח את דף סיכום הגנים. לאחר מכן המשתמש לוחץ על ההיפר-קישור Region in Detail (1.5) כדי לדמיין את האזור הגנומי המקיף את ה-GoI, כולל אלמנטים שכנים ותכונות רגולטוריות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig2.jpg"> 
איור 2: הגדרת אזור זיהוי המשפר סביב ה-GoI באמצעות דפדפן הגנום EnsEMBL. כדי להגדיר את אזור זיהוי המשפר, זהה את שני הגנים השכנים המאגפים את ה-GoI באמצעות הערות הגנים הבסיסיות ממסלול GENCODE , שבו הגנים מוצגים כבלוקים צהובים כהים המסומנים בהערות EnsEMBL/Havana ממוזגות. כיוון השעתוק של כל גן מסומן על ידי ראשי חץ (&lt; או &gt;) ליד שם הגן (2.1). לבחירת האזור הבין-גני בין הגנים השכנים, לחצו וגררו לאזור העניין, ולאחר מכן בחרו 'קפוץ לאזור ' בתיבה הנפתחת כדי להגדיל את התצוגה (2.2). כדי להוסיף ביאורים רגולטוריים או משפרים, לחץ על הוספה/הסרה של רצועות (2.3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig3v2.jpg"> 
איור 3: תצורה של מסלולי שינוי היסטון באזור זיהוי המשפר באמצעות דפדפן הגנום EnsEMBL. בסרגל הכלים השמאלי, לחץ על הגדר דף זה (3.1) כדי לגשת ללוח תצורת המסלול ולנווט אל "פעילות לפי תא/רקמה" בסעיף הרגולציה (3.2). בכרטיסייה שנפתחה, בחר בסעיף "ניסויים" (3.3), והשתמש בסרגל החיפוש תא/רקמה כדי לאתר ולבחור את הרקמה המעניינת שלך (תא שריר לב) (3.4). בלוח סימני ההיסטון (3.5), הפעל את H3K4me1 ו-H3K27ac כסימני שיפור פעילים ואת H3K4me3 כסימן מקדם ולאחר מכן לחץ על "הגדר תצוגת מעקב" (3.6). לאחר אישור בחירות הרצועות, לחץ על "הצג רצועות" (3.7) כדי לחזור למציג הגנום. פסגות סימני היסטון מוצגות כעת באזור הזיהוי (3.8) כבלוקים צבעוניים מתחת לתווית הרקמה המתאימה (צהוב: H3K4me1, כחול: H3K27ac וכתום: H3K4me3). חלון קופץ "Hists &amp; Pols" המכיל את הקואורדינטות הגנומיות של האזור בזוגות בסיסים (chr:start-end), שניתן להעתיק ולשמור לניתוח במורד הזרם. חלון קופץ "Hists &amp; Pols" מופיע לאחר לחיצה על האלמנטים הצבעוניים ברצועה. החלון הקופץ מכיל את הקואורדינטות הגנומיות של האזור בזוגות בסיסים (למשל, chr12:11443450-114451611 עבור אזור המקדם), שניתן להעתיק ולשמור לניתוח במורד הזרם (3.8). כמו כן, כדי לחלץ משפרים מועמדים, תעדוף אזורים שבהם שיאי H3K4me1 ו-H3K27ac חופפים, כפי שמוצג על ידי יישור אנכי של פסגות ותיבות על פני מסלולים (3.9). ניתן לבחור אזורים חופפים ישירות על ידי לחיצה על התיבות שלהם או על ידי לחיצה ידנית וגרירה על פני הפסגות המיושרות כדי להגדיר אזור (למשל, chr12:114400143-114410103 עבור אזור מועמד פעיל). יש לשמור את הקואורדינטות המוצגות בחלון הקופץ בפורמט BED לצורך אימות או הדמיה במורד הזרם. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig4v2.jpg"> 
איור 4: הדמיה של אינטראקציות כרומטין מקדם-משפר באמצעות מפות חום Hi-C מפורטל נתוני ה-4D Nucleome. דף הבית של פורטל הנתונים של 4D Nucleome מציג תרשים עמודות מוערם המסכם את סוגי הניסויים הזמינים לפי אורגניזם. מערך הנתונים "Hi-C באתר " עבור דגימות אנושיות נבחר על ידי לחיצה על החלק המתאים בסרגל (4.1). מוצגת רשימה מסוננת של מערכי נתונים רלוונטיים; נבחר מערך נתונים Hi-C שמקורו בתאי H9 המובחנים למיובלסטים לבביים (4.2). מערך הנתונים שנבחר (4.3) נפתח בדפדפן HiGlass באמצעות כפתור Explore Data (4.4). אזור העניין הגנומי מוזן בתיבת הקואורדינטות (4.5), ומטריצת המגע מוצגת כמפת חום בקנה מידה צבעוני. צבעים כהים יותר (אדום עמוק עד שחור) מצביעים על תדר מגע כרומטין חזק יותר, בעוד שצבעים בהירים יותר (לבן עד כתום) מייצגים אינטראקציות חלשות יותר. כלל אופקי ממוקם בקואורדינטת המקדם, וכללים אנכיים משורטטים במיקומים של שלושה משפרי בקרה מאומתים בניסוי (4.6). צמתים אלה משמשים להגדרת סף אינטראקציה קפדני, שנקבע על ידי האות הנראה החזק ביותר (הצבע הכהה ביותר) מבין מגעי המקדם-משפר (4.7). כללים אנכיים נוספים משורטטים במיקומים של משפרים מועמדים המסומנים H3K27ac ו-H3K4me1 (משלב 3.8). מועמדים שהצטלבויות המקדם-משפר שלהם שוות או כהות יותר מהסף נשמרות, בעוד שאלה עם אותות חלשים יותר (ריבועים בצבע בהיר יותר) אינם נכללים (4.8). קואורדינטות שמורות מחולצות באופן ידני ונשמרות בפורמט BED לניתוחים במורד הזרם. (א. משפר 2, ב. משפר 9 וג. משפר 16) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66840/66840fig5.jpg"> 
איור 5: תצוגת דפדפן גנומית של משפרי TBX5 חזויים בהשוואה למשפרי לב ומשפרי בקרה מאומתים על ידי VISTA. תמונות דפדפן גנום מציגות את טווח חיפוש המשפרים (שלב 2) המשווה משפרים חזויים שאוחזרו על ידי הפרוטוקול מבוסס האינטרנט (למטה) עם משפרים מאומתים על ידי VISTA (למעלה) ומשפרי בקרה מאומתים בניסוי (במרכז). הפאנל הראשי מציג את הלוקוס הגנומי המלא עם אלמנטים רגולטוריים מוערים, כולל פסגות H3K4me1 ספציפיות לתאי שריר הלב (צהוב), H3K27ac (כחול) ו-H3K4me3 (כתום). שלוש דמויות מוגדלות לוכדות את היישור בין המאוחזר על ידי הפרוטוקול, VISTA ומשפרי הבקרה. החפיפה עם משפרי בקרה מתוארת בתיבות אדומות. קואורדינטות עבור כל תת-אזור מוצגות בחלוניות הדפדפן התחתונות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/66840fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: נתונים ששימשו במחקר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>
טבלה 2: כלים מבוססי אינטרנט ששימשו במחקר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: הוראות לפתרון בעיות עבור דפדפן הגנום של EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%201.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי בקרת הלב TBX5 המאומתים בניסוי 23. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%202.bed" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי לב TBX5 שאוחזרו על ידי STEP3 מ-EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%203.bed" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי לב TBX5 שאוחזרו על ידי STEP4 מ-EnsEMBL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%204.bed" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 5: קובץ BED בפורמט GRCh38, משפרי לב TBX5 שאוחזרו מדפדפן משפר הלב VISTA25. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66840/Supplementary%20File%205.bed" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

Enhancers are DNA regions that regulate gene expression. Mutations within enhancers can result in abnormal gene regulation leading to disease. Therefore, ...

a-web-based-workflow-for-selecting-gene-and-tissue-specific-enhancers

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

בעבודה זו אנו מספקים זרימת עבודה ניסיונית כיצד ניתן לזהות משפרים פעילים ולאמת אותם בניסוי.

חיזוי ותיקוף של גן בקרה אלמנטים הופעל במהלך החומצה הרטינואית מושרה גזע עובריים התמיינות תאים

בניגוד DNA רצף נתונים, נתונים epigenomic לא ברצון נתון את החיפושים מבוססי טקסט. להלן מוצגות ההליכים להשתמש גרסה משודרגת של GeNemo, כלי מבוסס-אינטרנט ביואינפורמטיקה, לערוך חיפושים המבוססת על תבניות עבור קווי דמיון בין נתונים epigenomic השוואת זמין למאגרי מידע מקוונים כולל האנציקלופדיה של ה-DNA אלמנטים עם הנתונים של המשתמש.

חיפוש מבוססי תבנית של נתונים Epigenomic באמצעות GeNemo

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי לתכנן ולבצע מיקוד מרובבת של משפרי עם החלבון פיוז'ן deactivating SID4X-dCas9-קראב, המכונה גם משפר הפרעה (משפר-i). פרוטוקול זה מאפשר זיהוי משפרי המווסתים ביטוי גנים ואסטמה ומקילה על ניתוח היחסים בין משפרי ויסות גנים מטרה משותפת.

דיסקציה של משפר תפקוד באמצעות הפרעות משפר מבוססי CRISPR מולטיפלקס בשורות תא

פרוטוקול זה מתאר את השלבים הדרושים כדי ליצור מערכת מודל שבו שעתוק של גנים אנדוגני עניין יכול להיות מותנה נשלט בעלי חיים או תאים באמצעות מדכא. שבולם משופרת lac ו/או מערכות activator ט .

In vivo היישום של מערכת שליטה מרחוק עבור הביטוי מניפולציה של ג'ין אנדוגני

אנו מדווחים על היישום של לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותי ואחריו רצף תפוקה גבוהה בגופים embryoid שנוצרו בתאי גזע עובריים. טכניקה זו מאפשרת לזהות ולכמת את אנשי הקשר בין משפרי ואזורים היזם של גן נתון במהלך הבידול תא גזע עובריים.

זיהוי אנשי קשר של משפר-יזם ב Embryoid גופים על-ידי לכידת כרומוזום קונפורמציה כמותית (4C)

פרוטוקול זה מתאר בדיקה חדשנית של משפר-כתב ארעי המבוססת על rAAV. ניתן להשתמש בבדיקה זו כדי לגרום לביטוי המונע על ידי משפר in vivo במוח העכבר.

פריסת AAV של מבני ביטוי מבוססי משפר in vivo במוח עכבר

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבחירה חוץ גופית של מדכאי שעתוק מהונדסים (ETR) עם יעילות השתקה גבוהה, ארוכת טווח, יציבה, על המטרה ופעילות נמוכה מחוץ למטרה. תהליך עבודה זה מאפשר לצמצם רפרטואר ראשוני ומורכב של תעודות סל מועמדות לרשימה קצרה, המתאימה להערכה נוספת במסגרות רלוונטיות מבחינה טיפולית.

במבחנה בחירת מדכאי שעתוק מהונדסים להשתקה אפיגנטית ממוקדת

ביטוי גנים מוסדר על ידי אינטראקציות של מקדמי גנים עם אלמנטים רגולטוריים דיסטליים. כאן, אנו מסבירים עד כמה קלט נמוך Capture Hi-C (liCHi-C) מאפשר לזהות אינטראקציות אלה בסוגי תאים נדירים, שבעבר לא היו ניתנים למדידה.

זרימת עבודה משולבת לחקר ארכיטקטורת הגנום המרחבי-זמני הממוקדת במקדם באוכלוסיות תאים נדירות

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

אנו מתארים שיטה למיון תאי יונקים בודדים ולכמת את הביטוי של עד 96 גנים מעניינים בכל תא. שיטה זו כוללת שימוש בתקני qPCR פנימיים כדי לאפשר הערכה של ספירת תעתיקים מוחלטת.

תאים יחידים Gene Expression Profiling שימוש FACS ו qPCR עם סטנדרטים פנימיים

למד לזהות משפרים ספציפיים לרקמות לגנים באמצעות כלי דפדפן חינמיים ונתוני Hi-C ציבוריים. שיטה זו מאפשרת לביולוגים לחקור רגולציה גנומית ללא ידע בתכנות.

זרימת עבודה מבוססת אינטרנט לבחירת משפרים ספציפיים לגנים ולרקמות

גלה סרטונים נוספים