Name: טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-07T14:35:00.000+00:00
Duration: 9 min 53 s
Description: חקור את מנגנוני התרגום המיטוכונדריאלי והרכבת הממברנה הפנימית בSaccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול מדגים שיטת הפצצה ביוליסטית להעברת DNA מיטוכונדריאלי וניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי ברמה מולקולרית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פרסום זה נתמך על ידי Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), UNAM [IN223623 ל-XP-M]. UPD הוא עמית CONAHCYT (CVU:883299). אנו רוצים להודות לד"ר אריאן מנדוזה-מרטינז על העזרה הטכנית עם תמונות מיקרוסקופ האור. רישיונות Biorender: DU26OMVLUU (איור 2); BK26TH9GXH (איור 3); GD26TH80R5 (איור 4); PU26THARYD (איור 7); ML26THAIFG (איור 9).

הערה: אנו ממליצים לבצע שש טרנספורמציות עבור כל מבנה מכיוון שיעילות הטרנספורמציה המיטוכונדריאלית היא בדרך כלל נמוכה. הרכב מצעי הגידול השונים מוצג בטבלה 2.
1. הכנת חלקיקי טונגסטן
<ol><li>שקלו 30 מ"ג של חלקיקי טונגסטן 0.7 מיקרומטר (WPs, מיקרו-נשאים) במיקרו-צינור. הוסף 1.5 מ"ל של אתנול 70% (EtOH) לעיקור. מערבלים את WPs ולתת להם לנוח במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 13,200 x גרם במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. שטפו את ה-WPs על ידי הוספת 1.5 מ"ל מים סטריליים לחלקיקים, ערבול שלהם וצנטריפוגה ב-13,200 × גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנטנט.</li>
	<li>הוסף 500 μL של גליצרול סטרילי 50% (הריכוז הסופי הוא 60 מיקרוגרם של WPs/μL). הערה: ניתן לאחסן WPs בטמפרטורה של -20°C למשך 6 חודשים לפחות. ממלאי זה, קח את הסכום הנדרש עבור שש טרנספורמציות (100 μL).</li>
</ol>2. ציפוי DNA WPs
<ol><li>הוסף 5 מיקרוגרם של 2 μ פלסמיד ו 15 מיקרוגרם של פלסמיד חיידקי המכיל את הרצף המיטוכונדריאלי למיקרו-צינור על קרח. הערה: הנפח הסופי לא יעלה על 50 μL כדי למנוע דילול נוסף של הריאגנטים הדרושים לציפוי DNA.</li>
	<li>הוסף 100 μL של תרחיף WP מערבולת עבור 5 s (6 מ"ג של WPs).</li>
	<li>הוסף 4 μL של 1 M זרע. מערבולת קצרה.</li>
	<li>הוסף 100 μL של 2.5 M CaCl2 קר כקרח, לזמן קצר מערבולת. לדגור על קרח במשך 10 דקות; מערבבים בקצרה את התערובת כל 3 דקות. הערה: פתרון CaCl2 מעוקר בסינון ואין לבצע בו אוטוקלאב.</li>
	<li>צנטריפוגו את ה-WPs למשך 30 שניות ב-13,200 × גרם ב-4°C והשליכו את הסופר-נטנט. שטפו את החלקיקים על ידי השעייתם מחדש בעדינות ב-200 מיקרוליטר של 100% EtOH ב-20°C-.</li>
	<li>צנטריפוגו את ה-WPs למשך 30 שניות ב-13,200 × גרם ב-4°C והשליכו את הסופר-נטנט. חזרו על הכביסה.</li>
	<li>להשעות מחדש את WPs ב 60-70 μL של טמפרטורת החדר 100% EtOH באמצעות קצה פיפטה; אין מערבולת. הערה: כדי להבטיח את איכות הפלסמידים, יש לבצע ציפוי DNA באותו יום של טרנספורמציה ביוליסטית.</li>
</ol>3. הכנת חומר ביוליסטי
<ol><li>לפני ההפצצה, יש לעקר שישה מחזיקי מקרו-נשאים (איור 5) באוטוקלאבה ולייבש אותם היטב. לחלופין, השרו אותם ב-EtOH ועיקרו אותם באמצעות להבה בעזרת מלקחיים. הניחו אותם על צלחת זכוכית סטרילית.</li>
	<li>במהלך משקעים בדנ"א (דגירה של 10 דקות על קרח בשלב 2.4), הכניסו שישה נשאי מאקרו (או דיסקים מעופפים) לכל אחד מששת מחזיקי המקרו-נשאים בעזרת מלקחיים סטריליים. הערה: אין לעקר את המקרו-נשאים.</li>
	<li>ערבבו את WPs מצופים DNA עם פיפטה. הוסף 10 μL של WPs לכל משטח מאקרו-נשא ופזר על פני כל המשטח עם קצה הפיפטה. במידת הצורך, הוסף כמה מיקרוליטרים נוספים של 100% EtOH למשטח המקרו-נשא כדי לבצע התפשטות אחידה של WPs. תן לתרחיף להתייבש בטמפרטורת החדר במשך ~ 20 דקות.</li>
</ol>4. הכנת תאי שמרים וצלחות הפצצה
<ol><li>חסן את זן קולטן rho0 על 2 מ"ל של תווך YPR (טבלה 2). גדל ללילה אחד ב 30 ° C בגלגל מסתובב.</li>
	<li>לדלל 300 μL של התרבית ב 30 מ"ל של מדיום YPR טרי. גדל ב 30 ° C ו 200 סל"ד על שייקר סיבובי במשך שני לילות עד התרבות רוויה.</li>
	<li>צנטריפוגה את תאי השמרים ב 600 × גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש את תאי השמרים ב-600 מיקרוליטר של מדיום YPD (טבלה 2).</li>
	<li>בעזרת ידית זכוכית סטרילית, מורחים 100 μL של מתלה תאי השמרים על צלחת בינונית להפצצה מוצקה. הערה: אמצעי ההפצצה חייב להיות חסר את סמן הבחירה של פלסמיד 2 μ שישמש לטרנספורמציה.</li>
	<li>חזור על שלב 4.4 עבור חמשת הלוחות האחרים.</li>
	<li>יש לדגור במשך 1-3 שעות בטמפרטורת החדר לפני ההפצצה כדי להבטיח שהמדיום הנוזלי נספג לחלוטין על פני הצלחת.</li>
</ol>5. יצירת זן רו סינתטי על ידי טרנספורמציה ביוליסטית
הערה: לפני שתתחיל, הקפד לקרוא את המדריך למשתמש עבור הציוד הביוליסטי . נתאר את פרוטוקול הציוד הנזכר (טבלת חומרים ואיור 5).
<ol><li>נקה את התא של מערכת העברת חלקיקים ביולוגיים עם אתנול 70% כדי למנוע זיהום ולתת לו לעמוד לפחות 10 דקות. רגע לפני ההפצצה, נגבו את המשטח במגבת נייר נקייה.</li>
	<li>פתח את שסתומי מיכל ההליום כדי להגדיר סביב 2,000 psi.</li>
	<li>הפעל את הציוד והפעל את מקור הוואקום.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים, הניחו את המקרו-נשא כשפניו כלפי מטה על מחזיק המקרו-נשא. הערה: אין להשתמש במסך העצירה שמגיע עם הציוד.</li>
	<li>הברג את מכסה המקרו-מוביל על גבי המקרו-מוביל. כל החלקים יחד מרכיבים את מערכת השיגור של המיקרו-נשאים (איור 5).</li>
	<li>מקם את מערכת שיגור המיקרו-נשא בתוך תא הוואקום ברמה החמישית מלמטה.</li>
	<li>הניחו את אחת הצלחות המכילות את מדשאה זן rho0 במפלס השני מתחתית החדר. ודא שהצלחת פונה כלפי מעלה ונמצאת ללא מכסה.</li>
	<li>באמצעות מלקחיים סטריליים, לשים דיסק קרע אחד על מכסה התומך. בורג את מכסה התמך על צינור התאוצה; ודא שמכסה התמך צמוד. הערה: אין לטפל בדיסקים שנקרעו עם איזופרופנול כפי שהוצע במדריך מכיוון שראינו כי יעילות הטרנספורמציה יורדת.</li>
	<li>סגור את דלת תא הוואקום.</li>
	<li>העבר את מתג ה-VAC/VENT/HOLD למצב VAC . כאשר מגיעים לשואב אבק של 25-28 אינץ' כספית , יש להחליף את מתג VAC/VENT/HOLD למצב HOLD . הערה: שימו לב כי ואקום בר השגה יכול להשתנות בהתאם לגובה פני הים. מצאנו הצלחה להגיע 25 inHg.</li>
	<li>לחץ על מתג FIRE כדי לצלם את WPs. המתן עד שהלחץ ייבנה בצינור התאוצה עד שיגיע ל- 1,300 psi כאשר דיסק הקרע יישבר וישמיע צליל פופ.</li>
	<li>מיד לאחר שדיסק הקרע נשבר, מתג ה-FIRE והוואקום משתחררים על-ידי שינוי מתג ה-VAC/VENT/HOLD למצב VENT .</li>
	<li>בזהירות, עם מלקחיים סטריליים, להסיר כל פסולת של דיסק קרע נוכח על פני השטח של הצלחת ולכסות את הצלחת עם המכסה שלה.</li>
	<li>חזור על ההליך עבור חמשת הלוחות הנותרים, והצבת דיסק קרע חדש ומוביל מאקרו בכל סיבוב.</li>
	<li>בסוף, סגור את השסתום הראשי של מיכל הליום.</li>
	<li>סגור את התא ובנה ואקום על-ידי העברת מתג VAC/VENT/HOLD למצב VAC . שחרר את המערכת מכל לחץ הליום על ידי לחיצה ושחרור של מתג FIRE מספר פעמים. חזור על הפעולה כשהדלת פתוחה.</li>
	<li>כבו את משאבת הוואקום ואת ציוד ההפצצה.</li>
	<li>נקו את מערכת המשלוחים עם 70% EtOH. לשטוף את תומך macrocarrier עם פתרון SDS 0.1%; יש לשטוף במים מזוקקים סטריליים ו-100% EtOH.</li>
</ol>6. בחירת מושבת רו סינתטית
<ol><li>לדגור על לוחות ההפצצה במשך 5-7 לילות ב 30 ° C. הערה: חשוב לבדוק את הצלחות מדי יום לזיהום. במידת הצורך, ניתן לחתוך את האזור המזוהם עם מרית סטרילית כדי למנוע זיהום נוסף.</li>
	<li>חסנו את זן הבודק מסוג ההזדווגות הנגדי ב-2 מ"ל של YPD בינוני למשך הלילה (ראו את הדוגמה הספציפית באיור 2D,E).</li>
	<li>יש לחסן 150 מיקרוליטר של תרבית הזן הבודק על צלחת YPD. בעזרת ידית זכוכית סטרילית, פזרו את הטסטר באופן שווה על משטח הצלחת. תנו לצלחת להתייבש לפחות 5 דקות.</li>
	<li>צור העתקים של לוחות ההפצצה באמצעות רפידות משכפלות קטיפה וחותמת משכפל.<ol><li>משוכפל על צלחת בינונית נשירה המתאימה לסמן אוקסוטרופיה פלסמיד 2 μ שעבר טרנספורמציה. הצמיחה לוקחת דגירה אחת של לילה ב 30 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, יש לאחסן בטמפרטורה של 4°C עד לשימוש נוסף. צלחת זו היא צלחת המאסטר.</li>
		<li>משוכפל על צלחת YPD המכילה את הדשא של הבודק משלב 6.3. יש לדגור בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס למשך שני לילות. לאחר מכן, לשכפל צלחת זו על המדיום הסלקטיבי כדי לזהות את נוכחותו של הגן המיטוכונדריאלי של עניין, למשל, מדיום נשימה או מדיום חסר ארגינין, לדגור לילה ב 30 מעלות צלזיוס. רק התאים שהכילו את פלסמיד החיידקים הסינתטיים במיטוכונדריה יגדלו בתווך הסלקטיבי לאחר ההזדווגות עם זן הבודק.</li>
	</ol></li>
	<li>זהה על לוח האב (שלב 6.4.1) את המושבות המתאימות שצמחו בשלב 6.4.2. הערה: מכיוון שלוח ההפצצה (ולכן, צלחת המאסטר) עמוס במושבות טרנספורמטיביות, זה יכול להיות קשה לזהות את המושבות החיוביות שנצפו על לוח ההזדווגות של הבודק. מסיבה זו, מומלץ מאוד לצייר כמה קווים קטנים בכל צד של כל הלוחות עם טוש קבוע. ציירו קווים דומים על טבעת החותמת המשוכפלת. קווים אלה יסייעו בהכוונה ובאיתור מושבות חיוביות על לוח האב (ראו דוגמה באיור 2D).</li>
	<li>לטהר את המושבות החיוביות על ידי פסים מצלחת האב לצלחת נשירה סלקטיבית שנייה, כמו בשלב 6.4.1. לדגור במשך שני לילות ב 30 °C (75 °F). הערה: חיוני כי פסים מאפשרים צמיחה של מושבות בודדות כדי להבטיח מתח טהור.</li>
	<li>חזור על תהליך הבחירה (שלבים 6.2-6.5) כדי לאשר את נוכחותו של פלסמיד חיידקי במיטוכונדריה. הערה: בדרך כלל, ניתן לחזור על תהליך זה פעמיים נוספות כדי לבחור זני רו סינתטיים יציבים.</li>
	<li>לאחר שזן הרו הסינתטי שומר ביציבות על DNA הפלסמיד במיטוכונדריה, בחר 3-5 מושבות חיוביות שונות וחסן אותן ב -2 מ"ל של YPD. השתמש בתרבית זו כדי להכין מלאי קריוביאלי (על ידי ערבוב של 600 μL של תרבית ו 600 μL של 50% גליצרול כדי לשמר ב -70 ° C) ולהכניס את רצף פלסמיד לתוך mtDNA של עניין על ידי cytoduction (שלב 6.7). הערה: מאחר שאין לחץ סלקטיבי לשמירה על הפלסמיד שעבר טרנספורמציה במיטוכונדריה מזן הרו הסינתטי, הפלסמיד יכול ללכת לאיבוד בקלות. לכן, אנו ממליצים לבצע את הציטודוקציה בהקדם האפשרי.</li>
</ol>7. שילוב המבנה הקיים בזן הרו הסינתטי באתר המטרה בגנום המיטוכונדריאלי על ידי ציטודוקציה
<ol><li>חסן שתי צינוריות עם 3 מ"ל של מדיה YPD, אחת עם תאי התורם (תאי רו סינתטיים) ואחת עם התאים המקבלים (תאי שמרים שבהם צפויה הבנייה הסופית). לדגור לילה ב 30 °C (75 °F).</li>
	<li>מערבבים 750 μL של הזן התורם ו-250 μL של זן הקולטן במיקרו-צינורית סטרילית (יחס 3:1).</li>
	<li>צנטריפוגה את התערובת במשך דקה אחת ב 13,200 × גרם; השליכו את הסופר-נאנט. בעזרת קצה פיפטה 1 מ"ל עם קצה חתוך, לקחת טיפה אחת של גלולת התא ולהניח אותו על צלחת YPD. יש לדגור בטמפרטורה של 30°C למשך 2-4 שעות. הערה: כדי למנוע זיהום צולב, אין לשים יותר משני מתלים של תאים בלוח אחד (ראו את הדוגמה באיור 4A).</li>
	<li>קח כמות קטנה של תערובת התא, להשהות אותו מחדש ב 15 μL של מים סטריליים על מגלשה, ומניחים כיסוי להחליק. בדוק תחת מיקרוסקופ אור נוכחות של shmoos עם מטרה 40x או 100x; הצורה האופיינית הזו מופיעה כאשר קיימים שני סוגי הזדווגות (איור 3B).</li>
	<li>אם יש שמוס, יש להשהות כמות קטנה (~0.5 מ"מ3) ממסת התא ב-2 מ"ל של תווך YPD. יש לדגור במשך שעתיים בטמפרטורה של 30°C בגלגל מסתובב כדי לאפשר לזיגוטה הדו-גרעינית להתאושש.</li>
	<li>מערבבים ומדללים 10 μL של תרחיף התא ב 990 μL של מים סטריליים (דילול 1:100). השתמש בחרוזי זכוכית או בידית זכוכית סטרילית כדי לפזר 100 μL של דילול התא על מדיום נשירה שבו רק הזן המקבל (ודיפלואידים ספורדיים) גדלים. יש לדגור במשך 2-3 לילות בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס.</li>
	<li>שכפל את המושבות שנוצרו על המדיה הסלקטיבית הדרושה כפי שמוסבר במבוא (שלב 4; ראה איור 4C לדוגמה ספציפית).</li>
	<li>לאחר זיהוי מושבות חיוביות, החזירו אותן על אותה מדיה סלקטיבית כדי לטהר את הזן הפלואידי הנושא את mtDNA של עניין.</li>
	<li>בחר לפחות שתי מושבות חיוביות וגדל אותם על 2 מ"ל של YPD בינוני ב 30 ° C במשך הלילה. צור גיבוי קריוגני על ידי ערבוב 600 μL של 50% גליצרול עם 600 μL של תרבית YPD רוויה. יש לאחסן בטמפרטורה של -70°C.</li>
	<li>בודד DNA של הזנים המתקבלים31,32. להגביר את האזור הרצוי על ידי PCR ורצף כדי לאשר את נוכחותה של מוטציה מיטוכונדריאלית. הערה: כל מושבה חיובית היא שכפול טכני שיש לאשר באופן עצמאי כדי להבטיח את הרצף הנכון בגנום המיטוכונדריאלי.</li>
</ol>

טרנספורמציה ביולוגית של מיטוכונדריה שמרים לניתוח מוטגנטי

<ol><li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+analysis+of+mutated+initiation+codons+in+the+mitochondrial+COX2+gene+of+Saccharomyces+cerevisiae+fused+to+the+reporter+gene+ARG8m+reveals+lack+of+downstream+reinitiation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Gen+Genet%22%5BJournal%5D)">In vivo analysis of mutated initiation codons in the mitochondrial COX2 gene of Saccharomyces cerevisiae fused to the reporter gene ARG8m reveals lack of downstream reinitiation.</a> Mol Gen Genet. 262 (6), 1036-1046 (2000).</li>
<li>Franco, L. V. R., Su, C. H., McStay, G. P., Yu, G. J., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox2p+of+yeast+cytochrome+oxidase+assembles+as+a+stand-alone+subunit+with+the+Cox1p+and+Cox3p+modules%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cox2p of yeast cytochrome oxidase assembles as a stand-alone subunit with the Cox1p and Cox3p modules.</a> J Biol Chem. 293 (43), 16899-16911 (2018).</li>
<li>Flores-Mireles, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cytochrome+b+carboxyl+terminal+region+is+necessary+for+mitochondrial+complex+III+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">The cytochrome b carboxyl terminal region is necessary for mitochondrial complex III assembly.</a> Life Sci Alliance. 6 (7), (2023).</li>
<li>Rubalcava-Gracia, D., Vázquez-Acevedo, M., Funes, S., Pérez-Martínez, X., González-Halphen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+versus+nuclear+gene+expression+and+membrane+protein+assembly%3A+the+case+of+subunit+2+of+yeast+cytochrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial versus nuclear gene expression and membrane protein assembly: the case of subunit 2 of yeast cytochrome.</a> Mol Biol Cell. 29 (7), 820-833 (2018).</li>
<li>García-Villegas, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cox1+C-terminal+domain+is+a+central+regulator+of+cytochrome+c+oxidase+biogenesis+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The Cox1 C-terminal domain is a central regulator of cytochrome c oxidase biogenesis in yeast mitochondria.</a> J Biol Chem. 292 (26), 10912-10925 (2017).</li>
<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+cells+lacking+the+mitochondrial+gene+encoding+the+ATP+synthase+subunit+6+exhibit+a+selective+loss+of+complex+IV+and+unusual+mitochondrial+morphology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Yeast cells lacking the mitochondrial gene encoding the ATP synthase subunit 6 exhibit a selective loss of complex IV and unusual mitochondrial morphology.</a> J Biol Chem. 282 (15), 10853-10864 (2007).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Broadley, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mss51p+promotes+mitochondrial+Cox1p+synthesis+and+interacts+with+newly+synthesized+Cox1p%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Mss51p promotes mitochondrial Cox1p synthesis and interacts with newly synthesized Cox1p.</a> EMBO J. 22 (21), 5951-5961 (2003).</li>
<li>Sanchirico, M. E., Fox, T. D., Mason, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accumulation+of+mitochondrially+synthesized+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+and+Cox3p+depends+on+targeting+information+in+untranslated+portions+of+their+mRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Accumulation of mitochondrially synthesized Saccharomyces cerevisiae Cox2p and Cox3p depends on targeting information in untranslated portions of their mRNAs.</a> EMBO J. 17 (19), 5796-5804 (1998).</li>
<li>Saracco, S. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cox18p+is+required+for+export+of+the+mitochondrially+encoded+Saccharomyces+cerevisiae+Cox2p+C-tail+and+interacts+with+Pnt1p+and+Mss2p+in+the+inner+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Cox18p is required for export of the mitochondrially encoded Saccharomyces cerevisiae Cox2p C-tail and interacts with Pnt1p and Mss2p in the inner membrane.</a> Mol Biol Cell. 13 (4), 1122-1131 (2002).</li>
<li>McStay, G. P., Su, C. H., Thomas, S. M., Xu, J. T., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+assembly+intermediates+containing+subunit+1+of+yeast+cytochrome+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of assembly intermediates containing subunit 1 of yeast cytochrome oxidase.</a> J Biol Chem. 288 (37), 26546-26556 (2013).</li>
<li>Golik, P., Bonnefoy, N., Szczepanek, T., Saint-Georges, Y., Lazowska, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Rieske+FeS+protein+encoded+and+synthesized+within+mitochondria+complements+a+deficiency+in+the+nuclear+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">The Rieske FeS protein encoded and synthesized within mitochondria complements a deficiency in the nuclear gene.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (15), 8844-8849 (2003).</li>
<li>Franco, L. V. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Allotopic+expression+of+COX6+elucidates+Atco-driven+co-assembly+of+cytochrome+oxidase+and+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Life+Sci+Alliance%22%5BJournal%5D)">Allotopic expression of COX6 elucidates Atco-driven co-assembly of cytochrome oxidase and ATP synthase.</a> Life Sci Alliance. 6 (11), e202301965(2023).</li>
<li>Mireau, H., Arnal, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+Barstar+as+a+selectable+marker+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Genet+Genomics%22%5BJournal%5D)">Expression of Barstar as a selectable marker in yeast mitochondria.</a> Mol Genet Genomics. 270 (1), 1-8 (2003).</li>
<li>Cohen, J. S., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+green+fluorescent+protein+from+a+recoded+gene+inserted+into+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Mitochondrion%22%5BJournal%5D)">Expression of green fluorescent protein from a recoded gene inserted into Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA.</a> Mitochondrion. 1 (2), 181-189 (2001).</li>
<li>Suhm, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+system+to+monitor+mitochondrial+translation+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Microb+Cell%22%5BJournal%5D)">A novel system to monitor mitochondrial translation in yeast.</a> Microb Cell. 5 (3), 158-164 (2018).</li>
<li>Rzepka, M., Suhm, T., Ott, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporation+of+reporter+genes+into+mitochondrial+DNA+in+budding+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Incorporation of reporter genes into mitochondrial DNA in budding yeast.</a> STAR Protoc. 3 (2), 101359(2022).</li>
<li>Steele, D. F., Butler, C. A., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+a+recoded+nuclear+gene+inserted+into+yeast+mitochondrial+DNA+is+limited+by+mRNA-specific+translational+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Expression of a recoded nuclear gene inserted into yeast mitochondrial DNA is limited by mRNA-specific translational activation.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (11), 5253-5257 (1996).</li>
<li>Flores-Mireles, D., Camacho-Villasana, Y., Pérez-Martínez, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ARG8m+reporter+for+the+study+of+yeast+mitochondrial+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The ARG8m reporter for the study of yeast mitochondrial translation.</a> Methods Mol Biol. 2661, 281-301 (2023).</li>
<li>Perez-Martinez, X., Butler, C. A., Shingu-Vazquez, M., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual+functions+of+Mss51+couple+synthesis+of+Cox1+to+assembly+of+cytochrome+c+oxidase+in+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dual functions of Mss51 couple synthesis of Cox1 to assembly of cytochrome c oxidase in Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Mol Biol Cell. 20 (20), 4371-4380 (2009).</li>
<li>Bonnefoy, N., Remacle, C., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+and+Chlamydomonas+reinhardtii+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae and Chlamydomonas reinhardtii mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 80, 525-548 (2007).</li>
<li>Veloso Ribeiro Franco, L., Barros, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biolistic+transformation+of+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Biolistic transformation of the yeast Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA.</a> IUBMB Life. 75 (12), 972-982 (2023).</li>
<li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+alteration+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondrial+DNA+by+biolistic+transformation+and+homologous+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Directed alteration of Saccharomyces cerevisiae mitochondrial DNA by biolistic transformation and homologous recombination.</a> Methods Mol Biol. 372, 153-166 (2007).</li>
<li>Butow, R. A., Henke, R. M., Moran, J. V., Belcher, S. M., Perlman, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria+using+the+biolistic+gun%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria using the biolistic gun.</a> Methods Enzymol. 264, 265-278 (1996).</li>
<li>Bonnefoy, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> Methods Cell Biol. 65, 381-396 (2001).</li>
<li>Shingú-Vázquez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+carboxyl-terminal+end+of+Cox1+is+required+for+feedback+assembly+regulation+of+Cox1+synthesis+in+Saccharomyces+cerevisiae+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The carboxyl-terminal end of Cox1 is required for feedback assembly regulation of Cox1 synthesis in Saccharomyces cerevisiae mitochondria.</a> J Biol Chem. 285 (45), 34382-34389 (2010).</li>
<li>Bonnefoy, N., Bsat, N., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+translation+of+Saccharomyces+cerevisiae+COX2+mRNA+is+controlled+by+the+nucleotide+sequence+specifying+the+pre-Cox2p+leader+peptide%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial translation of Saccharomyces cerevisiae COX2 mRNA is controlled by the nucleotide sequence specifying the pre-Cox2p leader peptide.</a> Mol Cell Biol. 21 (7), 2359-2372 (2001).</li>
<li>Meunier, B., Lemarre, P., Colson, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+screening+in+Saccharomyces+cerevisiae+for+large+numbers+of+mitochondrial+point+mutations+which+affect+structure+and+function+of+catalytic+subunits+of+cytochrome-c+oxidase%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Biochem%22%5BJournal%5D)">Genetic screening in Saccharomyces cerevisiae for large numbers of mitochondrial point mutations which affect structure and function of catalytic subunits of cytochrome-c oxidase.</a> Eur J Biochem. 213 (1), 129-135 (1993).</li>
<li>Dorweiler, J. E., Manogaran, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoduction+and+plasmiduction+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Cytoduction and plasmiduction in yeast.</a> Bio Protoc. 11 (17), 4146(2021).</li>
<li>Zakharov, I. A., Yarovoy, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytoduction+as+a+new+tool+in+studying+the+cytoplasmic+heredity+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Cytoduction as a new tool in studying the cytoplasmic heredity in yeast.</a> Mol Cell Biochem. 14 (1-3), 15-18 (1977).</li>
<li>Conde, J., Fink, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mutant+of+Saccharomyces+cerevisiae+defective+for+nuclear+fusion%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A mutant of Saccharomyces cerevisiae defective for nuclear fusion.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 73 (10), 3651-3655 (1976).</li>
<li>Burke, D., Dawson, D., Stearns, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBurke%2C+D+%22Cold+Spring+Harbor+Laboratory.+Methods+in+yeast+genetics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+manual.+2000+ed%22">Cold Spring Harbor Laboratory. Methods in yeast genetics : a Cold Spring Harbor Laboratory manual. 2000 ed</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2000).</li>
<li>Dunham, M. J., Gartenberg, M. R., Brown, G. W. : a. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aDunham%2C+MJ+%22Methods+in+yeast+genetics+and+genomics+%3A+a+Cold+Spring+Harbor+Laboratory+course+manual.+2015+edition%22">Methods in yeast genetics and genomics : a Cold Spring Harbor Laboratory course manual. 2015 edition</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (2015).</li>
<li>Ding, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chapter+27+An+improved+method+for+introducing+point+mutations+into+the+mitochondrial+cytochrome+B+gene+to+facilitate+studying+the+role+of+cytochrome+B+in+the+formation+of+reactive+oxygen+species%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Chapter 27 An improved method for introducing point mutations into the mitochondrial cytochrome B gene to facilitate studying the role of cytochrome B in the formation of reactive oxygen species.</a> Methods Enzymol. 456, 491-506 (2009).</li>
<li>Klein, C. J. L., Olsson, L., Nielsen, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose+control+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+the+role+of+Mig1+in+metabolic+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology+%28Reading%29%22%5BJournal%5D)">Glucose control in Saccharomyces cerevisiae: the role of Mig1 in metabolic functions.</a> Microbiology (Reading). 144, Pt 1 13-24 (1998).</li>
<li>Rolland, F., Winderickx, J., Thevelein, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose-sensing+and+-signalling+mechanisms+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Res%22%5BJournal%5D)">Glucose-sensing and -signalling mechanisms in yeast.</a> FEMS Yeast Res. 2 (2), 183-201 (2002).</li>
<li>Gruschke, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Cbp3-Cbp6+complex+coordinates+cytochrome+b+synthesis+with+bc%281%29+complex+assembly+in+yeast+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The Cbp3-Cbp6 complex coordinates cytochrome b synthesis with bc(1) complex assembly in yeast mitochondria.</a> J Cell Biol. 199 (1), 137-150 (2012).</li>
<li>Seshadri, S. R., Banarjee, C., Barros, M. H., Fontanesi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+translational+activator+Sov1+coordinates+mitochondrial+gene+expression+with+mitoribosome+biogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The translational activator Sov1 coordinates mitochondrial gene expression with mitoribosome biogenesis.</a> Nucleic Acids Res. 48 (12), 6759-6774 (2020).</li>
<li>Rak, M., Tzagoloff, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((F1-dependent+translation+of+mitochondrially+encoded+Atp6p+and+Atp8p+subunits+of+yeast+ATP+synthase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">F1-dependent translation of mitochondrially encoded Atp6p and Atp8p subunits of yeast ATP synthase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (44), 18509-18514 (2009).</li>
<li>He, S., Fox, T. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mutations+affecting+a+yeast+mitochondrial+inner+membrane+protein%2C+pnt1p%2C+block+export+of+a+mitochondrially+synthesized+fusion+protein+from+the+matrix%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mutations affecting a yeast mitochondrial inner membrane protein, pnt1p, block export of a mitochondrially synthesized fusion protein from the matrix.</a> Mol Cell Biol. 19 (10), 6598-6607 (1999).</li>
<li>Rak, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+mitochondrial+translation+of+the+ATP8%2FATP6+mRNA+by+Smt1p%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Regulation of mitochondrial translation of the ATP8/ATP6 mRNA by Smt1p.</a> Mol Biol Cell. 27 (6), 919-929 (2016).</li>
<li>Barrera-Paez, J. D., Moraes, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+genome+engineering+coming-of-age%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial genome engineering coming-of-age.</a> Trends Genet. 38 (8), 869-880 (2022).</li>
</ol>

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

העבודה הנוכחית תיארה כיצד להפוך מיטוכונדריה מהשמרים S. cerevisiae בהצלחה. התהליך, מהפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה ועד לטיהור זן השמרים המיועד, אורך ~8-12 שבועות, תלוי בכמה סבבי טיהור של זן הרו הסינתטי הדרושים. חלק מהשלבים הקריטיים של השיטה הם כדלקמן. ראשית, ככל שאזורי האיגוף שנוספו סביב אתר המוטציה במבנה הגן המיטוכונדריאלי גדולים יותר, כך גדלה ההסתברות לשילוב מוצלח של מוטציית המטרה. הגודל המינימלי של אזורי האיגוף הוא ~ 100 nt; עם זאת, מומלץ מאוד להשתמש ביותר מ-500 NT בכל צד של המוטציה. שנית, בעת בחירת מושבות הרו הסינתטיות לאחר הטרנספורמציה, מומלץ שלא יתקיימו יותר מ 3-4 סבבי טיהור; אחרת, קיים סיכון גבוה שבסופו של דבר המבנה המיטוכונדריאלי יאבדו, מכיוון שאין לחץ סלקטיבי לשמור על הפלסמיד במיטוכונדריה. שלישית, כדי להימנע מפגיעה במשתמש או בציוד, עליך לקרוא בעיון את המדריך של מכונת ההפצצה לפני תחילת ההליך. ציוד זה עדין ומשתמש בלחץ גבוה ואקום.
מגבלה אחת של הליך זה היא שעד כה, רק שמרים והאצות הירוקות C. reinhardtii מועמדים לשנות מיטוכונדריה בשיטה זו. זה יהיה רלוונטי אם נוכל להציג מוטציות מכוונות אתר על הגנום המיטוכונדריאלי מאורגניזמים אחרים. מגבלה נוספת היא שזה מאתגר לשנות מבנים רבים ושונים באותו מפגש. מומלץ לבצע שש טרנספורמציות לכל קונסטרוקציה, שכל אחת מהן חייבת להיבדק, להיבחר ולהיטהר. התוצאה היא יותר מ-50 לוחות מדיה רק כדי לקבל מושבות רו טהורות של מוטציה מיטוכונדריאלית אחת.
למרות מגבלות אלה, היכולת לתפעל את הגנום המיטוכונדריאלי של שמרים תרמה באופן משמעותי להבנת מסלולים רבים של ביוגנזה של קומפלקסים נשימתיים. גישה זו יכולה לשמש להחדרת גנים מדווחים לניטור וכימות תרגום מיטוכונדריאלי 1,7,36,37, הפרעה לגנים מיטוכונדריאליים 38, זיהוי מלווי הרכבה של קומפלקסים נשימתיים39, הבנה טובה יותר של מנגנוני תרגום והרכבה מיטוכונדריאלית מצומדת 7,11,12,36ולחפש מדכאים כאשר עוקבים אחר ביטוי של גן מיטוכונדריאלי שעבר מוטציה40., עד כה, למרות שגישות מסוימות למניפולציה של הגנום המיטוכונדריאלי ביונקים דווחו מוקדם יותר41, לא קיימת שיטה נפוצה לשינוי דנ"א מיטוכונדריאלי עבור אורגניזמים אלה.

<table><tbody><tr><td>1 מ"ל קצות פיפטה</td><td>Axygen</td><td>T-1000-B</td><td></td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינור</td><td>Axygen</td><td>MCT-150-C</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; קצות פיפטה L</td><td>Axygen</td><td>T-10-C</td><td></td></tr><tr><td>15 מ"ל צינור תחתון חרוטי &nbsp;</td><td>Axygen</td><td>SCT-25ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; קצות פיפטה L</td><td>Axygen</td><td>T-200-Y</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל תחתית חרוטית&nbsp; צינור</td><td>Axygen</td><td>SCT-50ML-25-S</td><td></td></tr><tr><td>AfiII</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R0520S</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>SeaKem</td><td>50004</td><td></td></tr><tr><td>איזון אנליטי</td><td>OHAUS</td><td>ARA520</td><td></td></tr><tr><td>אוטוקלאב</td><td>TOMY</td><td>ES-315</td><td></td></tr><tr><td>בקטו אגר</td><td>BD</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Bacto peptone</td><td>BD</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>מחזיק מקרו-נשא ביוליזיטי&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1652322</td><td></td></tr><tr><td>מבער בונסן</td><td>VWR</td><td>89038-528</td><td></td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ADE</td><td>Formedium</td><td>DCS0049</td><td></td></tr><tr><td>CSM -ARG</td><td>Formedium</td><td>DCS0059</td><td></td></tr><tr><td>CSM -LEU</td><td>Formedium</td><td>DCS0099</td><td></td></tr><tr><td>CSM -URA</td><td>Formedium</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCS0169 בקבוק זכוכית תרבות</td><td>KIMAX KIMBLE</td><td>25615</td><td></td></tr><tr><td>צינור זכוכית תרבית</td><td>פיירקס</td><td>9820</td><td></td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>BD</td><td>215520</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>JT אופה&nbsp;</td><td>9000</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים</td><td>Millipore</td><td>620006</td><td></td></tr><tr><td>חרוזי זכוכית</td><td>סיגמא</td><td>Z265926</td><td></td></tr><tr><td>ידית זכוכית</td><td>סיגמא</td><td>S4647</td><td></td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>JT BAKER</td><td>2136-01</td><td></td></tr><tr><td>מיכל הליום דרגה 5 (99.99%)-</td><td></td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HSTaq&nbsp; ערכת</td><td>PCR BIO</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוצנטריפוגה</td><td>אפנדורף</td><td>022620100</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>ניו אינגלנד BioLabs</td><td>R0111L</td><td></td></tr><tr><td>שייקר אורביטלי</td><td>ניו ברונסוויק מדעי</td><td>NB-G25</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR</td><td>Axygen</td><td>PCR-02-C</td><td></td></tr><tr><td>PDS-1000/He TM מערכת אספקת חלקיקים ביוליסטיים</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2257</td><td></td></tr><tr><td>צלחות פטרי (100X10)</td><td>BD</td><td>252777</td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Formedium</td><td>RAF03</td><td></td></tr><tr><td>פלטת העתק</td><td>Scienceware</td><td>Z363391</td><td></td></tr><tr><td>דיסקי קרע 1350 Psi</td><td>BIO-RAD</td><td>1652330</td><td></td></tr><tr><td>סורביטול</td><td>סיגמא</td><td>S7547</td><td></td></tr><tr><td>Spermidine</td><td>Sigma</td><td>S0266</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>Thermo Scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>מסובב תרבית רקמות</td><td>Thermo Scientific</td><td>88882015</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-נשאי טונגסטן M10</td><td>BIO-RAD</td><td>1652266</td><td></td></tr><tr><td>משאבת ואקום בקיבולת 100 ליטר לדקה</td> <td>-</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>רפידות קטיפה</td><td>Bel-Art</td><td>H37848-0002</td><td></td></tr><tr><td>וורטקס&nbsp;</td><td>Scientifc Industries</td><td>SI-0236</td><td></td></tr><tr><td>מקל אפליקטור עץ</td> תמצית שמרים <td>PROMA</td><td>1820060</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>שמרים על בסיס חנקן ללא חומצות אמינו</td><td>BD</td><td>291920</td><td></td></tr></tbody></table>

טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

Mitochondrial Transformation in Baker&#39;s Yeast to Study Translation and Respiratory Complex Assembly

שמרי אפייה Saccharomyces cerevisiae נמצאים בשימוש נרחב להבנת הביולוגיה של המיטוכונדריה מזה עשרות שנים. מודל זה סיפק ידע על מסלולים מיטוכונדריאליים חיוניים ושמורים בקרב איקריוטים, ומסלולים ספציפיים לפטריות או שמרים. אחת היכולות הרבות של S. cerevisiae היא היכולת לתמרן את הגנום המיטוכונדריאלי, אשר עד כה אפשרי רק ב - S. cerevisiae ובאצות החד-תאיות Chlamydomonas reinhardtii. השינוי הביולוגי של מיטוכונדריית שמרים מאפשר לנו להציג מוטציות מכוונות אתר, לבצע סידורים מחדש של גנים ולהציג כתבים. גישות אלה משמשות בעיקר להבנת המנגנונים של שני תהליכים מתואמים מאוד במיטוכונדריה: תרגום על ידי מיטוריבוזומים והרכבה של קומפלקסים נשימתיים וסינתאז ATP. עם זאת, טרנספורמציה מיטוכונדריאלית יכולה לשמש באופן פוטנציאלי לחקר מסלולים אחרים. בעבודה הנוכחית אנו מראים כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות הפצצת מיקרו-קליע במהירות גבוהה, לבחור ולטהר את הטרנספורמציה המיועדת, ולהציג את המוטציה הרצויה בגנום המיטוכונדריאלי.

עבודה זו מסבירה כיצד לשנות מיטוכונדריה של שמרים באמצעות שיטה ביוליסטית. אנו גם מראים כיצד לבחור ולטהר את הטרנספורמנטים וכיצד להציג את המוטציה הרצויה במיקום המטרה בתוך הגנום המיטוכונדריאלי.

Baker&#180;s yeast Saccharomyces cerevisiae has been widely used to understand mitochondrial biology for decades. This model has provided knowledge about ...

mitochondrial-transformation-baker-s-yeast-to-study-translation

Research

JoVE Journal

Genetics

גנטיקה

הגנום המיטוכונדריאלי של שמרי בייקר מקודד שמונה פוליפפטידים. מטרת הפרוטוקול הנוכחי היא לתייג את כולם ולאחר מכן לדמיין אותם כקצועות נפרדות.

תיוג והדמיה של מוצרי ביטוי גנום מיטוכונדריאלי ב Cerevisiae שמרים של בייקר

נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים של שמרים היא אינדיקטור רב ערך לביו-אנרגטיקה של התאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות פנוטיפ זה הרלוונטי למיני שמרים שונים.

כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים

שמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe מתגלים כמודל אטרקטיבי לחקר מיטוכונדריה. כאן, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח השפע וההרכבה של קומפלקסי הנשימה המיטוכונדריאלים ב-S. pombe. זה מאפשר לאפיין את הפונקציות החדשות של גנים שמורים בשרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית.

ניתוח הביטוי והרכבת הקומפלקסים של חלבוני שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית בשמרי הביקוע Schizosaccharomyces pombe

A-תפוקה גבוהה, אוטומטית, מתודולוגיה ייצור וטרנספורמציה טבק פרוטופלאסט מתוארת. המערכת הרובוטית מאפשרת ביטוי גנים מקביל מסיבי וגילוי במודל BY-2 המערכת שאמורה להיות לתרגום לגידולים שאינם מודל.

פלטפורמה רובוטית עבור תפוקה גבוהה בידוד פרוטופלאסט וההשנאה

אנו מתארים אסטרטגית החלפת גנים חזקה כדי גנטי לתפעל פטריית תועבת Ustilago maydis. פרוטוקול זה מסביר כיצד ליצור מוטציות מחיקות לחקור פנוטיפים זיהום. זה יכול להתארך עד לשנות את הגנים בכל דרך רצויה, למשל, על ידי הוספת רצף קידוד תג חלבון פלואורסצנטי.

מניפולציה גנטית של פתוגן הצמח<em&gt; Ustilago maydis</em&gt; ללמוד ביולוגיה פטרייתי אינטראקציות חיידק צמח

מוצגת אסטרטגיה ליצירת מוטציות בגנים היסטונים במיקומם האנדוגני ב-Saccharomyces cerevisiae.

ממוקד<em&gt; באתרו</em&gt; גני mutagenesis של היסטון שמרים הנץ

המטרה של פרוטוקול זה היא לתאר את אופן השימוש בלייזר microirradiation לזירוז סוגים שונים של נזק לדנ א, לרבות מעברי חוט פשוטה יחסית, נזק מורכבות, ללמוד DNA נזק איתות ותיקון גורם מכלול אתרים של נזק ויוו .

לייזר Microirradiation ללמוד In Vivo הסלולר התגובות נזק לדנ א פשוטים ומורכבים

פרוטוקול זה מתאר שימוש קומבינטורית של שבב-seq, 4sU-seq, הכולל RNA-seq ריבוזום פרופיל עבור שורות תאים ותאים הראשי. הוא מאפשר מעקב אחר שינויים בגורם שעתוק כריכה, תמלול דה נובו , עיבוד RNA, מחזור, תרגום לאורך זמן, ומציג את השתלשלות האירועים הכוללת בתאים מופעל ו/או המשתנה במהירות.

ניתוח בזמן אמת של גורם שעתוק כריכה, תמלול, תרגום, מחזור ולהציג אירועים גלובליים במהלך ההפעלה הסלולרית

מאמר זה מתאר מתודולוגיה מפורט אקראי מוטגנזה מכוונת של גנים היעד בביקוע שמרים. כדוגמה, אנחנו יעד rpt4 +, שמקודד של יחידת משנה של פרוטאוזום 19, וכן מסך מוטציות ביציבותה הטרוכרומטין.

גן במיקוד אקראי מוטגנזה מכוונת לבחירת יציב הטרוכרומטין פרוטאוזום מוטציות שמרים ביקוע

פרוטוקול זה מספק חוקרים עם כלי חדש כדי לפקח על הנאמנות של שעתוק אורגניזמים דגם מרובים.

מעקב ברמת הגנום של שגיאות תיעתוק היצורים האיקריוטים

חקור את מנגנוני התרגום המיטוכונדריאלי והרכבת הממברנה הפנימית בSaccharomyces cerevisiae. הפרוטוקול מדגים שיטת הפצצה ביוליסטית להעברת DNA מיטוכונדריאלי וניתוח תפקוד מיטוכונדריאלי ברמה מולקולרית.

טרנספורמציה מיטוכונדריאלית בבייקר

גלה סרטונים נוספים