Name: בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T13:50:00.000+00:00
Duration: 6 min 28 s
Description: למדו לבודד תאי מערכת חיסון ממוח ומוח עצם של עכבר לאחר איסכמיה מוחית. שיטות אלו שומרות על פרופילים תרשימיים ופרוטאומיים לחקר תגובות חיסון ומציאת מטרות טיפוליות חדשות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לקתי גייג' על תרומתה המצוינת לעריכה. דמויות האיור נוצרו באמצעות BioRender.com. מחקר זה נתמך על ידי קרנות מהמחלקה להרדמה (המרכז הרפואי של אוניברסיטת דיוק) ומענקים של NIH NS099590, HL157354 ו-NS127163.

הפרוטוקול אושר על ידי הוועדה לטיפול ושימוש בבעלי חיים של מכון דיוק (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בעכברי C57Bl/6 זכרים (בני 3-4 חודשים; 22-28 גרם). פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.
1. השעיה של תא בודד ממוח העכבר
הערה: איור 1 מדגים את הסקירה הכללית של פרוטוקול בידוד תאי המוח.
<ol><li>להרדים, לבצע אינטובציה ולאבטח את העכבר, כפי שהודגם קודם לכן11.</li>
	<li>בצעו חתך בבטן העליונה דרך העור ושכבות השרירים שמתחתיו, וחתכו בזהירות דרך הסרעפת והצלעות כדי ליצור את הפתח לחלל בית החזה.</li>
	<li>ממלאים מזרק 30 מ"ל ב-PBS קר ומחברים אותו למחט הזילוח הקהה באמצעות צינורות סיליקון. הכנס בזהירות את מחט הזילוח לחדר השמאלי.</li>
	<li>בצע ניק קטן באטריום הימני כדי לאפשר ניקוז דם ולאחר מכן לנקב12 העכבר בקצב זרימה של ~ 10 מ"ל / דקה למשך 3-4 דקות. הערה: כדי לשפר את פינוי הדם במוח, ניתן לשקול להגדיל את נפח תמיסת הזילוח ולהוסיף הפרין.</li>
	<li>ערפו את ראשו של העכבר ובצעו חתך בקו האמצע דרך העור בחלק העליון של הראש כדי לחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>יש לגרד בזהירות כל רקמת חיבור מעל הגולגולת באמצעות מלקחיים קהים.</li>
	<li>השתמש מספריים דיסקציה חדה לחתוך בזהירות דרך תפרי הגולגולת לאורך קו האמצע משני הצדדים, יצירת דש.</li>
	<li>הרימו בעדינות את דש הגולגולת כדי לחשוף את המוח, והשתמשו במלקחיים קהים כדי להסיר בזהירות את המוח מחלל הגולגולת.</li>
	<li>טבלו את המוח בצלוחית פטרי המכילה PBS קר כקרח והסירו את כל רקמות קרום המוח שנותרו. הערה: כדי לשמר טוב יותר את יכולת הקיום של התא, מומלץ לבצע את כל השלבים הבאים על קרח או בטמפרטורה של 4°C.</li>
	<li>הניחו את המוח בתוך זכוכית מקוררת מראש של 15 מ"ל Dounce homogenizer המכילה 20 מ"ל (מוח שלם) או 12 מ"ל (חצי מוח) של חיץ HBSS עתיק כקרח.</li>
	<li>השתמש במזיק Dounce הרופף כדי לנתק בעדינות ובאיטיות את רקמת המוח עם כ 100-120 שבץ על קרח. הערה: שלב זה חיוני להשגת כמות גדולה של תאי מוח בריאים. שלב זה אורך כ-10 דקות. עצור הומוגניזציה כאשר לא נראים גושי רקמת מוח משמעותיים בתרחיף. בשלב זה, המזיק יכול בקלות לנוע למטה ללא כל כוח.</li>
	<li>סנן את תרחיף רקמת המוח שנוצר דרך מסננת תאים של 70 מיקרומטר בצינור צנטריפוגה של 50 מ"ל.</li>
	<li>שטפו את צינור Dounce עם HBSS של 5 מ"ל, והמשיכו בסינון כדי למקסם את איסוף התאים.</li>
	<li>צנטריפוגה את מתלה הרקמה המסונן ב 550 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>הסר את supernatant באמצעות שואב ואקום, והשהה מחדש את גלולת התא ב 1 מ"ל של 30% צפיפות איזוטונית גרדיאנט פתרון. הערה: כדי ליצור 15 מ"ל של תמיסת שיפוע צפיפות איזוטונית של 30%, ערבב 4.5 מ"ל של מדיום שיפוע צפיפות מלאי של 100%, 1.5 מ"ל של 10× PBS ו- 9 מ"ל של ddH2O.</li>
	<li>מעבירים את תרחיף התא לתוך צינור צנטריפוגה של 15 מ"ל, ומוסיפים 9 מ"ל (מוח שלם) או 6 מ"ל (חצי מוח) של תמיסת שיפוע צפיפות של 30%.</li>
	<li>הפוך בעדינות את הצינור כדי להבטיח ערבוב יסודי.</li>
	<li>מיד צנטריפוגה את הצינור ב 845 x g עם האצה ובלם להגדיר ברמה 3, במשך 20 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>מוציאים בעדינות את הצינור מהצנטריפוגה מבלי לרעוד, ושאפו בזהירות את שכבת המיאלין העליונה באמצעות קצה של 1 מ"ל המחובר לוואקום. הערה: חשוב ביותר לא להפריע לשכבה זו. כל שארית המיאלין עלולה להשפיע לרעה על בריאות התאים ולפגוע בניתוחים במורד הזרם.</li>
	<li>שאפו את הסופרנטנט, השאירו 1-2 מ"ל מאחור, והשעו מחדש את גלולת התא עם מינימום של 10 מ"ל HBSS קר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 550 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לשטוף פעם נוספת עם מינימום של 7 מ"ל של HBSS קר.</li>
	<li>הסר כמה שיותר מהסופרנאטנט, והשהה מחדש את התאים לניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות 100-200 מיקרוליטר של מאגר ציטומטריית זרימה. הערה: מאגר FACS של ציטומטריית זרימה המשמש למחקר זה מכיל 0.5% BSA ו- 2 mM EDTA ב- 1× PBS. פלטה תחתונה V בעלת 96 בארות לצביעת תאים מומלצת כדי למזער את אובדן התאים במהלך שלבי הכביסה.</li>
	<li>ביצוע ניתוח ציטומטריית זרימה באמצעות פרוטוקול סטנדרטי שנקבע במעבדות בודדות13.<ol><li>בקצרה, לערבב 80 μL של תרחיף התא עם 20 μL של תערובת נוגדנים בצלחת V-תחתית 96-באר לדגור במשך 25 דקות ב 4 ° C.</li>
		<li>יש לשטוף עם 200 μL של מאגר FACS ולאחר מכן להשעות מחדש את התאים עם 100 μL של HBSS בתוספת מגיב צביעת כדאיות התא.</li>
		<li>לאחר דגירה של 15 דקות ב-4°C, יש לשטוף עם חיץ FACS ולהשהות מחדש את התאים ב-200 μL של מאגר FACS לצורך ניתוח ציטומטריית זרימה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנת מח עצם חד תאי השעיה מ calvaria עכבר
הערה: איור 2 מתאר סקירה כללית של הליך בידוד מח עצם הגולגולת.
<ol><li>נקב את העכבר כמתואר בשלב 1.4.</li>
	<li>ערפו את ראשו של העכבר ובצעו חתך עור בקו האמצע בקרקפת כדי לחשוף את הגולגולת.</li>
	<li>חותכים דרך הגולגולת, מתחילים מהפורמן מגנום ונעים קדימה לאורך הצדדים הרוחביים של הקלבריה באמצעות מספריים חדים. לאחר מכן, להרים ולהסיר את calvaria. הערה: ניתן לקצור את המוח מאותו עכבר ולעבד אותו באמצעות שלב 1, המאפשר ניתוח של תאי מערכת החיסון הן מהמוח והן ממח עצם הגולגולת.</li>
	<li>מקלפים בזהירות את הדורה מאטר מהגולגולת תחת מיקרוסקופ מנתח באמצעות מלקחיים קהים. הערה: קל יותר להתחיל בשולי העצם העורפית, להתנתק לאט, ולהתקדם בהתמדה לכיוון האזור הקדמי, לעבוד פנימה.</li>
	<li>מניחים את calvaria בצלחת על קרח ולהשתמש פיפטה 1 מ"ל כדי לשטוף את calvaria, הבטחת הסרת שאריות דם מפני השטח שלה.</li>
	<li>מעבירים את הקלבריה למאכל חדש עם PBS טרי וקר מספיק כדי לטבול את הקלבריה.</li>
	<li>השתמש מספריים סטריליים לחתוך את calvaria לתוך כ 3 מ"מ x 3 מ"מ רסיסים PBS קר. הערה: שיטות חיתוך עשויות להשפיע על היעילות של מיצוי מח עצם קלווריה. מומלץ להשתמש באותה שיטת חיתוך כדי למזער את השונות. חשוב גם לחתוך את התפרים. איור 2B מדגים גישה אחת.</li>
	<li>תקעו חור בתחתית צינור מיקרוצנטריפוגה של 500 מיקרוליטר באמצעות מחט של 18 גרם.</li>
	<li>הכנס צינור זה לתוך צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל המכיל 20 μL של PBS קר.</li>
	<li>מעבירים את שברי הקלבריה לצינור 500 μL. הערה: יש לארוז את שברי העצם באופן רופף כדי להגביר את יעילות החילוץ.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 10,000 x גרם במשך 30 שניות ב 4 ° C. הערה: כדי למקסם את התאוששות התא, השתמש במחט 18 G כדי לערבב בעדינות את שברי הקלבריה, וחזור על שלב זה 1-2 פעמים נוספות.</li>
	<li>להשהות מחדש את תאי מח העצם calvaria שנאספו ב 500 μL של חיץ ליזה של תאי דם אדומים לדגור בטמפרטורת החדר במשך 30 שניות.</li>
	<li>העבר את המתלה לצינור צנטריפוגה 15 מ"ל המכיל 4 מ"ל PBS קר.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 400 x גרם במשך 6 דקות ב 4 ° C.</li>
	<li>לשטוף פעם נוספת עם 5 מ"ל של PBS קר.</li>
	<li>השהה מחדש את גלולת התא במאגר מתאים. עבור ציטומטריית זרימה, אנו משתמשים בדרך כלל ב- 500 μL של מאגר FACS.</li>
	<li>לניתוח ציטומטריית זרימה, בצע ספירת תאים והשתמש בכ- 1 x 106 תאים לצביעת נוגדנים. הערה: הקפד לכלול את שלב חסימת Fc לפני צביעת נוגדנים13.</li>
</ol>

השגת תרחיפים חד-תאיים ממוח מורין ומח עצם הגולגולת

<ol><li>Bohr, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+glymphatic+system%3A+Current+understanding+and+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">The glymphatic system: Current understanding and modeling.</a> iScience. 25 (9), 104987(2022).</li>
<li>Jiang-Xie, L. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+dynamics+direct+cerebrospinal+fluid+perfusion+and+brain+clearance%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Neuronal dynamics direct cerebrospinal fluid perfusion and brain clearance.</a> Nature. 627 (8002), 157-164 (2024).</li>
<li>Goertz, J. E., Garcia-Bonilla, L., Iadecola, C., Anrather, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+compartments+at+the+brain%27s+borders+in+health+and+neurovascular+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Immunopathol%22%5BJournal%5D)">Immune compartments at the brain's borders in health and neurovascular diseases.</a> Semin Immunopathol. 45 (3), 437-449 (2023).</li>
<li>Herisson, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+vascular+channels+connect+skull+bone+marrow+and+the+brain+surface+enabling+myeloid+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Direct vascular channels connect skull bone marrow and the brain surface enabling myeloid cell migration.</a> Nat Neurosci. 21 (9), 1209-1217 (2018).</li>
<li>Mazzitelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+bone+marrow+channels+as+immune+gateways+to+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Skull bone marrow channels as immune gateways to the central nervous system.</a> Nat Neurosci. 26 (12), 2052-2062 (2023).</li>
<li>Cugurra, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Skull+and+vertebral+bone+marrow+are+myeloid+cell+reservoirs+for+the+meninges+and+CNS+parenchyma%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Skull and vertebral bone marrow are myeloid cell reservoirs for the meninges and CNS parenchyma.</a> Science. 373 (6553), 7844(2021).</li>
<li>Brioschi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+of+meningeal+b+cells+reveals+a+lymphopoietic+niche+at+the+CNS+borders%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity of meningeal b cells reveals a lymphopoietic niche at the CNS borders.</a> Science. 373 (6553), 9277(2021).</li>
<li>Smyth, L. C. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+direct+connections+between+the+dura+and+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Identification of direct connections between the dura and the brain.</a> Nature. 627, 165-173 (2024).</li>
<li>Mazzitelli, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+regulates+skull+bone+marrow+niches+via+direct+access+through+dural+channels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid regulates skull bone marrow niches via direct access through dural channels.</a> Nat Neurosci. 25 (5), 555-560 (2022).</li>
<li>Pulous, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+can+exit+into+the+skull+bone+marrow+and+instruct+cranial+hematopoiesis+in+mice+with+bacterial+meningitis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid can exit into the skull bone marrow and instruct cranial hematopoiesis in mice with bacterial meningitis.</a> Nat Neurosci. 25 (5), 567-576 (2022).</li>
<li>Li, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+cardiac+arrest+model+for+brain+imaging+and+brain+physiology+monitoring+during+ischemia+and+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Mouse cardiac arrest model for brain imaging and brain physiology monitoring during ischemia and resuscitation.</a> J Vis Exp. (194), e65340(2023).</li>
<li>Wang, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+a+novel+mouse+model+of+asphyxial+cardiac+arrest+revealed+severely+impaired+lymphopoiesis+after+resuscitation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of a novel mouse model of asphyxial cardiac arrest revealed severely impaired lymphopoiesis after resuscitation.</a> J Am Heart Assoc. 10 (11), e019142(2021).</li>
<li>Li, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+transcriptomic+analysis+of+the+immune+cell+landscape+in+the+aged+mouse+brain+after+ischemic+stroke%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Single-cell transcriptomic analysis of the immune cell landscape in the aged mouse brain after ischemic stroke.</a> J Neuroinflammation. 19 (1), 83(2022).</li>
<li>Wang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perk+%28protein+kinase+RNA-like+er+kinase%29+branch+of+the+unfolded+protein+response+confers+neuroprotection+in+ischemic+stroke+by+suppressing+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Stroke%22%5BJournal%5D)">Perk (protein kinase RNA-like er kinase) branch of the unfolded protein response confers neuroprotection in ischemic stroke by suppressing protein synthesis.</a> Stroke. 51 (5), 1570-1577 (2020).</li>
<li>Posel, C., Moller, K., Boltze, J., Wagner, D. C., Weise, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+flow+cytometric+analysis+of+immune+cells+from+the+ischemic+mouse+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and flow cytometric analysis of immune cells from the ischemic mouse brain.</a> J Vis Exp. (108), e53658(2016).</li>
<li>Srakocic, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proposed+practical+protocol+for+flow+cytometry+analysis+of+microglia+from+the+healthy+adult+mouse+brain%3A+Systematic+review+and+isolation+methods%27+evaluation%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Proposed practical protocol for flow cytometry analysis of microglia from the healthy adult mouse brain: Systematic review and isolation methods' evaluation.</a> Front Cell Neurosci. 16, 1017976(2022).</li>
<li>Disano, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolating+central+nervous+system+tissues+and+associated+meninges+for+the+downstream+analysis+of+immune+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolating central nervous system tissues and associated meninges for the downstream analysis of immune cells.</a> J Vis Exp. (159), e61166(2020).</li>
<li>Mattei, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+dissociation+induces+transcriptional+and+proteotype+bias+in+brain+cell+populations%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Enzymatic dissociation induces transcriptional and proteotype bias in brain cell populations.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), (2020).</li>
<li>Mcgill, C. J., Lu, R. J., Benayoun, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+analysis+of+mouse+neutrophil+netosis+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for analysis of mouse neutrophil netosis by flow cytometry.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100948(2021).</li>
<li>Su, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+immunity+and+neurological+diseases%3A+New+approaches%2C+new+insights%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Meningeal immunity and neurological diseases: New approaches, new insights.</a> J Neuroinflammation. 20 (1), 125(2023).</li>
<li>Niu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanical+isolation+of+neonatal+and+adult+mouse+dura+leukocytes+for+flow+cytometry+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Mechanical isolation of neonatal and adult mouse dura leukocytes for flow cytometry analysis.</a> STAR Protoc. 4 (2), 102272(2023).</li>
<li>Roussel-Queval, A., Rebejac, J., Eme-Scolan, E., Paroutaud, L. A., Rua, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Flow+cytometry+and+immunohistochemistry+of+the+mouse+dural+meninges+for+immunological+and+virological+assessments%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Flow cytometry and immunohistochemistry of the mouse dural meninges for immunological and virological assessments.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102119(2023).</li>
<li>Louveau, A., Filiano, A. J., Kipnis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Meningeal+whole+mount+preparation+and+characterization+of+neural+cells+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Meningeal whole mount preparation and characterization of neural cells by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. 121 (1), e50(2018).</li>
</ol>

כאן מוצגים שני פרוטוקולים פשוטים אך יעילים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. פרוטוקולים אלה יכולים להניב באופן אמין כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא שעשויים להתאים ליישומים מגוונים במורד הזרם, במיוחד עבור ציטומטריית זרימה.
כדי לחקור דלקת עצבית בהפרעות מוח שונות, פרוטוקולים רבים לתכשירי תאי חיסון מהמוח נקבעו ושימשו במעבדות שונות 15,16,17. הגישות הנפוצות כוללות דיסוציאציה תאית מבוססת אנזימים ואחריה הפרדה הדרגתית. בדרך כלל, בפרוטוקולים אלה, רקמת המוח נטחנת ולאחר מכן מודגרת בתמיסת עיכול אנזימים המכילה גם collagenase וגם DNase במשך 30-60 דקות ב 37 ° C עם רעד עדין. לאחר העיכול, התאים עוברים דיסוציאציה נוספת בשיטה מכנית כגון פיפטינג או הומוגניזציה של Dounce. לאחר שהם עוברים דרך מסננת תאים (למשל, מסננת של 70 מיקרומטר), התאים עוברים צנטריפוגה הדרגתית (לעתים קרובות תמיסת שיפוע צפיפות של 30%/70%) כדי להסיר מיאלין, תאי דם אדומים ופסולת ולהעשיר לויקוציטים. עם זאת, גישה זו דורשת דגירה אנזימטית ממושכת ב 37 מעלות צלזיוס שעשויה לשנות באופן משמעותי את התמלול והפרוטאום של תאי מערכת החיסון במוח. ואכן, מחקר שיטתי הציע כי הגישה האנזימטית מציגה שינויים עמוקים בשעתוק ובפרוטיאוטיפ של תאי מוח ספציפיים18. זה יכול להוביל לממצאים בניתוחי שעתוק עוקבים כגון scRNA-seq. לעומת זאת, הפרוטוקול המדווח כאן משתמש בגישת דיסוציאציה מכנית בטמפרטורות קרות לאורך כל ההליך, ובכך מדכא את חילוף החומרים התאי. זה מבטיח שימור טוב יותר של מצב השעתוק והפרוטאומי, וממזער ממצאים פוטנציאליים. במהלך פיתוח הפרוטוקול, שמנו לב ששימוש בהומוגנייזר Dounce גדול להומוגניזציה של רקמת המוח הוא קריטי להשגת ספירת תאים גבוהה יותר עם מוות תאי נמוך יותר. סביר להניח כי במהלך הומוגניזציה של Dounce, נוכחות מסיבית של מטריצות חוץ-תאיות, פסולת תאים ורכיבים ציטופלזמיים רעילה לתאים. שימוש בכמות מופרזת של חיץ מסייע לדלל חומרים רעילים אלה, ובכך ממתן את ההשפעות המזיקות שלהם, מה שמוביל לקיום טוב יותר של התא. נתוני ציטומטריית הזרימה אישרו שיעור קיום משוער של 85% של תאי חיסון שהוכנו עם פרוטוקול זה. יתר על כן, ראוי לציין כי צנטריפוגה עם תמיסה שיפוע צפיפות של 30% בלבד מעשירה ביעילות את תאי החיסון במוח ומסירה מיאלין. זה יכול גם להפחית את עלות הכנת התא.
מחקרים על תאי מערכת החיסון במח עצם הגולגולת עדיין מוגבלים. שיטה נפוצה לבידוד תאים מקלבריום גולגולת העכבר כוללת חיתוך הגולגולת לחתיכות קטנות ולאחר מכן ריסוק מכני של החתיכות עם מזיק6. בפרוטוקול הנוכחי נעשה שימוש בצנטריפוגה קצרה. שיטה זו לקוחה מפרוטוקול שפורסם להכנת מח עצם מעצם הירך ומטיביאס19. עבור עצמות ארוכות אלה, יש רק לחתוך קצה אחד של העצם כדי לאסוף את מח העצם על ידי צנטריפוגה. עבור הגולגולת, שלב זה משתנה על ידי חיתוך אותו למספר חתיכות קטנות כדי לפתוח את חלל המח. מומלץ להשתמש בתבנית עקבית לחיתוך הגולגולת על מנת לקבל ספירת תאים הניתנת לשחזור. יתר על כן, כדי למקסם את ההתאוששות של תאי מח העצם, חתיכות הגולגולת יכולות לעבור 2-3 סבבים של צנטריפוגה עם ערבוב בין כל צנטריפוגה.
לשני הפרוטוקולים יש מגבלות. ראשית, השימוש בצנטריפוגה של תמיסת שיפוע צפיפות של 30% עשוי שלא להסיר ביעילות את תאי הדם האדומים הנותרים במוח, מה שעלול להתרחש עקב זילוח חלקי. יתר על כן, אם מבנה המיאלין מווסת בתנאים מסוימים, תמיסת שיפוע צפיפות של 30% עשויה שלא להיות ריכוז אופטימלי להסרתם. במקרה זה, יש לקבוע ריכוז עבודה נוסף של פתרון שיפוע צפיפות. שנית, למרות שניתוח ציטומטריית זרימה מצביע על יכולת קיום טובה של תאי החיסון במוח באמצעות הפרוטוקול המתואר, עדיין יש להעריך אותו עבור יישומים אחרים, כגון ניתוח שעתוק שבו ניתן להשתמש באקטינומיצין D. שלישית, הקלבריה משמשת להכנת מח עצם הגולגולת. עם זאת, יש לציין כי תאים חיסוניים קיימים בחלקים רבים אחרים של הגולגולת. לבסוף, קרומי המוח, במיוחד הדורה מאטר, מכילים תאים חיסוניים מגוונים וממלאים תפקידים בהומאוסטזיס מוחי ובתפקוד לקוי20. לצורך ניתוח חיסוני של קרומי המוח, פרוטוקול שפורסם במקום אחר עשוי להיות מאומץ 17,21,22,23.
לסיכום, מתוארים שני פרוטוקולים חזקים לבידוד תאי מערכת החיסון הן ממוח העכבר והן מהגולגולת. פרוטוקולים אלה צפויים להיות שימושיים להשגת כמות גדולה של תאים באיכות גבוהה, המתאימים ליישומים שונים במורד הזרם.

המוח, המרכז המרכזי של מערכת העצבים, מוגן על ידי הגולגולת. מתחת לגולגולת שלוש שכבות של רקמת חיבור הידועות בשם קרומי המוח - דורה מאטר, מאטר ארכנואיד ופיה מאטר. נוזל מוחי שדרתי (CSF) מסתובב בחלל התת עכבישי בין המאטר הארכנואיד לבין פיאה מאטר, מרפד את המוח וגם מסלק פסולת דרך המערכת הגלימפטית 1,2. יחד, ארכיטקטורה ייחודית זו מספקת סביבה בטוחה ותומכת השומרת על יציבות המוח ומגינה עליו מפני פגיעה פוטנציאלית.
המוח נחשב כבר מזמן לחסינות-פריבילגית. עם זאת, רעיון זה נזנח חלקית מכיוון שראיות מצטברות מצביעות על כך שבנוסף לתאי מיקרוגליה בפרנכימה, גבולות המוח, כולל מקלעת הכורואיד וקרומי המוח, מארחים מערך מגוון של תאי חיסון3. תאים אלה ממלאים תפקידים קריטיים בשמירה על הומאוסטזיס, שמירה על בריאות המוח וייזום התגובה החיסונית לפגיעה מוחית. יש לציין כי ממצאים אחרונים מצביעים על כך שהגולגולת מעורבת בחסינות קרומי המוח, ועשויה לתרום לתגובה החיסונית במוח לאחר פציעה. בשנת 2018, הריסון ועמיתיו גילו תגלית ראשונית של תעלות כלי דם ישירות המקשרות את מח עצם הגולגולת לקרומי המוח, ובכך ביססו נתיב אנטומי לנדידת לויקוציטים 4,5. מאוחר יותר, Cugurra et al. הראו כי תאים מיאלואידים רבים (למשל, מונוציטים ונויטרופילים) ותאי B בקרומי המוח אינם מקורם בדם6. באמצעות טכניקות כגון השתלת עצם קלבריה ומשטרי הקרנה סלקטיבית, המחברים סיפקו ראיות משכנעות לכך שמח עצם הגולגולת משמש כמקור מקומי לתאים מיאלואידים בקרומי המוח, כמו גם פרנכימה CNS לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית6. יתר על כן, מחקר אחר הציע כי תאי B של קרום המוח מסופקים כל הזמן על ידי מח עצםהגולגולת 7. לאחרונה, מבנה חדש, המכונה יציאת השרוול הארכנואידית (ACE), זוהה כשער ישיר בין הדורה מאטר למוח לסחר בתאי מערכת החיסון8.
לממצאים מרגשים אלה יש השלכות חשובות על מקור החדירה של תאי מערכת החיסון למוח הפגוע (למשל, לאחר שבץ איסכמי). עדויות רבות מצביעות על כך שלאחר שבץ, תאי חיסון רבים חודרים למוח, מה שתורם הן לנזק מוחי חריף והן להתאוששות מוחית כרונית. הרעיון המקובל הוא שתאים אלה מזרימים לויקוציטים בדם החודרים למוח, מה שמתאפשר במידה רבה על ידי נזק למחסום הדם-מוח שנגרם כתוצאה משבץ. עם זאת, רעיון זה אותגר. במחקר אחד, תאי מערכת החיסון בגולגולת ובשוקה של עכברים תויגו באופן שונה, ולאחר 6 שעות לאחר שבץ נמצאה ירידה משמעותית גדולה יותר בנויטרופילים ומונוציטים בגולגולת לעומת . הטיביה, ונויטרופילים נוספים שמקורם בגולגולת היו נוכחים במוח האיסכמי. נתונים אלה מצביעים על כך שבשלב השבץ החריף, נויטרופילים במוח האיסכמי מקורם בעיקר במח עצםהגולגולת 4. מעניין, CSF עשוי להנחות הגירה זו. ואכן, שני דיווחים אחרונים הראו כי CSF יכול להעביר ישירות רמזי איתות מהמוח לתוך מח עצם הגולגולת דרך תעלות גולגולת, ולהורות נדידת תאים והמטופויזה במח עצם הגולגולת לאחר פגיעה במערכת העצבים המרכזית 9,10.
לאור ממצאים עדכניים אלה, נעשה חשוב לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון הן במוח והן במוח עצם הגולגולת, כאשר חוקרים את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות. בחקירות כאלה, יש צורך במספר מספיק של תאי חיסון באיכות גבוהה לניתוחים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ניתוח ציטומטריית זרימה וריצוף RNA חד-תאי (scRNA-seq). כאן, המטרה הכוללת היא להציג שני הליכים אופטימליים להכנת תרחיפים חד-תאיים מרקמת המוח ומח עצם הגולגולת. חשוב לציין כי הקלבריה (עצם קדמית, עצם עורפית ועצמות קודקודיות) של הגולגולת משמשות בדרך כלל לחילוץ מח עצם, ומח עצם זה מכונה באופן ספציפי מח עצם גולגולת במהלך מחקר זה.

<table><tbody><tr><td>0.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>76332-066</td><td></td></tr><tr><td>1.5 mL microcentrifuge tubes</td><td>VWR</td><td>76332-068</td><td></td></tr><tr><td>15 mL conical tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>18 G x 1 in BD PrecisionGlide Needle</td><td>BD Biosciences</td><td>305195</td><td></td></tr><tr><td>1x HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>50 mL conical tubes</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>339653</td><td></td></tr><tr><td>96-well V-bottom microplate&nbsp;</td><td>SARSTEDT</td><td>82.1583</td><td></td></tr><tr><td>AURORA&nbsp; flow cytometer</td><td>Cytek bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Fisher</td><td>BP9706-100</td><td></td></tr><tr><td>CD11b-AF594</td><td>BioLegend</td><td>101254</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD19-BV785</td><td>BioLegend</td><td>115543</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD19-FITC</td><td>BioLegend</td><td>115506</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD3-APC</td><td>BioLegend</td><td>100312</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD3-PE</td><td>BioLegend</td><td>100206</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD45-Alex 700</td><td>BioLegend</td><td>103128</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>CD45-BV421</td><td>Biolegend</td><td>103133</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Cell Strainer 70 um</td><td>Avantor</td><td>732-2758</td><td></td></tr><tr><td>Dressing Forceps&nbsp;</td><td>V. Mueller</td><td>NL1410</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Invitrogen</td><td>15575-038</td><td></td></tr><tr><td>Fc Block</td><td>Biolegend</td><td>101320</td><td>1:100 dilution</td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Roboz</td><td>RS-5047</td><td></td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Fixable Blue Dead Cell Stain Kit</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N7167</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Ly6G-BV421</td><td>BioLegend</td><td>127628</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Ly6G-PerCp-cy5.5</td><td>BioLegend</td><td>127615</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>NK1.1-APC-cy7</td><td>BioLegend</td><td>108723</td><td>1:500 dilution</td></tr><tr><td>Percoll (density gradient medium)</td><td>Cytiva</td><td>17089101</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffer saline (10x)</td><td>Gibco</td><td>70011-044</td><td></td></tr><tr><td>RBC Lysis Buffer (10x)</td><td>BioLegend</td><td>420302</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>SKLAR</td><td>64-1250</td><td></td></tr><tr><td>WHEATON Dounce Tissue, 15 mL Size</td><td>DWK Life Sciences</td><td>357544</td><td></td></tr></tbody></table>

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

Isolating Immune Cells from Mouse Brain and Skull

ראיות מצטברות מצביעות על כך שהתגובה החיסונית המופעלת על ידי הפרעות מוחיות (למשל, איסכמיה מוחית ואנצפלומיאליטיס אוטואימונית) מתרחשת לא רק במוח, אלא גם בגולגולת. צעד מפתח לקראת ניתוח שינויים באוכלוסיית תאי מערכת החיסון במוח ובמח עצם הגולגולת לאחר נזק מוחי (למשל, שבץ) הוא להשיג מספר מספיק של תאי חיסון איכותיים לניתוחים במורד הזרם. כאן, שני פרוטוקולים אופטימליים מסופקים לבידוד תאי מערכת החיסון מהמוח וממח עצם הגולגולת. היתרונות של שני הפרוטוקולים באים לידי ביטוי בפשטותם, במהירותם וביעילותם בהפקת כמות גדולה של תאי חיסון בני קיימא. תאים אלה עשויים להתאים למגוון יישומים במורד הזרם, כגון מיון תאים, ציטומטריית זרימה וניתוח תעתוק. כדי להדגים את יעילות הפרוטוקולים, בוצעו ניסויים אימונופנוטיפיים במוחות שבץ מוחי ובמח עצם גולגולת תקין באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה, והתוצאות תאמו את ממצאי המחקרים שפורסמו.

כדי להכין תאי חיסון מרקמת המוח של עכבר, הפרוטוקול בדרך כלל מניב תאים עם כדאיות גבוהה (84.1% ± 2.3% [ממוצע ± SD]). כ 70%-80% של תאים אלה הם CD45 חיובי. במוח עכבר רגיל, כמעט כל תאי CD45+ הם מיקרוגליה (CD45 CD11b נמוך +), כצפוי. פרוטוקול זה שימש במעבדה ליישומים שונים, כולל ניתוח ציטומטריית זרימה, מיון תאים המופעלים על ידי פלואורסצנטיות (FACS) וניתוח scRNA-seq. לדוגמה, ניתוח ציטומטריית זרימה נערך במודל שבץ מוחי (איור 3). עכברים עברו מודל שבץ חולף, 30 דקות נימה באמצע חסימת עורק מוחי אמצעי (MCAO)14. ביום השלישי לאחר שבץ, תאים הוכנו ממוחות עכברים ונצבעו בסמנים נפוצים של תאי מערכת החיסון. אסטרטגיית הגאטינג מתוארת באיור 3A. בהתאם למחקר קודם13,15, נצפתה עלייה ניכרת בתאי CD45High בהמיספרה האיפסילטרלית (איור 3B,C), מה שמצביע על חדירה של תא החיסון למוח.
עבור פרוטוקול מח עצם הגולגולת, תפוקה משמעותית של תאי מח עצם גולגולת (סביב 2 x 106 תאים) הושגה באופן עקבי עם כדאיות מצוינת (93.8% ± 1.8% [ממוצע ± SD]). כצפוי, רוב התאים האלה הם CD45 חיובי. כדי להמחיש את התועלת של פרוטוקול זה, בוצע מחקר השוואתי כדי לאפיין את הרכב תאי החיסון הן בעצם הירך והן במח עצם הגולגולת של עכברים תמימים (איור 4). כפי שמתואר בחלקות המייצגות, הרכב תאי מערכת החיסון היה דומה בין עצם הירך למח עצם הגולגולת (איור 4A,B). באופן מעניין, נראה שתדירות הנויטרופילים גבוהה יותר בעצם הירך מאשר בעצם הגולגולת (איור 4C). עם זאת, ממצא זה דורש אימות נוסף, מכיוון שגודל המדגם היה קטן עבור מחקר פיילוט זה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig01.jpg"> איור 1: סקירה כללית של פרוטוקול בידוד תאי המוח. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig02.jpg"> איור 2: פרוטוקול בידוד תאי מח עצם בגולגולת. (A) סקירה כללית של ההליך. (B) התבנית המומלצת לחיתוך גולגולת. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig03.jpg"> איור 3: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת של תאי מערכת החיסון במוח השבץ. (A) דוגמה לאסטרטגיית ה-gating. החלקות מתארות את אוכלוסיות תאי החיסון הבאות: מיקרוגליה (CD45 CD11b נמוך+), תאי NK (CD45HighNK1.1+), נויטרופילים (CD45HighLy6G+), תאי T (CD45HighCD11b-CD3+) ותאי B (CD45HighCD11b-CD19+). דוגמה זו מייצגת ניתוח של תאי מערכת החיסון במוח בהמיספרה האיפסילטרלית ביום השלישי לאחר שבץ. (ב,ג) החדרת תאי מערכת החיסון למוח השבץ. עכברים זכרים צעירים היו נתונים לחסימת עורק מוחי אמצעי חולף (MCAO). ביום השלישי נאספו המוחות ופוצלו להמיספרה השמאלית (קונטרה-לטרלית) והימנית (איפסילטרלית). תאי המוח הוכנו על פי הפרוטוקול המתואר ולאחר מכן עברו ניתוח ציטומטריה של זרימה. חלקות מייצגות מדגימות חדירה מוגברת של תאי מערכת החיסון לחצי הכדור האיפסילטרלי (CD45High cells; ב). נתונים כמותיים מוצגים בגרפים של העמודות (C). מספרי התאים חושבו בהתבסס על ספירת התאים והנפח שנרשמו בנתוני ציטומטריית הזרימה. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66861/66861fig04.jpg"> איור 4: ניתוח ציטומטריית זרימה מייצגת של תאי מח עצם בגולגולת. לשם השוואה, נכלל ניתוח של תאי מח עצם מעצם הירך. החלקות מתארות את אוכלוסיות תאי החיסון הבאות: תאי NK (CD45++NK1.1+), נויטרופילים (CD45+CD11b+Ly6G+), תאי T (CD45+CD11b-CD3+) ותאי B (CD45+CD11b-CD19+). (A) חלקות מייצגות למח עצם הירך. (B) חלקות מייצגות למח עצם הגולגולת. (C) השוואה של הרכב תאי החיסון בין עצם הירך למח עצם הגולגולת. הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM. *p < 0.05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66861/66861fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

כדי לחקור את התגובה החיסונית להפרעות מוחיות, גישה נפוצה אחת היא לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון. כאן, שני פרוטוקולים פשוטים ויעילים ניתנים לבידוד תאי מערכת החיסון מרקמת המוח וממח עצם הגולגולת.

Mounting evidence indicates that the immune response triggered by brain disorders (e.g., brain ischemia and autoimmune encephalomyelitis) occurs not only ...

המחקר שלנו מתמקד בתגובה החיסונית המורכבת בעקבות איסכמיה מוחית הנגרמת על ידי שבץ איסכמי ודום לב. איסכמיה מוחית מעוררת את הפעלת תאי החיסון במוח ואת חדירת תאי מערכת החיסון. עם זאת, ההבנה שלנו של תאי חיסון אלה נותרה מוגבלת.אנו שואפים לנתח את המצב החיסוני, המקור והתפקידים התפקודיים של תאי המוח האלה לאחר איסכמיה. מחקר שנערך לאחרונה מדגיש את התפקיד המפתיע של הגולגולת בתגובה החיסונית של המוח לאחר פציעה. לכן, חשוב לנתח שינויים בתאי מערכת החיסון הן ברקמת המוח והן במח עצם הגולגולת לאחר איסכמיה מוחית.לשם כך, צעד קריטי הוא להשיג מספר מספיק של תאי חיסון באיכות גבוהה לניתוח נוסף. הפרוטוקולים שלנו מאפשרים לחוקרים להשיג במהירות כמויות גדולות של תאי חיסון זמינים מהמוח וממח עצם הגולגולת. פרוטוקול תאי החיסון במוח משתמש בגישת דיסוציאציה מכנית בטמפרטורה נמוכה לכל אורכו, ומבטיח שימור טוב יותר של פרופילי השעתוק והפרוטאומיקה.פרוטוקול מח עצם הגולגולת הוא פשוט, אך יעיל לחילוץ תאי מח עצם מהגולגולת. נמשיך במחקר המקיף שלנו על ההשפעה של איסכמיה מוחית על תאי מערכת החיסון ברקמת המוח ובגולגולת. בהתחשב בכך שדלקת עצבית ממלאת תפקיד מפתח בפתופיזיולוגיה של פגיעה מוחית לאחר איסכמיה, המחקר שלנו צפוי לגלות מטרות טיפוליות חדשות להגנה על המוח לאחר שבץ איסכמי או דום לב.

isolating-immune-cells-from-mouse-brain-and-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בסרטון זה אנו מבצעים בידוד של תאים חד-גרעיניים ממוחו של עכבר באמצעות צנטריפוגה הדרגתית של צפיפות. תרחיף התא החד-גרעיני המבודד יכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם.

בידוד תאים חד-גרעיניים ממוח עכבר: טכניקת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות לבידוד תאים חד-גרעיניים שוכני מוח

הסרטון מדגים טכניקה לבידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר. ראשית, קליפת המוח עוברת סגמנטציה והומוגניזציה כדי להסיר תאי עצב ותאי גלייה אחרים, תוך שמירה על תאי מיקרוגליה. לאחר מכן, תרחיף התא נחשף למיקרו-כדוריות מגנטיות אנטי-מיאלין ולשדה מגנטי, המפריד ביעילות תאי מיקרוגליה ומיאלואיד מפסולת המיאלין ותאים המכילים מיאלין.

בידוד תאי מיקרוגליה מקליפת המוח של מוח עכבר בוגר

הסרטון מדגים בידוד של תאי דם חד-גרעיניים היקפיים חודרי גידול ממוח עכבר באמצעות דיסוציאציה מכנית ועיכול אנזימטי. זה ואחריו צפיפות הדרגתית צנטריפוגה לאסוף את התאים החיסונית לניתוח נוסף.

בידוד תאי חיסון חודרי גידול ממוח מוריני

הסרטון מדגים הכנה של תרחיף חד-תאי של תאי חיסון מרקמת מוח מורינה. זה כרוך בעיכול אנזימטי כדי לשחרר תאים מרקמת המוח, ואחריו צנטריפוגה הדרגתית צפיפות כדי לבודד את תאי החיסון על בסיס הצפיפות שלהם כדי לקבל את ההשעיה של תא יחיד.

הכנת תרחיף חד-תאי של תאי מערכת החיסון מרקמת המוח המורין

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים במוח (BMEC) מחוברים זה לזה על ידי חלבוני צומת ספציפיים היוצרים מחסום מווסת מאוד המפריד בין הדם למערכת העצבים המרכזית (CNS), מה שנקרא מחסום דם-מוח (BBB). הבידוד של תאי אנדותל מיקרו-וסקולריים ראשוניים במוח העכברים, כפי שנדון בפרוטוקול זה, מאפשר מחקרי מבחנה מפורטים של BBB.

בידוד של תאים הראשוניים Murine מוח כלי הדם האנדותל

דלקת ממלאת תפקיד מרכזי בפתוגנזה של שבץ איסכמי. עדויות הולכות וגדלות מצביעות על כך שהוא פועל כחרב פיפיות המחמירה פגיעה מוחית מוקדמת, אך גם תורמת לתיקון מאוחר יותר. פרוטוקול זה מתאר את הבידוד של תאי חיסון מהמוח האיסכמי ואת הפנוטיפ הציטומטרי הזרימה שלהם לאחר מכן.

בידוד תזרים Cytometric ניתוח של תאים חיסוניים ממוח עכבר איסכמי

אנו מספקים פרוטוקול עבור בידוד של מיקרוגלייה מאזורים בגזור שונים של המוח העכבר באמצע המחצית, ואחריו הכנה חצי אוטומטי הספריה לרצף העמוק של RNA תא בודד של טרנססקריפט באורך מלא. שיטה זו תסייע להבהיר טרוגניות תפקודית של מיקרוגלייה בריאות ומחלות.

בידוד של אזור-מיקרוגליה ספציפי מתוך חצי הכדור השני של המוח העכבר עבור רצפי RNA של תא יחיד בודד

מאמר זה מציג שני פרוטוקולים אופטימליים לבחינת תאי חיסון חיים ופריפריאליים במערכת העצבים המרכזית, כולל המוח, חוט השדרה וקרומי המוח. כל אחד מהפרוטוקולים הללו מסייע לוודא את תפקודם והרכבם של התאים המאכלסים תאים אלה בתנאים יציבים ודלקתיים.

בידוד רקמות מערכת העצבים המרכזית וקרומי המוח הקשורים לניתוח במורד הזרם של תאי מערכת החיסון

נכון להיום, פרוטוקולים לבידוד סימולטני של כל סוגי התאים העיקריים השוכנים במערכת העצבים המרכזית מאותו עכבר הם דרישה שלא נענתה. הפרוטוקול מראה הליך ישים בעכברים אוטואימוניים נאיביים וניסיוניים של אנצפלומיאליטיס לחקור רשתות סלולריות מורכבות במהלך דלקת עצבית ובו זמנית להפחית את מספר העכברים הנדרש.

בידוד סימולטני של סוגי תאים עיקריים תושבי מערכת העצבים המרכזית מעכברים אוטואימוניים בוגרים

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

למדו לבודד תאי מערכת חיסון ממוח ומוח עצם של עכבר לאחר איסכמיה מוחית. שיטות אלו שומרות על פרופילים תרשימיים ופרוטאומיים לחקר תגובות חיסון ומציאת מטרות טיפוליות חדשות.

בידוד תאי מערכת החיסון מהמוח והגולגולת של עכבר

גלה סרטונים נוספים