Name: בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-10-11T13:10:00.000+00:00
Duration: 9 min 9 s
Description: למד שיטת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים בין הרשתית האנדופלסמית למיטוכונדריה בתאי HEK293T חיים. שיטה זו מאפשרת מחקר מתקדם בתקשורת בין אברונים ומחלות נוירודגנרטיביות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקה פשוטה למדידת מגעי ER-מיטוכונדריה עבור מסכים בעלי תפוקה גבוהה

<ol><li>Aoyama-Ishiwatari, S., Hirabayashi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites-emerging+intracellular+signaling+hubs%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites-emerging intracellular signaling hubs.</a> Front Cell Dev Biol. 9, 653828(2021).</li>
<li>Sassano, M. L., Felipe-Abrio, B., Agostinis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites%3B+a+multifaceted+factory+for+Ca2%2B+signaling+and+lipid+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites; a multifaceted factory for Ca2+ signaling and lipid transport.</a> Front Cell Dev Biol. 10, 988014(2022).</li>
<li>Scorrano, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coming+together+to+define+membrane+contact+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Coming together to define membrane contact sites.</a> Nat Commun. 10 (1), 1287(2019).</li>
<li>Voeltz, G. K., Sawyer, E. M., Hajnóczky, G., Prinz, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+the+connection%3A+How+membrane+contact+sites+have+changed+our+view+of+organelle+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Making the connection: How membrane contact sites have changed our view of organelle biology.</a> Cell. 187 (2), 257-270 (2024).</li>
<li>Paillusson, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((There%27s+something+wrong+with+my+MAM%3B+the+ER-mitochondria+axis+and+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">There's something wrong with my MAM; the ER-mitochondria axis and neurodegenerative diseases.</a> Trends Neurosci. 39 (3), 146-157 (2016).</li>
<li>Sasi, U. S. S., Sindhu, G., Raj, P. S., Raghu, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+associated+membranes+%28MAMs%29%3A+emerging+drug+targets+for+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Mitochondria associated membranes (MAMs): emerging drug targets for diabetes.</a> Curr Med Chem. 27 (20), 3362-3385 (2019).</li>
<li>Joshi, A. U., Kornfeld, O. S., Mochly-Rosen, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+entangled+ER-mitochondrial+axis+as+a+potential+therapeutic+strategy+in+neurodegeneration%3A+A+tangled+duo+unchained%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">The entangled ER-mitochondrial axis as a potential therapeutic strategy in neurodegeneration: A tangled duo unchained.</a> Cell Calcium. 60 (3), 218-234 (2016).</li>
<li>Moltedo, O., Remondelli, P., Amodio, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondria-endoplasmic+reticulum+contacts+and+their+critical+role+in+aging+and+age-associated+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">The mitochondria-endoplasmic reticulum contacts and their critical role in aging and age-associated diseases.</a> Front Cell Dev Biol. 7, 172(2019).</li>
<li>Rieusset, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+endoplasmic+reticulum-mitochondria+contact+sites+in+the+control+of+glucose+homeostasis%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Dis%22%5BJournal%5D)">The role of endoplasmic reticulum-mitochondria contact sites in the control of glucose homeostasis: an update.</a> Cell Death Dis. 9 (3), 388(2018).</li>
<li>Bouguerra, M. D., Lalli, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+interactions%3A+Both+strength+and+weakness+within+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria interactions: Both strength and weakness within cancer cells.</a> Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1866 (4), 650-662 (2019).</li>
<li>Tepikin, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+junctions+with+cellular+organelles%3A+Ca2%2B+signalling+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Pfl%C3%BCgers+Arch%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial junctions with cellular organelles: Ca2+ signalling perspective.</a> Pflügers Arch. 470 (8), 1181-1192 (2018).</li>
<li>Masson, G. L., Przedborski, S., Abbott, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+computational+model+of+motor+neuron+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">A computational model of motor neuron degeneration.</a> Neuron. 83 (4), 975-988 (2014).</li>
<li>Giamogante, F., Barazzuol, L., Brini, M., Calì, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ER-mitochondria+contact+sites+reporters%3A+strengths+and+weaknesses+of+the+available+approaches%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">ER-mitochondria contact sites reporters: strengths and weaknesses of the available approaches.</a> Int J Mol Sci. 21 (21), 8157(2020).</li>
<li>Rizzuto, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Close+contacts+with+the+endoplasmic+reticulum+as+determinants+of+mitochondrial+Ca2%2B+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Close contacts with the endoplasmic reticulum as determinants of mitochondrial Ca2+ responses.</a> Science. 280 (5370), 1763-1766 (1998).</li>
<li>Valm, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Applying+systems-level+spectral+imaging+and+analysis+to+reveal+the+organelle+interactome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Applying systems-level spectral imaging and analysis to reveal the organelle interactome.</a> Nature. 546 (7656), 162-167 (2017).</li>
<li>Csordás, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+interorganelle+contacts+and+local+calcium+dynamics+at+the+ER-mitochondrial+interface%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Imaging interorganelle contacts and local calcium dynamics at the ER-mitochondrial interface.</a> Mol Cell. 39 (1), 121-132 (2010).</li>
<li>Cieri, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SPLICS%3A+a+split+green+fluorescent+protein-based+contact+site+sensor+for+narrow+and+wide+heterotypic+organelle+juxtaposition%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">SPLICS: a split green fluorescent protein-based contact site sensor for narrow and wide heterotypic organelle juxtaposition.</a> Cell Death Differ. 25 (6), 1131-1145 (2018).</li>
<li>Kakimoto, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+multiple+inter-organelle+contact+sites+using+the+organelle-+targeted+split-GFP+system%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Visualizing multiple inter-organelle contact sites using the organelle- targeted split-GFP system.</a> Sci Rep. 8 (1), 6175(2018).</li>
<li>Wu, M. M., Covington, E. D., Lewis, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+analysis+of+diffusion+and+trapping+of+STIM1+and+Orai1+at+ER-plasma+membrane+junctions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-molecule analysis of diffusion and trapping of STIM1 and Orai1 at ER-plasma membrane junctions.</a> Mol Biol Cell. 25 (22), Mac.E14-06-1107 (2014).</li>
<li>Csordas, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+and+functional+features+and+significance+of+the+physical+linkage+between+ER+and+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural and functional features and significance of the physical linkage between ER and mitochondria.</a> J Cell Biol. 174 (7), 915-921 (2006).</li>
<li>de Brito, O. M., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitofusin+2+tethers+endoplasmic+reticulum+to+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria.</a> Nature. 456 (7222), 605-610 (2008).</li>
<li>Kremer, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developing+3D+SEM+in+a+broad+biological+context%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Developing 3D SEM in a broad biological context.</a> J Microsc. 259 (2), 80-96 (2015).</li>
<li>Söderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nat Methods. 3 (12), 995-1000 (2006).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Rennke, H. G., Cho, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%CE%B22-adrenergic+receptor+regulates+ER-mitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">β2-adrenergic receptor regulates ER-mitochondria contacts.</a> Sci Rep. 11 (1), 21477(2021).</li>
<li>Lam, S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+evolution+of+APEX2+for+electron+microscopy+and+proximity+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Directed evolution of APEX2 for electron microscopy and proximity labeling.</a> Nat Methods. 12 (1), 51-54 (2014).</li>
<li>Cho, I. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ascorbate+peroxidase+proximity+labeling+coupled+with+biochemical+fractionation+identifies+promoters+of+endoplasmic+reticulum-mitochondrial+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Ascorbate peroxidase proximity labeling coupled with biochemical fractionation identifies promoters of endoplasmic reticulum-mitochondrial contacts.</a> J Biol Chem. 292 (39), 16382-16392 (2017).</li>
<li>Lim, Y., Cho, I. -T., Schoel, L. J., Cho, G., Golden, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hereditary+spastic+paraplegia-linked+REEP1+modulates+endoplasmic+reticulum%2Fmitochondria+contacts%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Hereditary spastic paraplegia-linked REEP1 modulates endoplasmic reticulum/mitochondria contacts.</a> Ann Neurol. 78 (5), 679-696 (2015).</li>
<li>Arnold, T. R., Stephenson, R. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+GTPases+and+actomyosin%3A+Partners+in+regulating+epithelial+cell-cell+junction+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Rho GTPases and actomyosin: Partners in regulating epithelial cell-cell junction structure and function.</a> Exp Cell Res. 358 (1), 20-30 (2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.7 מ"ל צינור מיקרוצנטריפוגה SafeSeal</td><td>Sorenson</td><td>16070</td><td></td></tr><tr><td>צלחת 6 בארות TC מטופל</td><td>ארה"ב Scientific</td><td>CC7682-7506</td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל טיפים לפיפטה OneTip</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>10 &mu; טיפים לפיפטה L OneTip</td><td>ארה"ב מדעי</td><td>1110-3700</td><td></td></tr><tr><td>20-200 &mu; L טיפים משופעים OneTip</td><td>ארה"ב סיינטיפיק</td><td>1111-1210</td><td></td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור חרוטי פוליפרופילן</td><td>פלקון</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות סנפיר מדפי מיקרו-צינורות</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8770-11</td><td></td></tr><tr><td>96 בארות צלחת TC מטופל&nbsp;</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-7596</td><td></td></tr><tr><td>100 מ"מ x 20 מ"מ TC צלחת מטופלת</td><td>USA Scientific</td><td>CC7682-3394</td><td></td></tr><tr><td>1250 &mu; L טיפים OneTip</td><td>USA Scientific</td><td>1112-1720</td><td></td></tr><tr><td>צנטריפוגה 5910&nbsp; Ri - צנטריפוגה בקירור</td><td>Eppendorf</td><td>5943000131</td><td></td></tr><tr><td>דימתיל סולפוקסיד, נטול מים, &ge; 99.9%</td> <td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>276855-100 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DPBS, ללא סידן, ללא מגנזיום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>EHop 016</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>6248</td><td>מתמוסס ב-DMSO; יש לאחסן בטמפרטורה של -70 מעלות; C</td></tr><tr><td>EnduRen מצע תא חי</td><td>Promega</td><td>E6481</td><td>אחסן במחירים של -70 מעלות; C</td></tr><tr><td>Eppendorf 2-20 &mu; L פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>3123000039</td><td></td></tr><tr><td>מחקר אפנדורף פלוס 100-1000 &mu; L פיפטה</td><td>Eppendorf</td><td>3123000063</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research Plus 1-10 ומיקרו; L pipette</td><td>Eppendorf</td><td>3123000020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research בתוספת 12 ערוצים</td><td>Eppendorf</td><td>3125000028</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Research plus 200 &mu; L פיפטה</td><td>אפנדורף&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3123000055 סרום בקר עוברי, אזורים מוסמכים ומאושרים על ידי USDA</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10437028</td><td></td></tr><tr><td>Forma Steri-Cycle CO2&nbsp; חממה, 184 ליטר, נירוסטה מלוטשת</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>381</td><td></td></tr><tr><td>מונה ידיים</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>HS6594</td><td></td></tr><tr><td>HEK 293T Cells</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer - Neubauer Bright Line, תא ספירה כפולה</td><td>LW Scientific</td><td>CTL-HEMM-GLDR</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen TE Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>8019005</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>Zeiss</td><td>Axiovert 25 CFL</td><td></td></tr><tr><td>מיני צנטריפוגה</td><td>בנצ'מרק מדעי</td><td>C1012</td><td></td></tr><tr><td>מתלה רב צינורות עבור 50 מ"ל צינורות חרוטי, 15 מ"ל חרוטי ומיקרוצנטריפוגה</td><td>Boekel Scientific</td><td>120008</td><td></td></tr><tr><td>PEI MAX - Transfection כיתה ליניארי פוליאתילנימין הידרוכלוריד (MW 40,000)</td> <td>Polysciences</td><td>24765-100MG</td><td></td></tr><tr><td>Pipet-Aid XP</td><td>USA Scientific</td><td>4440-0101</td><td></td></tr><tr><td>פולי-D-ליזין הידרוברומיד</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>P6407-5MG</td><td></td></tr><tr><td>רוזין הידרוכלוריד</td><td>ביו-טקן טוקריס</td><td>5003</td><td>מתמוסס ב-DMSO; יש לאחסן בטמפרטורה של -70 מעלות; C</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan LUX קורא מיקרו-פלטות מולטי-מוד</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>VL0000D0</td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>2215365</td><td>רמה 8</td></tr><tr><td>VWR מערכת שאיבת ואקום</td><td>VWR</td><td>75870-734</td><td></td></tr><tr><td>ZCL 278</td><td>Bio-Techne Tocris</td><td>4794</td><td>יש להמיס ב-DMSO; יש לאחסן בטמפרטורה של -70 מעלות; ג</td></tr></tbody></table>

בדיקת הרכבה מחדש של split-luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

Split-Luciferase Reassembly Assay to Measure Endoplasmic Reticulum-Mitochondria Contacts in Live Cells

השתמשנו בפרוטוקול שתואר לעיל כדי למדוד את רמת המגעים של ER-מיטוכונדריה עם הוספת שלוש תרכובות הידועות כמעכבות GTPases ספציפיים. CDC42, RHO ו-RAC הם GTPases המקדמים פילמור אקטין28 כאשר הם מופעלים ומעוכבים על ידי ZCL278, Rhosin ו-Ehop-016, בהתאמה24. HEK293T תאים שהודבקו ב-split-Rluc טופלו ב-DMSO (בקרה), ZCL278 (50 מיקרומטר), רוסין (50 מיקרומטר) או Ehop-016 (25 מיקרומטר) והודגרו במשך שעה, שעתיים ו-5 שעות. באמצעות קורא לוחות מדדנו את פעילות ה-split-R luc בנקודות זמן מוגדרות (איור 2).
תאים שטופלו ברוסין (מעכב RHO GTPase) לא הראו שינויים משמעותיים בפעילות הלוציפראז בהשוואה לתאי הבקרה שטופלו ב-DMSO לאחר שעה, שעתיים ו-5 שעות של הטיפול (p &gt; 0.9999, p= 0.6956, p &gt; 0.9999) (איור 2). תוצאות אלה מראות כי רוסין אינו משפיע על מגעי ER-מיטוכונדריה, דבר המצביע על כך שאין מעורבות של פעילות RHO GTPase בוויסות המגעים בין שני האברונים.
לעומת זאת, מעכב RAC GTPase Ehop-016 הראה פעילות לוציפראז נמוכה משמעותית מאשר DMSO בשעה, שעתיים ו-5 שעות של הטיפול (p = 0.0106, p = 0.0009, p = 0.0024) (איור 2). נתונים אלה מצביעים על כך שפעילות RAC GTPase נדרשת לשמירה על אינטראקציה תקינה של ER-מיטוכונדריה בתא.
לבסוף, מעכב CDC42 ZCL278 הראה את השינויים הדרסטיים ביותר בפעילות לוציפראז (איור 2). תאים שטופלו ב-ZCL278 הראו ירידה משמעותית בפעילות הלוציפראז בהשוואה לקבוצת הביקורת DMSO והיו בעלי ערכי ה-p הנמוכים ביותר בכל שלוש נקודות הזמן, תוך שמירה על p &lt;-0.0001 לאורך כל הדרך. הנתונים שלנו מראים עיכוב חזק של צימוד ER-מיטוכונדריה כאשר פעילות CDC42 GTPase חסומה על ידי ZCL278, בהתאם לדוח הקודם שלנו באמצעות בדיקת split-Rluc המקורית שבוצעה בתאים הנגועים יחד עם שני וקטורים המקודדים כל מחצית של לוציפראז מפוצלבנפרד 24.
בהתחשב בתוצאות המרשימות עם ZCL278, במיוחד בהשוואה למעכבי GTPase אחרים, פעילות ZCL278 נבדקה עוד יותר בריכוזים שונים [0.5 מיקרומטר, 5 מיקרומטר, 50 מיקרומטר] מול בקרת DMSO. פעילויות לוציפראז שנמדדו ב -1 שעות, 2 שעות ו -5 שעות לאחר הטיפול הראו תגובה תלוית מינון; 0.5 מיקרומטר של ZCL278 הביא להשפעה החלשה ביותר על פעילות לוציפראז, בעוד ש-5 מיקרומטר הראו השפעה חזקה יותר, ו-50 מיקרומטר הראו את הירידה החזקה ביותר בפעילות האנזים המשוחזר (איור 3). יחד, התוצאות שלנו מראות כי ZCL278 מפחית את פעילות ה-split-R luc באופן תלוי מינון, וככל שהזמן מתקדם, ריכוזים גבוהים יותר של ZCL278 (מעכב CDC42) עדיין מראים שינוי משמעותי ביחס ל-DMSO הבקרה בהשוואה לריכוזים נמוכים יותר.
כדרך לאמת את בדיקת ה-split-Rluc שלנו, ניתן לבצע בדיקות עצמאיות מבוססות היטב, כגון בדיקת קשירת קרבה (PLA), מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM) וניטור ספיגת סידן מיטוכונדריאלי (איור 4 ונתונים שאינם מוצגים)24. איזופרוטרנול, אגוניסט לקולטן אדרנרגי β2, שהוא אחת התרכובות שזוהו במסך שלנו עבור מקדמי מגע עם ER-מיטוכונדריה (איור 4A), שימש כדי לאשר שפעילות הלוציפראז של ה-split-R luc לאחר הטיפול באיזופרוטרנול הוגברה עקב מגעים משופרים של ER-מיטוכונדריה, כפי שהודגם על-ידי שינויים בעוצמת אות PLA כמו גם ספיגת סידן מיטוכונדריאלי (איור 4B-E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig01.jpg"> איור 1: מבחן ההרכבה מחדש של Split-R luc. (A) ייצוג סכמטי של מבחן Split-R Luc. כאשר אין מגעים בין המיטוכונדריה לבין הרשתית האנדופלסמית, המיטו-R lucN וה-RlucC-ER אינם מתקשרים ולכן אין פעילות Rluc8. עם זאת, אינטראקציה בין Mito-R lucN ו- RlucC-ER, שבה ה- ER וקרומי המיטוכונדריה באים במגע, גורמת לפעילות אנזימטית מלאה, אשר מזוהה על ידי המרת המצע ללומינסנציה. (B) מפה סכמטית של מבנה הדנ"א המפוצל Rluc (pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry). (C) דיאגרמה של זרימת עבודה עבור בדיקת split-Rluc בתאי HEK293T. קיצורים: מיטו = מיטוכונדריה; ER = רשתית אנדופלסמית; IRES, אתר כניסה ריבוזומלי פנימי; rb_glob pA, ארנב בטא-גלובין פולי adenylation אות; T2A, רצף פפטידי 2A החותך את עצמו מנגיף Thosea asigna. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig02.jpg"> איור 2: פעילויות לוק מפוצלות Rהמתאימות לרמות המגעים של ER-Mito בתאים שטופלו במעכבי GTPase. (A-C) פעילויות לוציפראז משוחזרות ב-(A) 1 שעות, (B) 2 שעות, או (C) 5 שעות לאחר DMSO (בקרה), Rhosin [50 μM], Ehop-016 [25 μM], או ZCL278 [50 μM] טיפול (n = 12 עבור כל קבוצה). כל הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות. ערכי P מדווחים כ- p &gt; 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****). קווי שגיאה מציינים ממוצע ± שגיאת תקן של מדידה. קיצורים: מיטו = מיטוכונדריה; ER = רשתית אנדופלסמית; RLU = יחידת אור יחסית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig03.jpg"> איור 3: פעילויות ה-split-R luc המודדות את רמות המגעים של ER-Mito בתאים שטופלו ב-ZCL278. (א-ג) פעילויות לוציפראז משוחזרות בריכוז (A) 1 h, (B) 2 שעות או (C) 5 שעות לאחר DMSO (בקרה) או ZCL278 בריכוז [0.5 μM], [5 μM], או [50 μM] (n = 12 לכל קבוצה). כל הנתונים נותחו באמצעות ANOVA חד-כיווני עם השוואות מרובות. ערכי P מדווחים כ- p &gt; 0.05 (ns), p ≤ 0.05 (*), p ≤ 0.01 (**), p ≤ 0.001 (***), p ≤ 0.0001 (****). קווי שגיאה מציינים ממוצע ± שגיאת תקן של מדידה. קיצורים: מיטו = מיטוכונדריה; ER = רשתית אנדופלסמית; RLU = יחידת אור יחסית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66862/66862fig04.jpg"> איור 4: אימות של בדיקת לוק מפוצלת-R. (A) דוגמה לכימות של פעילות split-Rluc לאחר טיפול בתאי HEK293T עם 11 תרופות, כולל איזופרוטרנול, שזוהו במסך מורכב עבור מקדמי מגע ER-מיטוכונדריה. (B) דוגמה לבדיקת קשירת קרבה בתאי HeLa שטופלו ב-DMSO או באיזופרוטרנול (1 מיקרומטר). אות PLA (אדום) מציין מגע קרוב בין ER למיטו. Sec61-GFP (ירוק): כדי לתייג ER; DAPI (כחול): גרעין. (C) כימות אות PLA ב-A (n = 4 ניסויים עם 77-97 תאים כל אחד; מבחן מאן-ויטני). (D) ספיגת סידן מיטוכונדריאלי בתגובה להיסטמין (100 מיקרומטר). שינוי בעוצמה הפלואורסצנטית של Mito-R-GECO1 (הממוצע נלקח על פני מספר תאי HeLa) התווה כל 2.5 שניות בתאים שטופלו ב-DMSO או באיזופרוטרנול. חץ מציין תוספת היסטמין. (E) משמאל: שיא ספיגת הסידן המיטוכונדריאלי ב-A. מבחן t דו-זנבי לא מזווג (n = 10, DMOS; 14, איזופרוטרנול). מימין: קצב ספיגת הסידן במיטוכונדריה (כמו ב-A; 7.5 עד 12.5 שניות). מבחן מאן-ויטני (n = 12, DMSO; 11, איזופרוטרנול). נתון זה שונה מ Lim et al.24. קיצורים: RLU = יחידת אור יחסית; PLA = בדיקת קשירת קרבה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: סיכום הטכניקות הנוכחיות למגעים עם ER-מיטוכונדריה. רשימת יתרונות ומגבלות לכל שיטה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R2_updated_Table1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: קובץ zip המכיל רצף DNA (פורמטים PDF ו- GBK) של pCAG-MitoRluc N-T2A-R lucCER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_R3_plasmidDNAsequence.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S1: מפה של pCAG-MitoRluc N-T2A-R luc CER-IRES-mCherry. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66862/66862_Supplemental%20Figure%201_PlasmidMap_PrimerSequence_.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

Endoplasmic reticulum (ER)-mitochondria contact sites play a critical role in cell health and homeostasis, such as the regulation of Ca2+ and lipid ...

split-luciferase-reassembly-assay-to-measure-endoplasmic-reticulum

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן אנו מתארים נהלים לחקר שינויים בביטוי גנים phagocytosis המושרה עם גישה בלוציפראז מבוסס כתב הגן באמצעות מערכת כפולה GloTM Assay בלוציפראז מ Promega.

לימוד biogenesis ממברנה עם Assay בלוציפראז מבוסס Gene כתב

סרטון זה מדגים את בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת כדי לזהות אינטראקציות חלבון-חלבון. בבדיקה זו, החלבונים המעניינים מתויגים למקטעים קטנים וגדולים של האנזים לוציפראז. כאשר החלבונים מתקשרים, המקטעים הגדולים והקטנים משתלבים ליצירת קומפלקס אנזימים פעיל, אשר בנוכחות מצע מסוים, משחרר זוהר בהיר שניתן למדוד.

בדיקת השלמת לוציפראז מפוצלת לזיהוי אינטראקציות חלבון-חלבון ספציפיות

השגת הבנה ברמת מערכות של תהליכים תאיים היא מטרה של ביולוגיה של התא המודרנית. אנו מתארים כאן אסטרטגיות לכתבי לוציפראז ריבוב של תפקוד תאי שונים נקודות קצה לחקור את תפקוד גן באמצעות הגנום בקנה מידה ספריות RNAi.

פלטפורמת הקרנה מבוססת לוציפראז Multiplexed לחקירת מלחמה בסרטן הקשורים להעברת אותות בתאים בתרבית

מאמר זה מתאר את השימוש בחלבון היתוך לוציפראז-GFP גחלילית...

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

אנו מתארים את גישות ההדמיה אנו משתמשים כדי לחקור את ההפצה וניידות של חלבוני ניאון transfected תושב בreticulum endoplasmic (ER) באמצעות confocal ההדמיה של תאי חיים. אנחנו גם ultrastructurally לנתח את ההשפעה של הביטוי שלהם על הארכיטקטורה של תא subcellular זה.

ויזואליזציה של תחומי משנה reticulum endoplasmic בתאים בתרבית

אינטראקציות בין החלבונים הן יסוד לכל התהליכים התאיים. באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה, את האינטראקציה בין זוג החלבונים יכולה להיות במעקב בתאים חיים ובזמן אמת. יתר על כן, ההשפעות של מוטציות שעלולים להיות פתוגניים ניתן להעריך.

חוקר חלבונים אינטראקציות בתאים חיים באמצעות העברת פליטת אור התהודה אנרגיה

כאן, אנו מתארים הליך לחזות ולכמת עם רגישות גבוהה האינטראקציות אנדוגני בין הרטיקולום ואת המיטוכונדריה endoplasmic בתאים קבוע. הפרוטוקול כולל אופטימיזציה assay קשירת הקרבה באתרו מיקוד אינוסיטול 1,4,5-אדנוזין קולטן / גלוקוז מוסדר חלבון 75 / ערוץ אניון תלוי מתח / cyclophilin D מורכבים על ממשק הקרום קשור המיטוכונדריה.

לחקר endoplasmic reticulum ואת המיטוכונדריה אינטראקציות על ידי<em&gt; באתרו</em&gt; Assay קשירת הסמיכות בתאים קבועים

הפרוטוקול המוצג כאן נועד להדגים את התרחשותן של אינטראקציות הטרולוגיות בין חלבוני קרום מסוג III מסוג גולגי עם N- ו / או C-termini שנחשפו באופן ציטופלזמי בתאי יונקים חיים באמצעות הגרסה העדכנית ביותר של בדיקת המשלים לוציפראז מפוצלת.

הדגמה של קומפלקסים הטרולוגיים שנוצרו על ידי חלבוני קרום מסוג III של תושב גולגי באמצעות בדיקת השלמה פיצול לוציפראז

הצורך בגישות חדשות לחקר אתרי מגע עם ממברנות (MCS) גדל עקב העניין הגובר בחקר מבנים תאיים אלה ומרכיביהם. כאן, אנו מציגים פרוטוקול המשלב טכנולוגיות מיקרוסקופיה שהיו זמינות בעבר כדי לזהות ולכמת קומפלקסים של חלבונים תוך-אברונים ובין אברונים השוכנים ב-MCS.

ויזואליזציה וכימות של אינטראקציות חלבון תוך-אברוני אנדוגניות באתרי קשר של ER-מיטוכונדריה על ידי מבחני קשירת קרבה

פרוטוקול זה מתאר בדיקה מבוססת BRET למדידת האינטראקציות של קינאז CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. הפרוטוקול מתאר שלבים להכנת התאים, קריאת פליטות BRET וניתוח נתונים. מוצגת גם תוצאה לדוגמה עם זיהוי בקרות מתאימות ופתרון בעיות עבור מיטוב מבחן.

Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים

למד שיטת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים בין הרשתית האנדופלסמית למיטוכונדריה בתאי HEK293T חיים. שיטה זו מאפשרת מחקר מתקדם בתקשורת בין אברונים ומחלות נוירודגנרטיביות.

בדיקת הרכבה מחדש של Split-Luciferase למדידת מגעים אנדופלסמיים בין הרשתית למיטוכונדריה בתאים חיים

גלה סרטונים נוספים