Name: ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-06-14T14:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 14 s
Description: למד ריצוף RNA חד-תאי בעוברי עכברים מוטנטיים לאורך הגסטרולציה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מקיף של החלטות גורל תאי מוקדמות ורשתות רגולטוריות בתהליך ההתפתחות העוברי.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לליבת הגנומיקה במרכז הסרטן פוקס צ'ייס ולד"ר ג'ונתן ווטסטין ולחברי המעבדה זאק גריי, מדיסון הונר ובנג'מין פרמן על התמיכה הטכנית בניסויי הריצוף. אנו מודים לחברי המעבדה של ד"ר אסטרס ואלכס מוריס, סטודנט לתואר שני ברוטציה שתרמו לניתוח הראשוני של המחקרים החד-תאיים. עבודה זו ממומנת על ידי מענקי NIH R01HD106969 R56HL163146 לקונצ'י אסטראס. בנוסף, אליזבת אברהם נתמכה על ידי מענק הכשרה T32 5T32HL091804-12.

בידוד וגנוטיפ של עובר עכבר גסטרולציה לריצוף תא בודד

<ol><li>Arias, A. M., Marikawa, Y., Moris, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gastruloids%3A+Pluripotent+stem+cell+models+of+mammalian+gastrulation+and+embryo+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Gastruloids: Pluripotent stem cell models of mammalian gastrulation and embryo engineering.</a> Dev Biol. 488, 35-46 (2022).</li>
<li>Kim, Y., Kim, I., Shin, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+era+of+stem+cell+and+developmental+biology%3A+from+blastoids+to+synthetic+embryos+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">A new era of stem cell and developmental biology: from blastoids to synthetic embryos and beyond.</a> Exp Mol Med. 55 (10), 2127-2137 (2023).</li>
<li>Pijuan-Sala, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+molecular+map+of+mouse+gastrulation+and+early+organogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell molecular map of mouse gastrulation and early organogenesis.</a> Nature. 566 (7745), 490-495 (2019).</li>
<li>Mittnenzweig, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-embryo%2C+single-cell+time-resolved+model+for+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A single-embryo, single-cell time-resolved model for mouse gastrulation.</a> Cell. 184 (11), E22 P2825-P2842 (2021).</li>
<li>Bardot, E. S., Hadjantonakis, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+gastrulation%3A+Coordination+of+tissue+patterning%2C+specification+and+diversification+of+cell+fate%5BTitle%5D)+AND+%22Mech+Dev%22%5BJournal%5D)">Mouse gastrulation: Coordination of tissue patterning, specification and diversification of cell fate.</a> Mech Dev. 163, 103617(2020).</li>
<li>Argelaguet, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-omics+profiling+of+mouse+gastrulation+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Multi-omics profiling of mouse gastrulation at single-cell resolution.</a> Nature. 576 (7787), 487-491 (2019).</li>
<li>Chan, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+recording+of+mammalian+embryogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular recording of mammalian embryogenesis.</a> Nature. 570 (7759), 77-82 (2019).</li>
<li>Mohammed, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+landscape+of+transcriptional+heterogeneity+and+cell+fate+decisions+during+mouse+early+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Single-cell landscape of transcriptional heterogeneity and cell fate decisions during mouse early gastrulation.</a> Cell Rep. 20 (5), 1215-1228 (2017).</li>
<li>Lescroart, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defining+the+earliest+step+of+cardiovascular+lineage+segregation+by+single-cell+RNA-seq%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Defining the earliest step of cardiovascular lineage segregation by single-cell RNA-seq.</a> Science. 359 (6380), 1177-1181 (2018).</li>
<li>Scialdone, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Resolving+early+mesoderm+diversification+through+single-cell+expression+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Resolving early mesoderm diversification through single-cell expression profiling.</a> Nature. 535 (7611), 289-293 (2016).</li>
<li>Chromium Next GEM single cell 3' reagent kits v3.1: User guide. 10X Genomics. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry">https://www.10xgenomics.com/support/single-cell-gene-expression/documentation/steps/library-prep/chromium-single-cell-3-reagent-kits-user-guide-v-3-1-chemistry</a> (2024).</li>
<li>NextSeq 1000/2000 Sequencing v2.0 Protocol. Illumina. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm">https://support-docs.illumina.com/SW/ClarityLIMS-INT/Content/SW/ClarityLIMS/Integrations/NextSeq10002000Intv20Config.htm</a> (2024).</li>
<li>Dai, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TET-mediated+DNA+demethylation+controls+gastrulation+by+regulating+Lefty-Nodal+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TET-mediated DNA demethylation controls gastrulation by regulating Lefty-Nodal signalling.</a> Nature. 538, 528-532 (2016).</li>
<li>Li, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((editing-mediated+one-step+inactivation+of+the+Dnmt+gene+family+reveals+critical+roles+of+DNA+methylation+during+mouse+gastrulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">editing-mediated one-step inactivation of the Dnmt gene family reveals critical roles of DNA methylation during mouse gastrulation.</a> Nat Commun. 14 (1), 2922(2023).</li>
<li>Saga, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MesP1+is+expressed+in+the+heart+precursor+cells+and+required+for+the+formation+of+a+single+heart+tube%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">MesP1 is expressed in the heart precursor cells and required for the formation of a single heart tube.</a> Development. 126 (15), 3437-3447 (1999).</li>
<li>Ziegenhain, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+analysis+of+single-cell+RNA+sequencing+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Comparative analysis of single-cell RNA sequencing methods.</a> Mol Cell. 65 (4), 631-643 (2017).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

במאמר זה מוצג צינור איתן להשגת תרחיפים חד-תאיים וגרעינים באיכות גבוהה מעוברי עכברים מגזימים, שתוכננו במיוחד כדי להקל על מחקרים על מנגנונים של אפיון גורל התא בהתפתחות מוקדמת. שיטה זו מטפלת בפער מכריע בתחום הגסטרולציה על ידי אופטימיזציה של ניתוח עוברים הדורשים גנוטיפים, כגון מין או גנים סומטיים. על ידי שימוש במודלים של מוטציות גנטיות בעכברים ושימוש בריצוף חד-תאי ברזולוציה גבוהה על עוברי עכברים שלמים, צינור זה יכול לשפר עוד יותר את ההבנה של פרופילי ביטוי הגנים של גסטרולת העכבר המוקדמת. שיטה זו מדגימה את ההיתכנות של שימוש במודל עכבר מוטציה גנטית על ידי מערכת Cre recombinase כדי להשיג תאים וגרעינים באיכות גבוהה בנקודות זמן התפתחותיות מוקדמות עבור אומיקה חד-תאית. שיטה זו התפתחה באמצעות ניסיונות רבים, שבמהלכם הדגימות לא עמדו בתקני האיכות הנדרשים להכנת הספרייה ולריצוףה. המתודולוגיה המוסברת מייצרת מספיק תאים/גרעינים מעוברים צעירים מ-E8 באמצעות אופטימיזציה של שלושה שלבים קריטיים: (1) הריונות מתוזמנים מסונכרנים כדי להגדיל את מספר העוברים, (2) גנוטיפ באותו יום כדי למנוע הקפאה/הפשרה, ו-(3) הערכת כדאיות התא/גרעינים כדי למנוע ריצוף של תאים גוססים. פרוטוקול זה מספק תוצאות מוצלחות עם RNASeq חד-תאי, אך ניתן לעבד את מתלי התא או הגרעינים המתקבלים בפרוטוקול זה בפלטפורמות ריצוף אחרות, שבהן כדאיות התא היא הגורם המגביל, כגון smart-seq, drop-seq ו-cel-seq16.
בעובר E7, מספר התאים יכול להשתנות בהתאם לזן ולגנוטיפ המוטנטי. בדרך כלל, עובר E7 יכול לנוע בין מאות לכמה אלפי תאים, והשגת עוברים עם הגנוטיפ הרצוי היא מאתגרת, כאשר רק עובר אחד או שניים לכל סכר בהריון עומדים בקריטריונים. פרוטוקול זה מאפשר לכידה של כ-300 תאים בני קיימא לכל עובר E7 לצורך אנליזה של תא יחיד. ניסיונות להגדיל את מאגר העוברים על ידי הקפאת עוברים מהירה מסכרים בהריון בימים שונים לא צלחו, שכן כדאיות התאים נפגעה קשות לאחר ההפשרה, אפילו עם תוספת של חומרים משמרים בהקפאה. כדי להתמודד עם אתגר זה, אסטרטגיית הרבייה והסנכרון של סכרים בהריון היו אופטימליים. כדי להגדיל את הסיכוי לבידודים מרובים, מומלץ להשתמש בנקבות עכברים שילדו 1-2 פעמים לפני הרבייה לבידוד, מכיוון שיש להן סיכוי גבוה יותר להיות בעלות גודל המלטה גדול יותר. ניטור מחזור הייחום של הנקבה הוא חיוני; סביר יותר שההזדווגות תתרחש במהלך שלבי הפרואסטרוס והייחום. אם מתעוררים קשיי רבייה, החלפת השותפים לרבייה לאחר ארבעה ימים תעזור גם אם לא נוצר תקע.
חשוב לציין שלשיטה זו יש מגבלה: היא מסתמכת על תקעים נצפים, וגם אם נצפה תקע, היא אינה מבטיחה הריון אלא רק מעידה על פעילות מינית. לכן, הגדלת מספר התקעים הנצפים ביום תגדיל את ההסתברות ליותר מסכר הריון אחד ביום ויותר גנוטיפים חיוביים. פרוטוקול זה הדגים את ההיתכנות של שימוש בשלבים עובריים החל מ-E7 ועד E7.75 כהוכחת היתכנות במהלך הגסטרולציה. עם זאת, צינור זה יכול להיות מיושם מ E6.5 ל E8 עוברים. עבור עוברי E6.5, מומלץ להגדיל את מספר ההריונות המסונכרנים כדי להשיג לפחות 7 עוברים עם הגנוטיפ הרצוי לאיגום. במקום זאת, עבור עוברי E8, להגדיל את כמות טריפסין המשמש לנתק כל עובר ~ 40 μL במקום 20 μL. המטרה היא להשיג תרחיף תא/גרעינים בטווח ריכוז של 700-1200 תאים למיקרוליטר לפני שממשיכים בחלוקה.
קיום תאים טוב חיוני להצלחת ריצוף תא יחיד. בתכנון השבב המיקרופלואידי המסופק על ידי היצרנים, תאים בודדים מחולקים לחרוזי ג'ל בתחליב (GEMs) בתוך שבב המכיל חרוזי ג'ל ידועים ברקודים11. עם זאת, מגבלה בולטת של תהליך זה היא כי הן תאים בודדים באיכות גבוהה באיכות ירודה ניתן לחלוקה. אפילו עם מספר מספיק של תאים חיים (כלומר, 1000 תאים/μL), אם הכדאיות של ההשעיה נמוכה (כלומר, 1000 תאים חיים ו -1000 תאים מתים, וכתוצאה מכך 50% כדאיות), ניסוי הריצוף צפוי להיכשל. לקבלת תוצאות מיטביות, מומלץ לשאוף לכדאיות של כ-90%. אם כדאיות התא נעה בין 60%-89%, ניתן לנקוט באמצעים ספציפיים כדי לשפר את כדאיות הניסוי. עם זאת, אם כדאיות התא נמוכה מ-60%, מומלץ מאוד לא להמשיך בניסוי. הסיבה לכך היא שהתאים הגוססים "יילכדו" בג'ל המחיצה, והכנת הספרייה ובקרת האיכות הבאות יעברו ללא בעיות מורגשות. עם זאת, ניסוי הריצוף בפועל עלול להיכשל לחלוטין, מכיוון שרוב קריאות הריצוף ימפו גנים מיטוכונדריאליים, ריבוזומליים או אפופטוזיס, מה שמצביע על סימנים של יכולת קיום תאים ירודה מלכתחילה. הנתונים המוצגים במאמר זה ממחישים צינור לריצוף חד-תאי של עוברי עכברים בעלי תאים באיכות גבוהה. מתודולוגיה זו יכולה להיות מיושמת להבנה של מודלים רבים ושונים של מוטציות גנטיות בעכברים במהלך הפיתוח.

גסטרולציה היא תהליך בסיסי הנדרש להתפתחות תקינה. תהליך מהיר ודינמי זה מתרחש כאשר תאים פלוריפוטנטיים עוברים למבשרים ספציפיים לשושלת המגדירים כיצד נוצרים איברים. במשך שנים, גסטרולציה הוגדרה זמן רב כהיווצרות של שלוש אוכלוסיות הומוגניות ברובן: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם. עם זאת, טכנולוגיות ברזולוציה גבוהה ומספר מתפתח של מודלים של תאי גזע עובריים 1,2 חושפים הטרוגניות חסרת תקדים בין שכבות הנבט המוקדמות 3,4. זה מצביע על כך שנותר עוד הרבה מה לגלות על המנגנונים המווסתים את אוכלוסיות התאים השונות של הגסטרולה. התפתחות עוברית של עכבר הייתה אחד המודלים הטובים ביותר לחקר החלטות מוקדמות לגבי גורל התא במהלך גסטרולציה 3,5. הגסטרולציה בעכברים היא מהירה, שכן כל תהליך הגסטרולציה מתרחש תוך 48 שעות, מהיום העוברי E6.5 עד E85.
ההתקדמות האחרונה בטכנולוגיות של תא בודד אפשרה מיפוי מפורט של התפתחות עוברי עכבר מסוג פרא, וסיפקה סקירה מקיפה של הנוף התאי והמולקולרי של עוברים במהלך גסטרולציה 3,4,6,7,8. עם זאת, ניתוח עוברים מוטנטיים בשלבים אלה הוא פחות נפוץ ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FAC 9,10. הספרות המועטה משקפת את האתגרים הטכניים הקשורים למניפולציה והכנה חד-תאית של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ. לכידת התהליך הדינמי של גסטרולציה יכולה להציב אתגרים בשל טבעו המהיר, במיוחד להבנת עוברים מוטנטיים. העיתוי והסנכרון של הריונות הם חיוניים, שכן אפילו הבדלים קלים בין הריונות מתוזמנים יכולים להתפרש בטעות כפנוטיפ התפתחותי הנובע מהגן המוטנטי. זה הופך להיות חשוב במיוחד כאשר הגן המוטנטי משפיע על תהליך הגסטרולציה13,14. במחקר זה, נקבעו קווים מנחים להשגת הריונות מסונכרנים באמצעות הדמיה של פקקים בנרתיק (כלומר, מסת נוזל הזרע הקרוש שנוצר בנרתיק הנקבה לאחר ההזדווגות). בנוסף, אסטרטגיה נועדה להשיג נתונים חד-תאיים חזקים מעוברים מוטנטיים מ-E6.5 עד E8. אסטרטגיה זו פותחה כדי להתגבר על אילוצים הקשורים למספר הנמוך של עוברים עם הגנוטיפ הרצוי להריון ולירידה בכדאיות הנגרמת על ידי הקפאה-הפשרה של עוברים או תאים.
מאמר זה מתאר מתודולוגיה אופטימלית החל מקביעת הריונות מתוזמנים דרך פקקים וגינליים ועד לריצוף הסופי של תאים/גרעינים בודדים. שיטה זו מסבירה כיצד להגדיל את מספר ההריונות המסונכרנים כדי להשיג מספר גבוה יותר של עוברים עם גנוטיפ רצוי, בידודי תאים/גרעינים כדי לשפר את יכולת הקיום של התאים, ופרוטוקול גנוטיפ באותו יום. כתב יד זה מתאר גם את תהליך בידוד העוברים בנקודות זמן שונות של גסטרולציה. המתודולוגיה מסייעת להגדיל את מספר תאי העובר/גרעינים הסופיים ברי קיימא לריצוף, ומבטיחה נתוני ריצוף באיכות גבוהה. לכן, שיטה זו תפתח את הדלתות למחקרים חד-תאיים של עוברים גסטרולטיביים הדורשים גנוטיפ.

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 10 ס"מ</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-202</td><td></td></tr><tr><td>1000 ומיקרו; L להגיע לקצה מחסום</td><td>Genesee Scientific</td><td>23-430</td><td></td></tr><tr><td>20 &micro; L להגיע לקצה מחסום</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-404</td><td></td></tr><tr><td>300 &micro; L להגיע לקצה מחסום</td><td>Genesee Scientific</td><td>24-415</td><td></td></tr><tr><td>37 &micro; m מסננת הפיכה,</td><td>תאי גזע</td> קטנים <td>27215</td><td></td></tr><tr><td>צלחת פטרי 6 ס"מ</td><td>Genesee Scientific</td><td>25-260</td><td></td></tr><tr><td>צינורות PCR 8 רצועות</td><td>Genesee Scientific</td><td>27-125U</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Apex Bioresearch Product</td><td>20-102</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific BSH300 MyBlock מיני אמבט יבש</td><td>Genesee</td><td>31-437</td><td></td></tr><tr><td>Benchmark Scientific Z216-MK Z216MK Hermle מיקרוצנטריפוגה מקוררת</td><td>Genesee</td><td>33-759R</td><td></td></tr><tr><td>אלבומין סרום בקר בקר (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>בקר כרום</td><td>10X</td><td>PN-1000127</td><td></td></tr><tr><td>כרום הבא GEM תא יחיד 3' ערכות ריאגנט v3.1</td><td>10X</td><td>PN-1000269</td><td></td></tr><tr><td>רוזנת 3 אוטומטי מונה תאים</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>AMQAX2000</tr><tr><td>שקופיות תא שיתוף תאים של רוזנת</td><td>Invitrogen</td><td>C10283</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ריאגנטים</td><td>Agilent</td><td>5067-5583</td><td></td></tr><tr><td>D1000 ScreenTape</td><td>Agilent</td><td>5067-5582</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>BN2006</td><td></td></tr><tr><td>שק חלמון DirectPCR</td><td>Viagen</td><td>201-Y</td><td></td></tr><tr><td>Dithiothreitol ( DTT)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0861</td><td></td></tr><tr><td>DNA LoBind Tube 1.5 מ"ל</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dubecco's Modificiation of Eagle's Medium (DMEM, 1x)</td><td>CORNING</td><td>10-013-CV</td><td></td></tr><tr><td>PBS GenClone של Dulbecco</td><td></td><td>25-508</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>עדינים כלים מדעיים</td><td>עדינים 11254-20</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF מלקחיים</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-00</td><td></td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Koptec</td><td>V1401</td><td></td></tr><tr><td>EVOS M7000 מערכת הדמיה</td><td>Invitrogen</td><td>AMF7000</td><td></td></tr><tr><td>מספריים עדינים -</td><td>Sharp Fine Science Tools</td><td>14060-11</td><td></td></tr><tr><td>GoTaq G2 Green Master Mix</td><td>Promega</td><td>M7823</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Fine</td><td>Science Tools</td><td>11049-10</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AC223211000</td><td></td></tr><tr><td>MiniAmp Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>A37834</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Chemical</td><td>S271-500</td><td></td></tr><tr><td>הבאSeq 1000/2000 P2 ריאגנטים (100 מחזורים) v3</td><td>Illumina</td><td>20046811</td><td></td></tr><tr><td>הבאSeq2000</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ניקון SMZ 1000 מיקרוסקופ סטריאו</td><td>ניקון</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nondiedt P40</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>מים ללא נוקלאז</td><td>GenClone</td><td>25-511</td><td></td></tr><tr><td>צינור אופטי 8x רצועה (401428)</td><td>Agilent</td><td>401428</td><td></td></tr><tr><td>כובע צינור אופטי 8x רצועה (401425)</td><td>Agilent</td><td>401425</td><td></td></tr><tr><td>פוסידון 31-511, מיקרוצנטריפוגה HS24, עם רוטור 24 x 1.5/2.0 מ"ל, 1 צנטריפוגה/יחידה</td><td>Genesee</td><td>31-511</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6556</td><td></td></tr><tr><td>ערכות בדיקת כימות dsDNA של קיוביט</td><td>Invitrogen</td><td>Q32851</td><td></td></tr><tr><td>Qubit Flex 3</td> מעכב RNase <td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>12-141-368</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים דפוס סטנדרטי</td><td>כלי מדע עדינים</td><td>11000-12</td><td></td></tr><tr><td>טיפים לטעינת תחנת קלטת</td><td>Agilent</td><td>5067-5598</td><td></td></tr><tr><td>Tapestation 4150</td><td>Agilent</td><td>G2992AA</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td> <td>איכות ביולוגית</td><td>351-007-101</td><td></td></tr><tr><td>כתם כחול טריפן 0.4%</td> <td>Theromo Fisher Scientific</td><td>T10282</td><td></td></tr><tr><td>Tryple Express</td><td>Gibco</td><td>12604-021</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Bio-Rad</td><td>1662404</td><td></td></tr><tr><td>מערבולת מערבולת IKA MS3 עם מתאם צלחת דגימה 96 בארות</td><td>IKA</td><td>3617000</td><td></td></tr></tbody></table>

ריצוף rna חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

Single-Cell RNA Sequencing of Mutant Whole Mouse Embryos: From the Epiblast to the End of Gastrulation

במהלך העשור האחרון, גישות חד-תאיות הפכו לתקן הזהב לחקר דינמיקה של ביטוי גנים, הטרוגניות של תאים ומצבי תאים בתוך דגימות. לפני התקדמות התא הבודד, ההיתכנות של לכידת הנוף התאי הדינמי ומעברי תאים מהירים במהלך ההתפתחות המוקדמת הייתה מוגבלת. במאמר זה, צינור חזק תוכנן לבצע אנליזה של תאים בודדים וגרעינים על עוברי עכברים מהיום העוברי E6.5 עד E8, המתאים לתחילת והשלמת הגסטרולציה. גסטרולציה היא תהליך בסיסי במהלך הפיתוח הקובע את שלוש שכבות הנבט: מזודרם, אקטודרם ואנדודרם, החיוניים לאורגנוגנזה. קיימת ספרות נרחבת על אומיקה חד-תאית המיושמת על עוברי פריגסטרולציה מסוג פראי. עם זאת, ניתוח חד-תאי של עוברים מוטנטיים עדיין נדיר ולעתים קרובות מוגבל לאוכלוסיות ממוינות FACS. זאת, בין היתר, בשל האילוצים הטכניים הקשורים לצורך בגנוטיפ, הריונות מתוזמנים, ספירת עוברים עם גנוטיפים רצויים להריון ומספר התאים לעובר בשלבים אלה. כאן מוצגת מתודולוגיה שנועדה להתגבר על מגבלות אלה. שיטה זו קובעת הנחיות רבייה והריון מתוזמן כדי להשיג סיכוי גבוה יותר להריונות מסונכרנים עם גנוטיפים רצויים. שלבי אופטימיזציה בתהליך בידוד העובר יחד עם פרוטוקול גנוטיפ באותו יום (3 שעות) מאפשרים לבצע תא בודד מבוסס מיקרו-טיפות באותו יום, מה שמבטיח את הכדאיות הגבוהה של התאים ותוצאות חזקות. שיטה זו כוללת גם הנחיות לבידודים אופטימליים של גרעינים מעוברים. לפיכך, גישות אלה מגדילות את ההיתכנות של גישות חד-תאיות של עוברים מוטנטיים בשלב הגסטרולציה. אנו צופים כי שיטה זו תקל על ניתוח האופן שבו מוטציות מעצבות את הנוף התאי של הגסטרולה.

המתודולוגיה שתוכננה במאמר זה נועדה במיוחד לשפר את הכנת דגימות העוברים עבור אומיקה חד-תאית מ-E6.5 עד E8. הצינור החזק הזה מורכב מחמישה שלבים עיקריים: הריונות מתוזמנים מסונכרנים, בידודים של עוברים, גנוטיפ באותו יום, דיסוציאציה של תאים והערכת כדאיות התא (איור 1A). בעוד שהנתונים המוצגים מתמקדים בנקודות זמן מ-E7 עד E7.5, ניתן ליישם אותם על עוברים עד E8 (איור 1B) עם שינויים קטנים בהליך (המתייחסים להערות לאורך הפרוטוקול). הריונות מתוזמנים מסונכרנים הושגו על ידי הכנסת שתי עכברות נקבות לכלוב עם עכבר זכר. פקקים וגינליים נבדקו כל בוקר לפני 10 בבוקר, ואם נצפה תקע, הוא נחשב E0.5 בצהרי אותו יום (איור 2A). במחקר הזה, התנאים האופטימליים לתקעים דרשו מנקבת עכבר בשלב הייחום או הפרואסטרוס להיות מזווגת, עם זכר עם היסטוריה של הצבת כמה תקעים בהצלחה במהלך רבייה קודמת (איור 2B). רק תקעים ברורים נלקחו בחשבון עבור בידוד עוברים (איור 2C).
העיתוי ההתפתחותי הוערך בהתאם ללוח הזמנים באיור 2A. עבור E7.5, דיסקציה של עוברים החלה בשעה 12:00 ביוםהשביעי שלאחר יום גילוי התקע. איור 3 מדגים בידוד עובר מוצלח ב-E7.5. לאחר שהסכר ההריוני עבר המתת חסד, קרן הרחם נותחה, הנפיחות הנשירים נחתכה בנפרד וחשפה את העובר, ושק החלמון בודד לצורך גנוטיפ (איור 3).
גנוטיפ באותו יום בוצע תוך 3 שעות מבידוד העובר בעקבות השלבים באיור 4A. העוברים נשמרו על קרח בתהליך הגנוטיפ כדי לשמור על שלמותם. אין להקפיא את העוברים, שכן זה יקטין את מספר התאים קיימא לכל עובר. איור 4B,C מראה את שק החלמון הקרבי, את השק האנדודרמלי הקודקודי ואת חרוט השליה האקטושליה עם הדם האימהי הקשורים. שק החלמון הקרבי שימש לגנוטיפ (איור 4C). לאחר עיכול שק החלמון, תערובת ה-PCR הוכנה, ותגובת ה-PCR הופעלה. מוצר ה- PCR שהתקבל הופרד לאחר מכן על ג'ל אגרוז. איור 4D מראה את גודל המקטעים הצפוי עבור אללי LoxP ואללים מסוג בר (597 bp ו-498 bp, בהתאמה) ואלל Cre (650 bp). באיור 4E מוצגת דוגמה לגנוטיפ של שק חלמון מ-6 עוברים שהתקבלו מזוגות רבייה הנושאים אללים מסוג Cre ו-LoxP (flox). הג'לים מתארים את תוצרי ה-PCR של אללי Cre ו-LoxP ב-6 העוברים שנותחו. עוברים מספר 2 ומספר 5 נושאים 2 אללי פלוקס ואלל 1 קר; לכן, הם נחשבים עוברי KO מותנים (איור 4E, נקודות אדומות). לעוברים 1 ו-3 יש 2 אללים פלוקס אך הם שליליים ל-Cre; לכן, הם נחשבים בקרות FLOX. לעובר 4 יש 2 אללי פלוקס ורצועה חלשה לאלל Cre, וכתוצאה מכך גנוטיפ "לא ברור". עובר זה לא עבר עיבוד נוסף (לחלופין, הנסיין עשוי לשקול לחזור על הגנוטיפ או לבצע אימות משני של KO המותנה באמצעות תאים המבטאים Cre). חשוב לציין כי דרייבר Cre המשמש בניסוי זה אינו בא לידי ביטוי בשק החלמון הקרבי15; לפיכך, האללים של LoxP אינם נראים מוזזים על הג'ל של עוברים Cre-positive בהשוואה לעוברים Cre-negative.
ספירת תאים וכדאיות טובה נדרשות לניסוי מוצלח של תא בודד. מתלים עם כדאיות תאים נמוכה, אחוז גבוה של תאים מתים, גושים או פסולת משמעותית אינם מתאימים לעיבוד נוסף. התנאים האופטימליים הם עבור 700-1200 תאים חיים למיקרוליטר ו &gt;90% כדאיות. איור 5A מציג פאנל שממחיש גם יכולת קיום טובה וגם תת-אופטימלית של תאים. ניתן ליישם את אותם קריטריונים גם עבור בידוד גרעינים, כפי שמוצג באיור 5B. עם זאת, חשוב לציין כי ההערכה של כחול טריפאן שונה מתאים וגרעינים: תאים קיימא אינם משלבים כחול טריפאן, בעוד גרעינים קיימא כן. אם תרחיף תאים/גרעינים הוא אופטימלי (&gt;90% כדאיות), המשך בחלוקה של תא בודד באמצעות שבב מיקרופלואידי בהתאם לנוהלי היצרן11. אפשרויות פתרון בעיות מסופקות עבור מתלים שבהם הכדאיות של התא/גרעינים היא בין 60% ל-89%, כפי שמתואר באיור 5C. אם הכדאיות, ללא קשר למספר התאים הכולל, יורדת מתחת ל-60%, שקול להפסיק את הניסוי.
כל הצינור מסגירת הסכר ההרה לבניית הספרייה אורך בסך הכל 8 שעות באותו יום (כלומר, שלבי פרוטוקול 2 עד 6 חייבים להתבצע באותו יום). בהתאם לנהלים שהותוו על ידי נהלי11 של יצרני התא הבודד, הוכנו מבני ספריות לריצוף רנ"א חד-תאי באמצעות תאים שהתקבלו מעוברי E7, כאשר כדאיות התא נעה בין תנאים תת-אופטימליים לאופטימליים, במטרה להתאוששות יעד משוערת של 2000 תאים (איור 6). איור 6A מתאר התפלגות מייצגת של גודל מקטע של ספריות scRNAseq עבור תנאים תת-אופטימליים ואופטימליים, מה שמצביע על כך שיכולת הקיום של התא אינה משפיעה באופן משמעותי על כל תהליך החלוקה של תא יחיד. התפלגות גודל השבר נעה בין 400-500 bp. הדבר מצביע על כך שתנאים תת-אופטימליים אינם משפיעים על תהליך הכנת הספרייה. איור 6B מראה את התוצאות של ניסויי RNAseq חד-תאיים מוצלחים ותת-אופטימליים. לאחר הריצוף נערכו בדיקות בקרת איכות על הדגימות והבחינו כי במקרים בהם כדאיות התא הייתה תת-אופטימלית, רק 10% מהתאים רוצפו בהצלחה. לעומת זאת, דגימות אופטימליות הציגו אחוז גבוה יותר, כאשר 91% מכלל התאים רוצפו. הדבר מוכח עוד יותר על ידי תרשימי ברקוד, המצביעים על כך שלתנאים התת-אופטימליים יש רעשי רקע גדולים יותר בהשוואה לתנאים אופטימליים. ניתוח אשכולות בוצע בשני הניסויים וגילה 9 אשכולות בתנאים האופטימליים ו-4 בתנאים התת-אופטימליים. ביאור הצבירים באמצעות סמנים ידועים3 חשף סוגי תאים צפויים בעוברי E7, כולל אפיבלסט ופס פרימיטיבי (איור 6B). ביאורי אשכולות בניסוי התת-אופטימלי לא התאפשרו בשל היעדר העשרה בסמנים ידועים לכל אשכול. זה מדגיש את החשיבות של תאים באיכות גבוהה הדרושים לייצוג נכון של נתונים בשלבי התפתחות אלה.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2.jpg"> איור 1: אופטימיזציה של עוברי עכבר שלמים עבור ריצוף רנ"א חד-תאי. (A) סכימת זרימת עבודה להשגת תאים ו/או גרעינים באיכות גבוהה מעוברים מתגבשים. (B) תמונות שדה בהירות מייצגות וסכמהמותאמת 3 של עוברי עכברים במהלך הגסטרולציה מ-E7 עד E8. סרגל קנה מידה: 125 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig1v2large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2.jpg"> איור 2: אסטרטגיה להריונות מתוזמנים מסונכרנים יעילים עבור בידודי עוברים במהלך גסטרולציה. (A) תרשים סכמטי המציין את הצינור להריונות מתוזמנים ולוח זמנים המתאר את הזמנים מגילוי תקע לבידוד עוברים לניתוח שלבי גסטרולציה ספציפיים. (B) תמונות מייצגות של שלבי מחזור הייחום עבור נקבות עכברים. השלבים הפתוחים ביותר לרבייה מסומנים. (C) תרשים סכמטי הממחיש כיצד לבדוק אם קיימים פקקים בנרתיק ודוגמאות לפתחי נרתיק ללא תקע, תקע חלקי או תקע טוב שיש לקחת בחשבון עבור בידוד עוברים. פתחי הנרתיק מוגדלים מתחת לכל תמונה. הפקק (זרע קרוש בפתח הנרתיק) מודגש בחץ אדום המצביע עליו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig2v2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig03.jpg"> איור 3: דיסקציה וגנוטיפ של עוברי E7.5 לצורך ריצוף רנ"א חד-תאי. דיאגרמות סכמטיות ותמונות של תהליך בידוד עוברי E7.5 וניתוח שק החלמון הקרבי. החץ הצהוב מציין את הרחם של הסכר ההרה, והעיגול המקווקו הצהוב מתאר את מיקום העובר. קווים מקווקווים מייצגים את האזורים שנחתכו במהלך הנתיחה. "M" מציין את הסוף המזום, ואילו "AM" מציין את הסוף האנטי-מזומטרי. פסי קנה מידה בתמונות סטריאוסקופ הם 400 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig04.jpg"> איור 4: גנוטיפ באותו יום של שקי חלמון מעוברי עכברים מגרדים. (A) סכמת זרימת עבודה לגנוטיפ באותו יום של שקי חלמון. (B) תמונה מייצגת של השק האנדודרמלי הקודקודי וחרוט השליה האקטושליה עם הדם האימהי המשויך. (C) שק חלמון בטני בעוברי E7.5 המודגשים בקו מקווקו. סרגל קנה מידה: 200 מיקרומטר. (D) ג'לים מייצגים מסוג פראי (+/+), הטרוזיגוטי (Flox/+), והומוזיגוטי flox (Flox/Flox), וגנוטיפ Cre (Mesp1cre15) עם גדלים נצפים של מקטעי DNA. (E) תוצאות גנוטיפ באותו יום עבור אללים Cre ו-flox משקים חלמוניים של 6 עוברים (1-6) מסופקות. שני העוברים עם גנוטיפ flox/flox ו-Cre שלילי (-) הם פקדי flox (נקודות כחולות), ואילו אלה עם גנוטיפ flox/flox ו-Cre חיובי (+) הם KOs מותנים (נקודות אדומות). עובר 4 אינו אופטימלי עקב רצועת Cre חלשה (flox/flox ו- Cre-unclear) ולכן אינו נכלל בעיבוד נוסף. עוברים עם אותו גנוטיפ מאוגמים ומעובדים לריצוף RNA של תא יחיד. שימו לב שנוכחות אלל Cre בשק החלמון אינה משפיעה על גודל רצועות הפלוקס , שכן ה- Cre המשמש (Mesp1cre) אינו מתבטא בשק החלמון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig05.jpg"> איור 5: הערכת איכות התא וכדאיות הגרעינים. (A) תמונות מייצגות של תנאי קיום תאים אופטימליים ותת-אופטימליים מעוברי E7.5. (B) תמונות מייצגות של תנאי קיום גרעינים אופטימליים ותת-אופטימליים מעוברי E8 (C) סכימת פתרון בעיות המציינת פתרונות אפשריים שיעזרו להגדיל את הכדאיות של תאים לפני תחילת חלוקה של תא יחיד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66866/66866fig06.jpg"> איור 6: ריצוף רנ"א חד-תאי של עוברי עכבר E7. (A) מעקב מייצג של התפלגות גודל המקטע עבור ספריות ריצוף רנ"א חד-תאי מעוברי עכברי E7 עבור תנאים תת-אופטימליים ואופטימליים של קיום התא, כאשר השיא העיקרי קרוב ל-400-500 bp. שים לב שהעקבות דומות בין תנאים אלה, דבר המצביע על כך שיכולת הקיום של התא אינה משפיעה על בקרות האיכות של הספריה. (B) ניתוח תוצאות ריצוף RNA חד-תאי עבור עוברי עכברי E7 בתנאים תת-אופטימליים ואופטימליים כאחד, המציג שחזור מטרה נצפה, דירוג ברקוד והתקבצות של סוגי תאים באמצעות התפלגות סעפת אחידה של קירוב והקרנה (UMAP). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66866/66866fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="4">חיץ ליזיס</td>
		</tr><tr><td>שם מגיב</td>
			<td>ריכוז מלאי</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
			<td>נפח כולל 1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>Tris-HCL (Ph7)</td>
			<td>1 מטר</td>
			<td>10 מ"מ</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>5 מטר</td>
			<td>10 מ"מ</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>MgCl2</td>
			<td>0.1 מטר</td>
			<td>3 מ"מ</td>
			<td>3 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>טווין-20</td>
			<td>20%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>5 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>Nondiedt P40</td>
			<td>10%</td>
			<td>0.10%</td>
			<td>10 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>דיגיטונין</td>
			<td>5%</td>
			<td>0.01%</td>
			<td>2 μL</td>
		</tr><tr><td>DTT</td>
			<td>1 מטר</td>
			<td>1 מ"מ</td>
			<td>1 μL</td>
		</tr><tr><td>מעכב RNase</td>
			<td>40 U/μL</td>
			<td>1 U/μL</td>
			<td>25 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>מים ללא Nuclease</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>924 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td colspan="4">חיץ כביסה</td>
		</tr><tr><td>שם מגיב</td>
			<td>ריכוז מלאי</td>
			<td>ריכוז סופי</td>
			<td>נפח כולל 1 מ"ל</td>
		</tr><tr><td>BSA ב PBS</td>
			<td>10%</td>
			<td>1%</td>
			<td>100 מיקרוליטר</td>
		</tr><tr><td>PBS</td>
			<td>--</td>
			<td>--</td>
			<td>900 מיקרוליטר</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: חיץ ליזיס בידוד גרעינים והרכב חיץ שטיפה.

מאמר זה קובע צינור להשעיה איכותית של תאים בודדים וגרעינים של עוברי עכברים גסטרולטיביים לצורך ריצוף של תאים בודדים וגרעינים.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

Over the last decade, single-cell approaches have become the gold standard for studying gene expression dynamics, cell heterogeneity, and cell states ...

single-cell-rna-sequencing-mutant-whole-mouse-embryos-from-epiblast

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

פרוטוקול זה מציג שיטה לבצע מתחיל מתא בודד כמותי, בניתוח באתרו של ביטוי חלבון ללמוד מפרט השושלת בעוברים preimplantation העכבר. הנהלים הדרושים לאיסוף blastocysts, כל הר זיהוי immunofluorescent של חלבונים, הדמיה של דגימות על מיקרוסקופ confocal, ופילוח גרעיני וניתוח תמונה מתוארת.

ניתוח כמותי של ביטוי חלבון לחקר מפרט Lineage עכבר preimplantation עוברים

כאן, אנו מציגים גישה קומבינטורית באמצעות מיקרוסקופ ברזולוציה גבוהה, כלים חישוביים, ותיוג תא יחיד בחיים C. אלגיה העוברים להבין דינמיקה תא בודד במהלך ההתפתחות העצבית.

איזוטרופי מיקרוסקופ גיליון אור אוטומטי שושלת היוחסין ניתוח לקטלוג Caenorditis הEmbryogenesis עם רזולוציה Subcellular

עבודה זו מתארת פרוטוקול של תפוקה חצי-גבוהה המאפשרת הדמיה בו של embryogenesis בזמן בו במהירות של 80-100 ס מ עוברים בריצה אחת ללילה. בנוסף, כלי עיבוד תמונה ופריטים חזותיים נכללים כדי לייעל את ניתוח הנתונים. השילוב של שיטות אלה עם זני כתבת מותאמים אישית מאפשר ניטור מפורט של embryogenesis.

שיטת דימות למחצה של תפוקה גבוהה וערכת כלי הדמיה של נתונים כדי לנתח את הפיתוח העובריים של ס. אלאנס

כאן הצגנו מרבב תא יחיד mRNA שיטת רצף לביטוי גנים פרופיל ברקמות עובריים העכבר. השיטה המבוססת על droplet בודדת של תא mRNA (scRNA-Seq) בשילוב עם אסטרטגיות ריבוב יכולה לפרופיל תאים בודדים מדגימות מרובות בו זמנית, אשר מפחית באופן משמעותי את עלויות החומרים וממזער את השפעות האצווה הנסיוניות.

מרבב תא יחיד mRNA ניתוח הרצף של העכבר תאים עובריים

אנו מתארים טכניקה לפרופיל microRNAs בעוברי עכבר מוקדם. פרוטוקול זה מתגבר על האתגר של קלט תאים נמוך והעשרת RNA קטנה. תוואי זה יכול לשמש כדי לנתח שינויים בביטוי miRNA לאורך זמן בנסיגות תאים שונים של עובר העכבר המוקדם.

הכנת ספריות RNA קטנות לצורך רצף של עוברי עכבר מוקדם

כאן, אנו מתארים פרוטוקול ליצירת מוטציה אימהית המצמיד קו נוק-אין יציב של zpc:cas9 עם מסירה בתיווך Tol2 של קלטות ביטוי sgRNA.

דור של מוטציות אימהיות באמצעות zpc:cas9 Knock-in Zebrafish

פרוטוקול זה מספק צינור חישובי יעיל לכימות תמלילי משפרים מתהווים. על ידי שילוב נגישות כרומטין, תכונת כרומטין ונתוני שעתוק, הוא מאפשר זיהוי מדויק וניתוח ספציפי לגדיל של פעילות משפר באזורים תוך-גניים מורכבים, תוך שהוא נשאר נגיש לחוקרים ללא הכשרה ביואינפורמטית נרחבת.

צינור חישובי לכימות RNA משפר אינטרגני/תוך-גני בתאי גזע עובריים של עכבר

פרוטוקול זה מתאר שיטה לנתח, ניסוי לתפעל וexplants רשתית תרבות שלם מעוברי תרנגולת. תרבויות explant הן שימושיות כאשר שיעור הצלחה גבוהה, יעילות ושחזור יש צורך לבדוק את ההשפעות של פלסמידים לelectroporation ו / או חומרים מגיב, כלומר, מעכבים האנזימטית.

Explants רשתית שלם מעוף עוברים לטיפולי Electroporation וכימיים מגיב

אנו מתארים הליך רב-יעד chromogenic כל הר הכלאה באתר (MC-תרצה) בעוברים שלמים תסיסנית מאפשרים זיהוי סימולטני וספציפי של שלושה דפוסי הפצת mRNA שונים על ידי מנוגד משקעים צבע.

רב-יעד Chromogenic כל הר<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה להשוואת תחומים ביטוי גנים ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; עוברים

מעקב חיה של אבות רשתית WT בודדים רקע גנטי מובהק מאפשר הערכה של תרומת איתות שאינו אוטונומי התא במהלך הנוירוגנזה. כאן, שילוב של מציאת גן, דור הכימרה באמצעות השתלה העובר בתחום הדמית confocal זמן לשגות vivo נוצל למטרה זו.

In vivo הדמיה של ביטוי מהונדס ג&#39;ין הפרט רשתית אבות ב Chimeric דג הזברה עוברים לחקר השפעות Cell Nonautonomous

למד ריצוף RNA חד-תאי בעוברי עכברים מוטנטיים לאורך הגסטרולציה. פרוטוקול זה מאפשר ניתוח מקיף של החלטות גורל תאי מוקדמות ורשתות רגולטוריות בתהליך ההתפתחות העוברי.

ריצוף RNA חד-תאי של עוברי עכברים שלמים מוטנטיים: מהאפיבלסט ועד סוף הגסטרולציה

גלה סרטונים נוספים