ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

עבודה זו נתמכת על ידי תוכנית הפיילוט של שנחאי למחקר בסיסי - אוניברסיטת פודאן 21TQ1400100 (22TQ019), פרויקט מרכזי במדע וטכנולוגיה עירוני בשנחאי, מעבדת לינגאנג (מענק מס '. LG-QS-202203-09) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (32371036).

הדמיה בזמן אמת לפעילות נוירונים בתאי פיתול משוננים של עכברים 

<ol><li>Scoville, W. B., Milner, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Loss+of+recent+memory+after+bilateral+hippocampal+lesions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Neurosurg+Psychiatry%22%5BJournal%5D)">Loss of recent memory after bilateral hippocampal lesions.</a> J Neurol Neurosurg Psychiatry. 20 (1), 11-21 (1957).</li>
<li>Spiers, H. J., Burgess, N., Hartley, T., Vargha-Khadem, F., O'keefe, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bilateral+hippocampal+pathology+impairs+topographical+and+episodic+memory+but+not+visual+pattern+matching%5BTitle%5D)+AND+%22Hippocampus%22%5BJournal%5D)">Bilateral hippocampal pathology impairs topographical and episodic memory but not visual pattern matching.</a> Hippocampus. 11 (6), 715-725 (2001).</li>
<li>Kandel, E. R., Spencer, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+neurophysiological+approaches+in+the+study+of+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Cellular neurophysiological approaches in the study of learning.</a> Physiol Rev. 48 (1), 65-134 (1968).</li>
<li>Zemla, R., Basu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hippocampal+function+in+rodents%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Hippocampal function in rodents.</a> Curr Opin Neurobiol. 43, 187-197 (2017).</li>
<li>Basu, J., Siegelbaum, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+corticohippocampal+circuit%2C+synaptic+plasticity%2C+and+memory%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Biol%22%5BJournal%5D)">The corticohippocampal circuit, synaptic plasticity, and memory.</a> Cold Spring Harb Perspect Biol. 7 (11), a021733(2015).</li>
<li>Gobbo, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+signature+of+spatial+decision-making+during+navigation+by+freely+moving+rats+by+using+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Neuronal signature of spatial decision-making during navigation by freely moving rats by using calcium imaging.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 119 (44), e2212152119(2022).</li>
<li>Schuette, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gabaergic+ca1+neurons+are+more+stable+following+context+changes+than+glutamatergic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Gabaergic ca1 neurons are more stable following context changes than glutamatergic cells.</a> Sci Rep. 12 (1), 10310(2022).</li>
<li>Daumas, S., Halley, H., Francés, B., Lassalle, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encoding%2C+consolidation%2C+and+retrieval+of+contextual+memory%3A+Differential+involvement+of+dorsal+ca3+and+ca1+hippocampal+subregions%5BTitle%5D)+AND+%22Learn+Mem%22%5BJournal%5D)">Encoding, consolidation, and retrieval of contextual memory: Differential involvement of dorsal ca3 and ca1 hippocampal subregions.</a> Learn Mem. 12 (4), 375-382 (2005).</li>
<li>Ognjanovski, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Erratum%3A+Parvalbumin-expressing+interneurons+coordinate+hippocampal+network+dynamics+required+for+memory+consolidation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Erratum: Parvalbumin-expressing interneurons coordinate hippocampal network dynamics required for memory consolidation.</a> Nat Commun. 8, 16120(2017).</li>
<li>Hainmueller, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+emergence+of+stable+and+dynamic+memory+engrams+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Parallel emergence of stable and dynamic memory engrams in the hippocampus.</a> Nature. 558 (7709), 292-296 (2018).</li>
<li>Yassa, M. A., Stark, C. E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pattern+separation+in+the+hippocampus%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Pattern separation in the hippocampus.</a> Trends Neurosci. 34 (10), 515-525 (2011).</li>
<li>Ryan, T. J., Roy, D. S., Pignatelli, M., Arons, A., Tonegawa, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Memory.+Engram+cells+retain+memory+under+retrograde+amnesia%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Memory. Engram cells retain memory under retrograde amnesia.</a> Science. 348 (6238), 1007-1013 (2015).</li>
<li>Manahan-Vaughan, D., Reymann, K. G., Brown, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+electrophysiological+investigations+into+the+role+of+histamine+in+the+dentate+gyrus+of+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">In vivo electrophysiological investigations into the role of histamine in the dentate gyrus of the rat.</a> Neuroscience. 84 (3), 783-790 (1998).</li>
<li>Kim, S., Jung, D., Royer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Place+cell+maps+slowly+develop+via+competitive+learning+and+conjunctive+coding+in+the+dentate+gyrus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Place cell maps slowly develop via competitive learning and conjunctive coding in the dentate gyrus.</a> Nat Commun. 11 (1), 4550(2020).</li>
<li>Danielson, N. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+imaging+of+dentate+gyrus+mossy+cells+in+behaving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">In vivo imaging of dentate gyrus mossy cells in behaving mice.</a> Neuron. 93 (3), 552-559.e4 (2017).</li>
<li>Chen, T. -W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrasensitive+fluorescent+proteins+for+imaging+neuronal+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Ultrasensitive fluorescent proteins for imaging neuronal activity.</a> Nature. 499 (7458), 295-300 (2013).</li>
<li>Barnett, L. M., Hughes, T. E., Drobizhev, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+molecular+mechanism+responsible+for+gcamp6m%27s+ca2%2B-dependent+change+in+fluorescence%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Deciphering the molecular mechanism responsible for gcamp6m's ca2+-dependent change in fluorescence.</a> PLoS One. 12 (2), e0170934(2017).</li>
<li>Ghosh, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Miniaturized+integration+of+a+fluorescence+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Miniaturized integration of a fluorescence microscope.</a> Nat Methods. 8 (10), 871-878 (2011).</li>
<li>Pnevmatikakis, E. A., Giovannucci, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normcorre%3A+An+online+algorithm+for+piecewise+rigid+motion+correction+of+calcium+imaging+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Normcorre: An online algorithm for piecewise rigid motion correction of calcium imaging data.</a> J Neurosci Methods. 291, 83-94 (2017).</li>
<li>Inan, H., et al. Fast and statistically robust cell extraction from large-scale neural calcium imaging datasets. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aInan%2C+H+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2021).</li>
<li>Thapa, R., Liang, B., Liu, R., Li, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stereotaxic+viral+injection+and+gradient-index+lens+implantation+for+deep+brain+in+vivo+calcium+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Stereotaxic viral injection and gradient-index lens implantation for deep brain in vivo calcium imaging.</a> J Vis Exp. (176), (2021).</li>
<li>Wirtshafter, H. S., Disterhoft, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+multi-day+calcium+imaging+of+ca1+hippocampus+in+freely+moving+rats+reveals+a+high+preponderance+of+place+cells+with+consistent+place+fields%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">In vivo multi-day calcium imaging of ca1 hippocampus in freely moving rats reveals a high preponderance of place cells with consistent place fields.</a> J Neurosci. 42 (22), 4538-4554 (2022).</li>
<li>Masala, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+hippocampal+Ca2%2B+micro-waves+following+synapsin-dependent+adeno-associated+viral+expression+of+Ca2%2B+indicators%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Aberrant hippocampal Ca2+ micro-waves following synapsin-dependent adeno-associated viral expression of Ca2+ indicators.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
<li>Liang, B., Zhang, L., Moffitt, C., Li, Y., Lin, D. -T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+open-source+automated+surgical+instrument+for+microendoscope+implantation%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">An open-source automated surgical instrument for microendoscope implantation.</a> J Neurosci Methods. 311, 83-88 (2019).</li>
<li>Hsiao, Y. -T., Wang, A. Y. -C., Lee, T. -Y., Chang, C. -Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+baseplating+and+a+miniscope+preanchored+with+an+objective+lens+for+calcium+transient+research+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Using baseplating and a miniscope preanchored with an objective lens for calcium transient research in mice.</a> J Vis Exp. (172), e62611(2021).</li>
<li>Barbera, G., Liang, B., Zhang, L., Li, Y., Lin, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+wireless+miniscope+for+deep+brain+imaging+in+freely+moving+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">A wireless miniscope for deep brain imaging in freely moving mice.</a> J Neurosci Methods. 323, 56-60 (2019).</li>
<li>Cholvin, T., Bartos, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemisphere-specific+spatial+representation+by+hippocampal+granule+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Hemisphere-specific spatial representation by hippocampal granule cells.</a> Nat Commun. 13 (1), 6227(2022).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן תיארנו הליך להדמיית סידן in vivo ב- DG של עכברים. אנו מאמינים כי פרוטוקול זה יהיה שימושי עבור חוקרים השואפים לחקור תפקודי DG בתהליכים קוגניטיביים שונים, במיוחד במקרים בהם תת-אוכלוסייה מזוהה גנטית מעניינת. כאן נסביר את יתרונות הפרוטוקול שלנו, תוך שימת דגש על כמה נקודות מרכזיות בניתוח, ונדון במגבלות של שיטה זו.
בדקנו נהלים שונים להדמיית DG מתוך הספרות הקיימת וביצענו אופטימיזציה של הליכי הניסוי כמפורט בפרוטוקול זה. לדעתנו, שלושת השינויים העיקריים הבאים שיפרו מאוד את אחוזי ההצלחה של הפרוטוקול שלנו. ראשית, שילבנו את כל הפרוצדורות הכירורגיות בישיבה אחת, בעוד שמחקרי הדמיית סידן רבים באזורים תת-קורטיקליים ביצעו הזרקת וירוסים והשתלת עדשות בשני ניתוחים נפרדים. יתרון מרכזי של הגישה שלנו הוא שביטוי וירוסים והתאוששות רקמת המוח מתרחשים כעת באותה תקופה, מה שמקצר את זמן ההמתנה להכנת עכבר בחצי, מה שבדרך כלל לוקח חודשים21. יתר על כן, ניתוחים נפרדים דורשים מיקום מחדש מדויק של העכבר, שכן הטיות קלות עם חוסר התאמה בטווח של 100 מיקרומטר יובילו לכישלון של ההליך. כדי להימנע ממיקום שגוי של העדשה, חלק מהקבוצות פיתחו גישה המצמידה את המיניסקופ לעדשה וניסו לראות את הביטוי העצבי של החיישן במהלך ניתוח ההשתלה. דרך זו לעקיפת הבעיה דורשת הנדסה לא טריוויאלית של המנגנון הסטריאוטקסי הנפוץ והיא מורכבת לשימוש עקב דיכוי פעילויות נוירונים במהלך הרדמה. השיטה שלנו אינה דורשת מיקום מחדש של העכבר, ובכך להפחית באופן משמעותי את הזמן והלחץ הקשורים להליך.
נקודת המפתח השנייה של הגישה שלנו היא שאנו מזריקים שוב ושוב כמויות קטנות של הנגיף לאזור היעד22. זה מוביל יותר תאים להיות נגועים. חשוב לציין, בהשוואה להגדלת עומס הנגיף באתר הזרקה יחיד, גישה זו הניבה תוצאות טובות יותר בכך שמיקום התאים הנגועים התפזר באופן אחיד על פני שדה הראייה. נקודת מפתח קשורה נוספת היא כי דילול titer הנגיף משפר את איכות הדמיית סידן. מניסיוננו, כמות מוגזמת של נגיף קשורה להופעתם של אשכולות דמויות גל של פעילויות, אשר עולה בקנה אחד עם דו"ח קודם23. בעוד שבתחילה חשדנו כי שאיבת רקמות עלולה להוביל לסילוק מוקדם מדי של הנגיף במקום ההזרקה ולביטוי לא מספק, לא צפינו בתופעה כזו, והפרוטוקול שלנו הניב בדרך כלל הדבקה חזקה של אזור המטרה. בהשוואה לעכברים טרנסגניים המבטאים GCaMP, גישת הנגיף היא בהכרח פחות עקבית אך מציעה שימוש גמיש יותר מכיוון שהיא אינה דורשת רבייה מסובכת. עם זאת, מכיוון שהביטוי של GCaMP עלול לזלוג למבני מוח סמוכים או להתפלג באופן לא אחיד באזור מוח היעד, בחינה זהירה של המיקומים האנטומיים של הנגיף והעדשה מהרקמה הקבועה היא קריטית לפירוש התוצאות. שילוב קווי Cre ספציפיים לאזור או לתא עם ביטוי GCaMP תלוי Cre עשוי לשפר את הספציפיות של אותות מצולמים.
נקודת המפתח השלישית של הפרוטוקול שלנו היא שבמהלך השתלת העדשה, חזרנו על החדרת העדשה ושטיפתה מספר פעמים כדי לוודא שאין שאריות דם באזור ההשתלה. זהו ניתוח מפתח כדי להקל על התאוששות רקמות ולשפר את שיעור ההצלחה של ההליך. בעוד שהמנגנון המדויק אינו ידוע, אנו משערים כי החדרת העדשה תגרום בהכרח נזק כלשהו לרקמה, ושלב השטיפה ינקה את הדימום הקשור לנזק זה. אחרת, הדימום הקשור להחדרה עלול לקחת זמן רב למוח להתנקות, מה שמגדיל את ההסתברות לדלקת מקומית וחדירת מקרופאגים, שניהם יפחיתו את האיכות האופטית. בנוסף, בקואורדינטות שסיפקנו בפרוטוקול זה, מצאנו כי הצבת העדשה מעט קרוב יותר לתפר הקשת גורמת בדרך כלל למספר מוגבר של תאים גלויים, אם כי חשוב להימנע מפירסינג לחדר השלישי. סיפקנו גם רשימה של בעיות נפוצות לפתרון טוב יותר של שלב זה (טבלה 1).
העכבר צריך להיות מאומן ללבוש את מיניסקופ דמה לפני ניסויים התנהגותיים כדי למזער את ההשפעה של משקל נוסף על הראש. בדרך כלל, אימון זה מתרחש ~ 3 ימים, כאשר כל מפגש נמשך 20 דקות. במהלך הניסויים ההתנהגותיים, יש לעקוב אחר מצבו הפיזי של העכבר באופן קבוע. הביצועים ההתנהגותיים של העכבר יושפעו מאוד מבריאותו.
פרוטוקול זה מכיל מספר מגבלות. ראשית, יש לציין כי הדמיית סידן היא תחליף לפעילות עצבית, אשר יכולה להיות מושפעת מביטוי החיישנים. שיטות הדמיה של פוטון אחד באמצעות מיניסקופ עשויות להוביל לאותות חופפים מתאים שכנים, הדורשים דה-ערבוב מניתוח עוקב. בנוסף, הפרוטוקול שלנו כולל ניתוחים פולשניים. גוש מרקמת המוח מוסר במהלך שלב השתלת עדשת GRIN, בדרך כלל כולל חלק מאזור CA1, קליפת המוח הרטרוספלנאלית וקליפת המוח הראייתית האסוציאטיבית. זה הכרחי בשל המגבלה של עומק ההדמיה שמאפשרת הארה של פוטון אחד. בתצפיות שלנו לא שמנו לב לליקויים התנהגותיים נראים לעין אצל העכברים לאחר הניתוח, לא בהתנהגויות הכלליות והבלתי מוגבלות שלהם ולא בלמידה של משימות המסלול הליניארי (איור משלים S1). לחילופין, השימוש במכשירים כירורגיים אוטומטיים לשאיבת רקמת המוח יכול להפחית את הטעויות הקשורות להפעלה ידנית, ובכך לשפר את הדיוק של ההליך הכירורגי24. יתר על כן, נתוני דימות הסידן שלנו באופן כללי הניבו דינמיקת סידן נורמלית. ההשפעה על תפקודים קוגניטיביים מורכבים יותר זקוקה לאפיון נוסף. שיטה חלופית להחדרת עדשה ללא שאיפת רקמות תוארה לפני25. זה מושג על ידי ביצוע חתך ברקמת המוח לאורך מערכת ההחדרה המיועדת והנחת העדשה ישירות דרך הפתח. מניסיוננו, גישה זו מובילה לקיפול או לעיוותים אחרים של רקמת המוח לאורך מערכת ההחדרה, שעדיין יכולים להיות פולשניים. השונות הגבוהה של העיוות הופכת גישה זו לפחות אמינה מהפרוטוקול שתיארנו. אזהרה אפשרית נוספת של הפרוטוקול שלנו היא שהביצועים ההתנהגותיים של העכבר מושפעים מעט מכבל הקואקס המחבר בין המיניסקופ לבין תיבת רכישת הנתונים של המיניסקופ (DAQ). זה לא רק בגלל החוטים מתפתלים יחד לאחר סיבובים רבים, אלא גם בגלל החוט יכול להיות מסיח דעת עבור העכבר במהלך המשימה. שימוש במיניסקופ אלחוטי26 יפתור ביעילות בעיה זו. 
למרות המגבלות הקיימות, אנו מאמינים שמתודולוגיה זו יכולה להועיל מאוד לחוקרים המעוניינים להשתמש בדימות סידן in vivo כדי לחקור דפוסי פעילות עצבית בבליטה המשוננת בהיפוקמפוס. לדוגמה, גישה זו של הדמיית סידן in vivo יכולה להיות מיושמת כדי לחקור תאי מקום במיוחד באזור הבליטה המשוננת. זה יאפשר לחקור כיצד תאי מקום מקודדים מידע על פני אזורי מוח שונים10,27. האימות שלנו מצביע על כך שפרוטוקול זה ניתן לשחזור סביר, עם שיעורי הצלחה גבוהים, וניתן ליישם אותו על אזורי מוח שונים.

מחקרים קודמים מצאו כי ההיפוקמפוס הוא מבנה מוחי חיוני לעיבוד ואחזור זיכרונות 1,2. מאז שנות ה-50 של המאה ה-20, המעגלים העצביים של ההיפוקמפוס במכרסמים התמקדו בחקר היווצרות, אחסון ושליפה של זיכרון3. המבנים האנטומיים בתוך ההיפוקמפוס כוללים את תת-האזורים של בליטה משוננת (DG), CA1, CA2, CA3, CA4 וסוביקולום4. קשרים דו-כיווניים מורכבים קיימים בין תת-אזורים אלה, מתוכם DG, CA1 ו-CA3 יוצרים מעגל טריסינפטי בולט המורכב מתאי גרגיר ותאים פירמידליים5. מעגל זה מקבל את הקלט העיקרי שלו מקליפת המוח האנטורינלית (EC) והיה מודל קלאסי לחקר פלסטיות סינפטית. מחקר in vivo קודם על תפקוד ההיפוקמפוס התרכז בעיקר ב- CA1 6,7 בשל הגישה הקלה יותר שלו. בעוד שתאי עצב מסוג CA1 ממלאים תפקידים חשובים ביצירת זיכרון, התגבשות ושליפה, במיוחד בתאי מקום לזיכרון מרחבי, תת-אזורים אחרים של ההיפוקמפוס חיוניים גם הם 8,9. בפרט, מחקרים אחרונים הדגישו את הפונקציות של DG בהיווצרות זיכרון. תאי מקום ב-DG דווחו כיציבים יותר מאלה שב-CA110, ופעילותם משקפת מידע ספציפי להקשר11. יתר על כן, תיוג תלוי פעילות של תאי גרגיר DG יכול להיות מופעל מחדש כדי לגרום להתנהגויות הקשורות לזיכרון12. לכן, כדי להשיג הבנה עמוקה יותר של קידוד המידע ב-DG, חיוני לחקור את הפעילויות של תת-אזור ה-DG בזמן שהחיה מבצעת משימות תלויות זיכרון.
מחקרים קודמים של פעילויות DG שימשו בעיקר אלקטרופיזיולוגיה vivo 13. עם זאת, טכניקה זו יש כמה חסרונות: ראשית, בהקלטות חשמליות, ייתכן שיהיה קשה לזהות ישירות את סוגי התאים השונים המייצרים את האות. האותות המוקלטים הם מתאים מעכבים ומעוררים. לכן, שיטות עיבוד נתונים נוספות נדרשות כדי להפריד בין שני סוגי תאים אלה. יתר על כן, קשה לשלב מידע אחר על סוג התא, כגון תת-קבוצות ספציפיות להקרנה או תיוג תלוי פעילות, עם הקלטות חשמליות. בנוסף, בשל המורפולוגיה האנטומית של DG, אלקטרודות ההקלטה מושתלות לעתים קרובות בכיוון אורתוגונלי, אשר מגביל מאוד את מספר הנוירונים שניתן להקליט. לכן, קשה להקלטות חשמליות להשיג ניטור של מאות נוירונים בודדים ממבנה DG באותה חיה14.
טכניקה משלימה לרישום פעילויות נוירונים ב- DG היא להשתמש ב- in vivo הדמיית סידן15. יוני סידן חיוניים לתהליכי איתות תאיים באורגניזמים, והם ממלאים תפקיד מכריע בתפקודים פיזיולוגיים רבים, במיוחד במערכת העצבים של יונקים. כאשר תאי עצב פעילים, ריכוז הסידן התוך-תאי עולה במהירות, מה שמשקף את האופי הדינמי של הפעילות העצבית והעברת האותות. לכן, רישום השינויים בזמן אמת ברמות הסידן התוך-תאי בתאי העצב מספק תובנות חשובות לגבי מנגנוני הקידוד העצביים.
טכנולוגיית דימות סידן משתמשת בצבעים פלואורסצנטיים מיוחדים או במדדי סידן מהונדסים גנטית (GECIs) כדי לנטר ריכוזי יוני סידן בנוירונים על ידי זיהוי שינויים בעוצמת הפלואורסצנטיות, אשר לאחר מכן ניתן ללכוד באמצעות הדמיה מיקרוסקופית16. בדרך כלל משתמשים במשפחת GCaMP של גנים לאינדיקטור סידן, הכוללת חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP), קלמודולין ורצפי פוליפפטיד M13. GCaMP יכול לפלוט פלואורסצנטיות ירוקה כאשר הוא נקשר ליוני סידן17, מה שמאפשר לתנודות בפלואורסצנטיות הירוקה להירשם באמצעות הדמיה18. בנוסף, כדי לקבל תמונות ברורות של אזור המטרה במוח, עדשת אינדקס הדרגתי (עדשת GRIN) מושתלת בדרך כלל מעל האזור המעניין. עדשת GRIN מאפשרת הדמיה של אזור עמוק במוח שלא ניתן לגשת אליו ישירות מפני השטח.
קל יחסית לשלב טכניקה זו עם כלים גנטיים אחרים כדי לתייג סוגי תאים שונים. יתר על כן, מכיוון שמישור ההדמיה מקביל להתמצאות התאים ב-DG, מאות תאי עצב נגישים לדימות בכל ניתוח מוצלח. בעבודה זו אנו מציגים פרוטוקול ניתוח מלא ומפורט להדמיית סידן in vivo בבליטה המשוננת בעכברים (איור 1). ההליך כולל שתי פעולות עיקריות. הראשון הוא להזריק את וירוס AAV-CaMKIIα-GCaMP6f לתוך DG. הפעולה השנייה היא השתלת עדשת GRIN מעל אתר הזרקת הנגיף. שני הליכים אלה מתנהלים באותה ישיבה. לאחר ההחלמה מניתוחים אלה, השלב הבא הוא לבדוק את איכות ההדמיה באמצעות מיקרוסקופים ממוזערים (מיניסקופים). אם בשדה ההדמיה יש מאות תאים פעילים, ההליך הבא הוא לחבר את לוחית הבסיס של המינסקופ לגולגולת העכבר באמצעות מלט דנטלי; לאחר מכן ניתן להשתמש בעכבר לניסויי הדמיה. כמו כן, אנו מציגים צנרת עיבוד מקדים מבוססת MATLAB לייעול ניתוח נתוני הסידן שנאספו.

<table><tbody><tr><td>200 &mu; L קצות פיפטה אוניברסליות</td><td>Transcat Pipettes</td><td>1030-260-000-9</td><td>להסרת הדם והמלח</td></tr><tr><td>25 G מחט קהה מנעול luer (טיפים לחלוקה מראש)</td> <td>iSmile</td><td>20-0105</td><td>להסרת רקמת המוח</td></tr><tr><td>כובע מגן מודפס בתלת מימד</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>להגנה על עדשת GRIN</td></tr><tr><td>75% אתנול</td><td>שנחאי Hushi ציוד מעבדה ושות', בע"מ</td><td>bwsj-230219105303</td><td>לחיטוי וניקוי משטח עדשת GRIN</td></tr><tr><td>AAV2/9-CaMKII&alpha;-GCaMP6f וירוס</td><td>נרתיק מוח</td><td>BC-0083</td><td>להזרקה ויראלית</td></tr><tr><td>Adobe Illustrator</td><td>Adobe</td><td>cc 2018 גרסה 22.1</td><td>כדי לצייר דמויות</td></tr><tr><td>משאבת אוויר הרדמה</td><td>RWD מדעי החיים ושות', בע"מ</td><td>R510-30</td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>תוכנת בקרת מצלמה</td><td>Daheng הדמיה</td><td>גלקסי Windows SDK_CN (V2)</td><td>לרישום הנתונים ההתנהגותיים</td></tr><tr><td>מחזיקי צינורית/טבעת קרמית (מחזיק עדשות GRIN)</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68214</td><td>להחזיק את עדשת ה-GRIN</td></tr><tr><td>קרפרופן</td><td>MedChemExpress</td><td>53716-49-7</td><td>להפחתת כאב לאחר הניתוח של העכבר&nbsp;</td></tr><tr><td>כבל קואקס</td><td>פתוח ephys</td><td>CW8251</td><td>לחיבור המינסקופ והמיניסקופ DAQ תיבת</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ קונפוקלי</td><td>אולימפוס מדעי החיים&nbsp;</td><td>FV3000</td><td>להתבוננות בפרוסות המוח</td></tr><tr><td>צמר גפן</td><td>Nanchang Xiangyi Medical Devices Co., Ltd</td><td>20202140438</td><td>לחיטוי</td></tr><tr><td>לוח ראש מותאם אישית</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>להחזקת העכבר על גלגל הריצה</td></tr><tr><td>מחזיק לוחית ראש מותאם אישית</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>כדי להחזיק את לוחית הראש של העכבר</td></tr><tr><td>תותבות בסיס matierlals (ריפוי עצמי)</td> <td>New Centry Dental</td><td>430205</td> לחיבור קרם האפילציה <td>של המיניסקופ</td></tr><tr><td></td><td>Veet</td><td>ASIN: B001DUUPQ0</td><td>להסרת שיער העכבר</td></tr><tr><td>סטריאוטקסי דיגיטלי שולחני במבנה, SGL M</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>68803</td><td>להזרקה ויראלית והשתלת עדשות GRIN</td></tr><tr><td>Dexamethasone</td><td>Huachu Co., Ltd.</td><td>N / A</td><td>למניעת דלקת לאחר הניתוח של</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ ניתוח</td><td>העכבר RWD Life Science Co., Ltd</td><td>MZ62-WX</td><td>להתבוננות בתנאים במהלך ניתוחים</td></tr><tr><td>מיכל מסנן גז, גדול, חבילה של 6</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-31-6</td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>עדשת</td><td>GRIN GoFoton</td><td>CLHS100GFT003</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>עדשת</td> <td>GRINInFocus Grin Corp</td><td>SIH-100-043-550-0D0-NC</td><td>להשתלת עדשת GRIN</td></tr><tr><td>אינדוקציה תא עכבר (15 ס"מ x 10 ס"מ x 10 ס"מ</td>) <td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>V100</td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>מצלמה תעשייתית</td><td>Daheng הדמיה</td><td>MER-231-41U3M-L, VS-0618H1</td><td>לרכישת הנתונים ההתנהגותיים</td></tr><tr><td>Iodophor חיטוי חומר</td><td>צ'ינגדאו Hainuo Innovi חיטוי טכנולוגיה ושות', בע"מ</td><td>8861F6DFC92A</td><td>לחיטוי</td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>R510-22-10</td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>צינור איסוף דגימות נוזליות (מיקרופיפטה נימי זכוכית עבור Nanoject III)</td> <td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-203-G/X</td><td>להזרקה ויראלית</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>R2021b</td><td>לניתוח הנתונים</td></tr><tr><td>Microdrill</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>78001</td><td>לקרניוטומיה</td></tr><tr><td>חולץ מיקרופיפטה</td><td>Narishige International USA</td><td>PC-100</td><td>למשיכת צינור איסוף הדגימה הנוזלית</td></tr><tr><td>שמן מינרלי</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8410</td><td>להזרקה ויראלית</td></tr><tr><td>Miniscope DAQ Software</td><td>Github (Aharoni-Lab/Miniscope-DAQ-QT-Software)</td> <td>N/A</td><td>להקלטת נתוני הדמיית הסידן</td></tr><tr><td>Miniscope Data Acquisition (DAQ) Box (V3.3)</td><td>Open ephys</td><td>V3.3</td><td>כדי לרכוש את נתוני הדמיית הסידן</td></tr><tr><td>Miniscope V4</td><td>Open ephys</td><td>V4</td><td>להדמיית סידן in vivo</td></tr><tr><td>לוחית בסיס Miniscope V4 (גרסה 2)</td><td>Open ephys</td><td>Variant 2</td><td>להחזקת המיניסקופ</td></tr><tr><td>nanoject III מזרק ננוליטר לתכנות</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-207</td><td>להזרקה ויראלית</td></tr><tr><td>משחת עיניים</td><td>Cisen Pharmaceutical Co., בע"מ.</td><td>H37022025</td><td>כדי לשמור על לחות העיניים</td></tr><tr><td>צינור PCR</td><td>LabServ</td><td>309101009</td><td>לדילול הווירוס</td></tr><tr><td>מחשב אישי (ThinkPad)</td><td>Lenovo</td><td>20W0-005UCD</td><td>כדי להקליט את נתוני הדמיית הסידן ונתוני ההתנהגות</td></tr><tr><td>גלגל ריצה</td><td>Shanghai Edai Pet Products Co., Ltd</td><td>NA-H115</td><td>להחזקת העכבר בעת הדבקת לוחית הבסיס</td></tr><tr><td>מברג (ברגים M1.6)</td><td>צמחייה (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td> <td>60902</td><td>כדי לשחרר את ברגי M1.6</td></tr><tr><td>מברג (סט ברגים)</td> <td>ירק (Yantai Greenery Tools Co., Ltd)</td> <td>S2</td><td>לשחרור ברגי הסט</td></tr><tr><td>בורג</td><td>סט TBD</td><td>2-56 בורג סט נקודת חרוט</td><td>להדק את המינסקופ לצלחת הבסיס שלו</td></tr><tr><td>מכונת הרדמה לבעלי חיים קטנים</td><td>RWD מדעי החיים ושות', בע"מ</td><td>R500</td><td>להרדמה</td></tr><tr><td>מזרק סטרילי</td><td>ג'יאנגסו גרייט וול ציוד רפואי ושות', בע"מ</td><td>20163140236</td><td>לשטיפת הדם</td></tr><tr><td>מספריים כירורגיים</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>S14016-13</td><td>לחיתוך השיער והקרקפת</td></tr><tr><td>בקר טמפרטורת ThermoStar, 69025 כרית כולל.</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>69027</td><td>לשמירה על טמפרטורת הגוף של החיה</td></tr><tr><td>מלקחיים עדינים במיוחד</td><td>RWD Life Science Co., Ltd</td><td>F11020-11</td><td>להסרת פסולת העצם וכבל USB</td></tr><tr><td>3.0</td><td>פתח את ephys</td><td>N/A</td><td>כדי לחבר את תיבת ה-DAQ של המיניסקופ ואת אור ה-UV של המחשב</td></tr><tr><td></td><td>Jinshida</td><td>66105854002</td><td>כדי לתקן את עדשת ה-GRIN על הגולגולת</td></tr><tr><td>שרף UV (דבק לריפוי קל)</td> <td>Loctite</td><td>32268</td><td>לקיבוע עדשת ה-GRIN על הגולגולת</td></tr><tr><td>משאבת ואקום</td><td>Kylin-Bell</td><td>GL-802B</td><td>להסרת הדם, המלח ורקמת המוח</td></tr></tbody></table>

in vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

In Vivo Calcium Imaging of Granule Cells in the Dentate Gyrus of Hippocampus in Mice

גישות בזמן אמת נדרשות בדרך כלל במחקרים של למידה וזיכרון, והדמיית סידן in vivo מספקת את האפשרות לחקור פעילות עצבית אצל בעלי חיים ערים במהלך משימות התנהגות. מאחר שההיפוקמפוס קשור קשר הדוק עם זיכרון אפיזודי ומרחבי, הוא הפך לאזור חיוני במוח במחקר של תחום זה. במחקר שנערך לאחרונה, תאי אנגרמה ותאי מקום נחקרו על ידי רישום הפעילות העצבית באזור CA1 בהיפוקמפוס באמצעות מיקרוסקופ זעיר בעכברים תוך ביצוע משימות התנהגותיות כולל שדה פתוח ומסלול ליניארי. למרות שהבליטה המשוננת היא אזור חשוב נוסף בהיפוקמפוס, היא נחקרה רק לעתים רחוקות עם הדמיה in vivo בשל עומקה הגדול יותר וקושי ההדמיה. בפרוטוקול זה, אנו מציגים בפירוט תהליך הדמיית סידן, כולל כיצד להזריק את הנגיף, להשתיל עדשת GRIN (Gradient-index) ולחבר לוחית בסיס להדמיית הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס. בהמשך אנו מתארים כיצד לעבד מראש את נתוני הדמיית הסידן באמצעות MATLAB. נוסף על כך, מחקרים על אזורים עמוקים אחרים במוח שדורשים הדמיה עשויים להפיק תועלת משיטה זו.

איור 1 מראה את הסכמות של הליך הניסוי, כולל הזרקת וירוסים, השתלת עדשת GRIN, הצמדת לוחית בסיס, הדמיית סידן in vivo באמצעות מיניסקופ ועיבוד נתונים. בדרך כלל, ההליך כולו לוקח חודש אחד. איור 2 מציג הליכים לדוגמה של הזרקת וירוסים, כולל מיקום החור שנקדח על הגולגולת ומצב רקמת המוח לפני השתלת עדשת GRIN.
איור 3 מראה את תהליך הסרת רקמת המוח, שהוא חיוני להצלחת הניתוח הזה. ככל שיותר רקמה נשאבת, שכבות רקמה שונות הופכות גלויות. שלב יניקה זה ניתן לעצור ברגע שכבה אפורה, רפלקטיבי הוא ציין.
איור 4 מראה את תהליך השתלת ה-GRIN, כולל החדרת עדשת ה-GRIN, הדבקת לוחית הראש על הגולגולת וכיסוי עדשת ה-GRIN בכובע מותאם אישית. איכות ההדמיה של הדמיית הסידן in vivo תלויה בהצלחת הזרקת הנגיף והשתלת עדשת GRIN.
איור 5 מראה ארבעה סוגים של תוצאותמהדמיית סידן in vivo.איור 5A הוא התוצאה הלא מוצלחת; לא נצפו תאים פעילים בשדה הראייה של ההדמיה. איור 5B-D הן תוצאות מוצלחות. באיור 5B יש פחות מ-10 תאים פעילים, אולם אין כלי דם ברורים. איור 5C מכיל יותר מ-50 תאים פעילים וכלי דם נראים. באיור 5D ישנם מאות תאים פעילים בשדה הראייה של ההדמיה; במקביל, ראינו כלי דם ברורים. הדמיית סידן in vivo באיכות גבוהה כוללת בדרך כלל מאות תאים פעילים. פחות מתריסר תאים פעילים נחשבים כלא אופטימליים לתוצאות הדמיה. בדרך כלל, מספר התאים נמצא בקורלציה עם קוטר עדשת GRIN וכן עם החלק של אזור המוח. קוטר גדול יותר של עדשת GRIN ואזור מוח קרוב יותר לצד הגבי יגדילו את ההסתברות לצפות בתאים פעילים יותר. חשוב גם לציין שככל שקוטר עדשת GRIN גדול יותר, כך היא גורמת יותר נזק למוח העכבר; לכן, בחירת הגודל המתאים היא קריטית. השתלת עדשת GRIN בקוטר 1 מ"מ אינה משפיעה על יכולתה של החיה לרכוש את התנהגות המסלול הליניארי (איור משלים S1).
נתוני התנהגות והדמיית סידן מעובדים בדרך כלל בנפרד. ניתן לתייג נתוני התנהגות של עכבר באופן ידני או לעבד אותם באמצעות תוכנת ניתוח קוד פתוח. נתוני הדמיית סידן מעובדים באמצעות Non-Rigid Motion Correction (NoRMCorre) ו-EXTRACT ב-MATLAB. איור 6 מראה את התאים הבודדים שחולצו על גבי שדה הראייה, ומראה חמש עקבות סידן מייצגות מהקלטה מוצלחת של הדמיית סידן in vivo . ראה סרטון משלים S1 לקבלת סרטון מייצג של הנתונים הגולמיים.
אימות כי השתלת עדשת GRIN והזרקה ויראלית מתרחשות באזור המוח המיועד הוא השלב האחרון והוא גם חשוב מאוד לפרשנות הנתונים. איור 7 הוא פרוסת מוח של עכבר שמראה את המיקום של ביטוי GCaMP6f (האזור הפלואורסצנטי הירוק) ואת המסלול של עדשת GRIN.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמה של הליכי הזרקת וירוסים והשתלת עדשת GRIN. (A) הזריקו את נגיף AAV-CaMKIIα-GCaMP6f בבליטה המשוננת. (B) השתילו את עדשת ה-GRIN מעל הבליטה המשוננת. (C) לבדוק את איכות ההדמיה לאחר הניתוח. (D) הצמידו את לוחית הבסיס של המיניסקופ לאחר הבדיקה. (ה) ציר הזמן והתהליך של הפרוטוקול כולו. קיצור: GRIN = אינדקס הדרגתי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig02.jpg"> איור 2: תצוגה כירורגית מייצגת במהלך הזרקת הנגיף. (A) הניחו את העכבר על המנגנון הסטריאוטקסי. (B) סמן את אזור השתלת עדשת GRIN (האזור השחור). (C) קרניוטומיה באזור המטרה. (D) להזריק 240 nL של וירוס לתוך הבליטה המשוננת. (E) הסר את המיקרופיפטה לאחר ההזרקה. (F) הסר את קליפת המוח וחלק מרקמת המוח CA1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig03.jpg"> איור 3: מבט כירורגי מייצג במהלך שאיפת רקמת המוח. (A) האזור המוקף בטוש השחור מלוטש באמצעות מיקרו-מקדחה, ומשאיר אחריו (B) רקמת קליפת המוח חשופה חלקית. החלק השמאלי מראה קליפת מוח חשופה והחלק הימני מכוסה ברקמת דורה וגולגולת. (C) תמונה מייצגת במהלך השאיפה של רקמת המוח בקליפת המוח. הרקמה נשארת ורודה חיוורת. (D) חומר לבן נראה בתוך שדה הראייה, כפי שמצוין על ידי החץ הלבן. (E) יניקה נוספת חשפה משטח אפור-אדום כהה, מחזיר אור מתחת לחומר הלבן. האזור (חץ שחור) נחשב למשטח CA1 והיניקה לא אמורה להעמיק. (F) לא נראה יותר דימום מהאזור לאחר שטיפה במי מלח מספר פעמים. בכל הפאנלים, הכוכביות מציינות כלי ניתוח: מחט קהה 30 G למלח ומחט 25 G קהה לשאיפת רקמת מוח. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig04.jpg"> איור 4: הליך לדוגמה להשתלת עדשת GRIN ולחיבור לוחית בסיס. (A) השתילו את עדשת ה-GRIN ברקמת המוח באמצעות מחזיק עדשת GRIN. (B) להדביק את עדשת GRIN במיקום הנכון עם שרף UV; החלק המחזיר מייצג את שרף UV. (C) חבר את לוחית הראש על גולגולת העכבר באמצעות שרף UV. (D) כסו את עדשת GRIN במכסה מגן מודפס בתלת-ממד. (ה) לבדוק את איכות הניתוח. המיניסקופ נקבע על ידי מחזיק. (F) מרחו את חומרי הבסיס של התותבות סביב לוח הבסיס. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig05.jpg"> איור 5: תוצאות הדמיה מוצלחות ולא מוצלחות. (A) תוצאה לא מוצלחת של הדמיית סידן in vivo . אין תאים פעילים ב-A ובאזורים רבים יש כתמי דם כהים כפי שמצוין על ידי החיצים השחורים. (ב-ד) תוצאות מוצלחות של הדמיית סידן in vivo . (B) ניתן לצפות בפחות מ-10 תאים פעילים, אך אין כלי דם משמעותיים בתחום ההדמיה. (C) ניתן לצפות ביותר מ-50 תאים פעילים וכלי דם משמעותיים. (D) ניתן לצפות במאות תאים פעילים וכלי דם משמעותיים יותר. העיגולים המקווקווים מייצגים את שדה הראייה של ההדמיה. החצים הירוקים מייצגים את התאים המבטאים GCaMP6f. החיצים האדומים מייצגים את כלי הדם. פסי קנה מידה = 250 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig05large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig06.jpg"> איור 6: נתוני דימות סידן מייצגים in vivo מעכבר שרץ על המסילה הליניארית. (A) שדה ההדמיה של הקלטת ההקלטה על ידי המיניסקופ, מספר התא הכולל = 227. (B) עקבות סידן מייצגות. מיקומי התא מוצגים באותו צבע ב-A. (C) מטלה התנהגותית: מסלול ליניארי עם תגמולי מים בשני קצותיו. (ד) תוצאה מייצגת של ניתוח התנהגותי של פעילות העכבר; זמן כולל = 100 שניות. קווים אנכיים כחולים מציינים נקודות זמן של התנהגות הליקוק. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66916/66916fig07.jpg"> איור 7: מקטעי רקמת מוח מעכברים לאחר ניתוח. (A,B) שתי דוגמאות לרקמות מוח של עכבר. האזורים המלבניים המקווקווים מציינים את נתיב השתלת עדשת GRIN. הקווים המעוקלים מייצגים את הבליטה המשוננת בהיפוקמפוס. פסי קנה מידה = 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916fig07large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>בעיה</td>
			<td>סיבה אפשרית</td>
			<td>תמיסה</td>
		</tr><tr><td>שדה ההדמיה נראה כהה או שחור.</td>
			<td>יש כמות משמעותית של דם שיורי בחלק התחתון של עדשת GRIN.</td>
			<td>לפני השתלת עדשת GRIN, תמיסת המלח משמשת לשטיפה רציפה של פני השטח של אתר הניתוח עד שכבר אין דימום שניתן להבחין בו.</td>
		</tr><tr><td rowspan="5">ישנם כלי דם גלויים בבירור בשדה ההדמיה, אך אין פעילות עצבית ניכרת.</td>
			<td>1. ביטוי הנגיף היה לא אופטימלי או גרוע.</td>
			<td>1. מומלץ לבדוק את הדברים הבאים:</td>
		</tr><tr><td>2. מיקום ביטוי הנגיף הנצפה אינו תואם את המיקום בו הושתלה עדשת ה- GRIN (בדרך כלל, מיקום ההשתלה של עדשת GRIN רדוד מדי בהשוואה למיקום הרצוי).</td>
			<td>a. ודא שתנאי אחסון הווירוסים מתאימים.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>b. ודא שמיקום הזרקת הווירוסים נכון.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>ג. לוודא שריכוז הנגיף מתאים.</td>
		</tr><tr><td></td>
			<td>2. במהלך ההליך הכירורגי הבא, ניתן להגדיל את עומק השתלת עדשת GRIN בהתאם, ולרשום בקפידה את העומק המדויק בכל פעם שהניסוי מתבצע.</td>
		</tr><tr><td rowspan="2">שדה ההדמיה מראה כמה דפוסים אזוריים של פעילות עצבית, אך אין פעילות נראית בבירור ברמת התא הבודד.</td>
			<td>1. נפח הנגיף המוזרק היה גבוה מדי.</td>
			<td>1. לדלל את הנגיף או להקטין את נפח הזרקת הנגיף.</td>
		</tr><tr><td>2. מיקום ביטוי הנגיף אינו תואם את מיקום עדשת ה-GRIN (בדרך כלל, עדשת ה-GRIN מושתלת בעומק רדוד יותר מהמיקום האופטימלי לביטוי הנגיף).</td>
			<td>2. במהלך ההליך הכירורגי הבא, ניתן להגדיל את עומק השתלת עדשת GRIN בהתאם, ולרשום בקפידה את העומק המדויק בכל פעם שהניסוי מתבצע.</td>
		</tr><tr><td>ישנם תאים מסוימים בשדה ההדמיה השומרים על אות פלואורסצנטי בהיר באופן עקבי בכל עת, ואין שינוי בעוצמת הפלואורסצנטיות הזו.</td>
			<td>הנגיף מתבטא יתר על המידה בתוך תא יחיד.</td>
			<td>לדלל את הנגיף או להקטין את נפח הזרקת הנגיף.</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: תרשים פתרון בעיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
איור משלים S1: רכישה תקינה של מטלת הזיכרון המרחבי על-ידי עכברים שעברו ניתוח. הגרף מציג את כימות מספר הניסויים שהושלמו בהפעלה של 20 דקות בכל יום. הנתונים מיוצגים כממוצע ± SEM. N = 3 עכברים בקבוצת הניתוח ו-4 בקבוצת ללא ניתוח. ANOVA דו-כיווני שימש להשוואה סטטיסטית. קיצור: ns = לא משמעותי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Figure%20S1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
וידאו משלים S1: נתונים גולמיים מייצגים של הדמיית סידן ב- DG. סרטון זה מדגים פעילות סידן במשך 5 דקות. הסרטון מופעל במהירות של פי 10 מהמהירות המקורית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20Video%20S1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: עיצוב לוחית הראש. קובץ זה מתאר את השרטוט הדו-ממדי של עיצוב לוחית הראש. הייצור של לוחית הראש כרוך חיתוך של נירוסטה על פי השרטוט. יש להקיש על שני החורים הקטנים בסרגל הצד באמצעות חוטי M1.6. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: עיצוב מכסה המגן המודפס בתלת מימד. קובץ זה מספק את ה-gcode של פרוסות מכסה המגן שניתן להשתמש בהן במדפסת תלת-ממד. בפרוטוקול זה השתמשנו בפלסטיק חומצה פולילקטית כחומר גלם להדפסה. החורים הקטנים בצד תואמים את מיקומם של החורים המודבקים על לוחית הראש להתקנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: עיצוב מחזיק המינסקופ. קובץ זה מספק את ה-gcode של פרוסות מחזיק המיניסקופ שניתן להשתמש בהן במדפסת תלת-ממד. החור הגלילי משמש להתקנה למחזיק סטריאוטקסי עם בורג M4. החורים בצד נועדו להוסיף ברגים להידוק, אך ניתן להשתמש במחזיק ללא תכונה זו. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/Supplemental%20File%203.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 4: קוד בקרה של Arduino וסקריפטים לעיבוד מקדים של וידאו להדמיית סידן גולמי. קובץ זה מכיל את הסקריפטים לשליטה בארדואינו ואת הקוד לעיבוד מראש של נתוני הדמיית סידן. קוד הארדואינו שולט במערך ההתנהגות שבו העכבר לומד ללקק תמורת תגמולי מים בקצוות מתחלפים של מסלול ליניארי. עם למידת המשימה, העכברים ירוצו שוב ושוב הלוך ושוב על המסלול. קוד העיבוד המקדים של הדמיית הסידן מבצע המרת פורמט קובץ, תיקון תנועה, דגימת מטה מרחבית וחילוץ אותות תאים מהנתונים שנאספו על ידי המיניסקוף. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66916/66916_Supplemental%20File%204.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

הבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס מבצעת תפקידים חיוניים ומובחנים בלמידה ובזיכרון. פרוטוקול זה מתאר סדרה של הליכים חזקים ויעילים להדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת בעכברים הנעים בחופשיות.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים 

Real-time approaches are typically needed in studies of learning and memory, and in vivo calcium imaging provides the possibility to investigate neuronal ...

in-vivo-calcium-imaging-granule-cells-dentate-gyrus-hippocampus

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

כדי להבין את הדינמיקה של הרשת microcircuits ב הניאוקורטקס, חיוני להקליט בו זמנית את הפעילות של מספר גדול של נוירונים. In-vivo שני הפוטונים הדמיה סידן היא השיטה היחידה המאפשרת להקליט את הפעילות העצבית של אוכלוסייה צפופה עם רזולוציה של תא בודד.

In vivo 2-Photon סידן הדמיה ב Layer 2 / 3 של עכברים

מקור: Shannonhouse, J.,  et al. In vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גב שלמים. J. Vis. Exp. (2023). הסרטון מדגים טכניקת הדמיית סידן in vivo לניטור פעילות עצבית בגרעיני השורש הגבי (DRG) של עכבר טרנסגני. נוירונים DRG מבטאים אינדיקטור סידן המגביר את עוצמת הקרינה בעת הקישור לסידן. גירויים מכניים או תרמיים המופעלים על כפה אחורית מייצרים פוטנציאל פעולה המתפשט ל-DRG, גורם לזרימת סידן בתאי העצב וכתוצאה מכך פליטת פלואורסצנטיות מוגברת.

הדמיית סידן in vivo של הרכבים עצביים בגרעיני השורש הגבי השלמים של עכבר

מקור: Calvo-Rodríguez,  et al. דימות פלואורסצנטי וביו-לומינסנציה של Ca תת-תאי2+ בנוירונים היפוקמפוס מזדקנים. J. Vis. exp.} (2015).  סרטון זה מדגים את השימוש בהדמיה פלואורסצנטית למדידת רמות סידן ציטוזולי בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך. על ידי השוואה בין נוירונים צעירים ומבוגרים, הוא מדגיש כיצד צפיפות מוגברת של תעלות סידן מגודרות מתח מסוג L והפעלה ממושכת בתאי עצב מזדקנים גורמים לעומס יתר של סידן, סימן היכר של הזדקנות עצבית. אינדיקטורים לסידן פלואורסצנטי חושפים את ההבדלים הללו באמצעות...

הדמיית סידן במבחנה בתרביות היפוקמפוס של חולדות לטווח קצר וארוך

מקור: Lee, H. et. al., הדמיית סידן מוצלחת in vivo עם מיקרוסקופ ממוזער המותקן על הראש באמיגדלה של עכבר שמתנהג בחופשיות. J. Vis. Exp. (2020)סרטון זה מדגים הדמיית סידן in vivo בעכבר באמצעות מקדם שבירה שיפוע, או עדשת GRIN, ומיקרוסקופ ממוזער. המערך משלב קיבוע ראש בתוך מערכת כלובים ניידת ללא חיכוך, מגרה נוירונים ומעורר זרם יוני סידן. עדשת GRIN לוכדת איתות סידן במוח, ומאפשרת הדמיה בזמן אמת של פעילות עצבית.

הדמיית סידן מיקרואנדוסקופית בזמן אמת בעכבר הנע בחופשיות

כאן אנו מציגים כיצד לחשוף את גנגליון geniculate של עכבר מעבדה חי, מרדים וכיצד להשתמש הדמיית סידן כדי למדוד את התגובות של הרכבים של נוירונים אלה לטעום גירויים, המאפשר ניסויים מרובים עם ממריצים שונים. זה מאפשר השוואות מעמיקות של אילו נוירונים מגיבים לאו תיוהמים.

In vivo סידן הדמיה של עכבר גניציה גנגליון נוירון תגובות לגירויים טעם

אנו מציגים פרוטוקול לחשוף את גזע המוח של עכבר בוגר מהצד הגחוני. באמצעות עדשת מדד שבירה הדרגתית עם מיקרוסקופ מיניאטורי, ניתן להשתמש בהדמיית סידן כדי לבחון את הפעילות של סומטה עצבית זית נחותה ב- vivo.

אין ויוו הדמיית סידן בעכבר זית נחות

הדמיית סידן in vivo של Miniscope in vivo היא טכניקה רבת עוצמה לחקר דינמיקה עצבית ומיקרו-מעגלים בעכברים המתנהגים בחופשיות. פרוטוקול זה מתאר ביצוע ניתוחי מוח להשגת הדמיית סידן in vivo טובה באמצעות מיניסקופ.

הזרקה נגיפית סטריאוטקסית והשתלת עדשה בעלת אינדקס שיפוע להדמיית סידן עמוקה במוח In Vivo

פרוטוקול זה מתאר את החשיפה הכירורגית של גנגליון השורש הגבי (DRG) ואחריו GCaMP3 (אינדיקטור Ca2+ מקודד גנטית; חלבון פלואורסצנטי ירוק-קלמודולין-M13 חלבון 3) Ca2+ הדמיה של הרכבים עצביים באמצעות עכברי Pirt-GCaMP3 תוך הפעלת מגוון גירויים על הכף האחורית ipsilateral.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעיני שורש גבי שלמים

הפרוטוקול הנוכחי מתאר הדמיית סידן in vivo למדידת התגובות של הרכבים של נוירונים מותניים-6 DRG לגירויים סומטיים וקרביים. ניתן לבצע השוואות יסודיות בין נוירונים המגיבים לגירויים שונים. פרוטוקול זה הוא בעל ערך לחקירת מנגנונים של כאב קרביים וגירוי סומטי, כגון דיקור סיני.

ב Vivo הדמיית סידן של תגובת נוירוני גרעיני השורש הגבי לגירויים סומטיים וקרביים

מדדי סידן מקודדים גנטית (GECI) מאפשרים ניתוח חזק ברמת האוכלוסייה של איתות נוירונים חושי. כאן, פיתחנו גישה חדשנית המאפשרת הדמיית GECI in vivo של פעילות גרעיני גרעינים של חולדות.

In-Vivo הדמיית סידן של נוירונים חושיים בגנגליון טריגמינלי של חולדה

פרוטוקול זה מתאר הדמיית סידן in vivo GCaMP של נוירונים שלמים של גנגליון טריגמינלי (TG). תיאור זה כולל ניתוח חשיפה ל-TG, הדמיית מיקרוסקופיה קונפוקלית in vivo של נוירונים TG, יישום גירויים סומטיים במהלך הדמיה מיקרוסקופית של נוירונים TG וניתוח נתוני הדמיית סידן in vivo GCaMP.

ב Vivo הדמיית סידן של הרכבים עצביים ברשתות של נוירונים חושיים ראשוניים בגרעינים טריגמינליים שלמים

למד הדמיית סידן in vivo של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים נעים באופן חופשי. הפרוטוקול משלב הזרקת וירוס והשתלת עדשת GRIN בשלב כירורגי אחד לשיפור איכות הנתונים והדיוק בחקר קידוד עצבי וייצוגים מרחביים בקוגניציה.

In Vivo הדמיית סידן של תאי גרגירים בבליטה המשוננת של ההיפוקמפוס בעכברים

גלה סרטונים נוספים