שימוש באוליגונוקלאוטידים סינתטיים שעברו שינוי כדי להעריך אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין
5 ביולי 2024
כאן מוצג פרוטוקול לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין, תוך שימוש בדוגמאות של אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים פלואורסצנטית ולא מסומנים שניתן לשלב ליצירת דופלקסים המחקים נזקי RNA ו/או DNA או מתווכי מסלול, ומאפשרים אפיון התנהגות אנזימים.
אז קבוצת המחקר שלי, אנחנו באמת מתעניינים באנזימים המעורבים בשכפול ותיקון דנ"א. בפרט, אנו חוקרים אנזימים ממיקרואורגניזמים קיצוניים וגם מפתוגנים מאחר שאנו רוצים להבין כיצד האנזימים האלה מאפשרים לאורגניזמים האלה לשרוד אתגרים סביבתיים. אנחנו מתעניינים גם בתפקוד הביולוגי של האנזימים וגם ביישומים הביוטכנולוגיים.
אז אנחנו עובדים הרבה עם ליגאזות דנ"א ורנ"א, ולאחרונה ביססנו את התפקיד של סוג מינימלי של ליגאז דנ"א שנראה כאילו הוא מועבר אל מחוץ לתא חיידקי. וקבענו שזה משחק תפקיד בהיווצרות ביופילם בפתוגן Neisseria gonorrhoeae. כמו כן, יחד עם שותפינו מ-ArcticZymes אפיינו ליגאז RNA-to-DNA חדשני המסוגל לחבר מתאמי דנ"א לשני קצותיה של פיסת רנ"א.
לכן משתפי הפעולה שלנו ב-ArcticZymes, שגם תרמו לפרוטוקול הזה, מאפיינים אנזימים שונים למטבוליזם של דנ"א ורנ"א שיש להם יישומים פוטנציאליים בביולוגיה מולקולרית. ולכן הם משתמשים בסוג זה של פרוטוקול כצעד ראשון להבנת ספקטרום הפעילויות שיש לאנזימים אלה ולהשוות אותם ביחס למה שכבר זמין בשוק. הפרוטוקול מציע חלופה קלה ובטוחה יותר לבדיקת אנזימים לחילוף חומרים של חומצות גרעין בהשוואה לשימוש במצעים מסומנים ברדיו.
מצעי הדנ"א או הרנ"א המסומנים באופן פלואורסצנטי הופכים את הגישה שלנו ליעילה יותר, מכיוון שאנו יכולים לערבב ולהתאים את האוליגונוקלאוטידים ליצירת מגוון מצעים. אז כרגע, אנחנו באמת מתמקדים בהבנת הפונקציה הביולוגית של כמה נוקלאזות חדשות שגילינו בגנום סביבתי באנטארקטיקה. לנוקלאזות האלה יש הומולוגים באורגניזמים אקסטרמופיליים אחרים, ולכן אנו מנסים להבין איזה תפקיד הם ממלאים במתן אפשרות למיקרובים האלה לשרוד.
אנו גם מתעניינים מאוד בפעילות של כמה מהאנזימים החדשים שלנו על אנלוגים של חומצות גרעין לא טבעיות ובשימושים הפוטנציאליים שלהם כחלק מארגז כלים לביולוגיה מולקולרית עם מצעי דנ"א ורנ"א לא טבעיים.
סקירה כללית
מאמר זה מציג פרוטוקול לבדיקת אנזימים המבצעים מטבוליזם של חומצות גרעיניות, עם דגש על אנזימי ליגאז, נוקלאז ופולימראז. הבדיקה משתמשת באוליגונוקלאוטידים מסומנים בفلואורסצנציה ובאוליגונוקלאוטידים שאינם מסומנים ליצירת דופלקסים המדמים נזקי RNA ו-DNA, ובכך מאפשרת את אפיון התנהגות האנזימים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- ביולוגיה מולקולרית
- בדיקות אנזימטיות
רקע
- מחקר על אנזימים המעורבים בשכפול ובתיכון של DNA.
- התמקדות במיקרואורגניזמים אקסטרמופיליים ובפתוגנים.
- הבנת התפקודים הביולוגיים והיישומים הביוטכנולוגיים של אנזימים אלו.
- לימוד של DNA ו-RNA ligases ותפקידם בהישרדות חיידקים.
מטרת המחקר
- לאפיון אנזימים המעבדים חומצות גרעיניות.
- לחקר תפקידן של DNA ligases ביצירת ביופילם.
- לבחינת RNA to DNA ligases חדשים ליישומים ביוטכנולוגיים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- פיתוח בדיקה באמצעות אוליגונוקלאוטידים המסומנים פלואורסצנטית.
- אפיון התנהגות אנזימטית באמצעות יצירת דופלקס.
- שיתוף פעולה עם ArcticZymes לצורך אפיון אנזימים.
- חקירה של תעתוע (trafficking) של אנזימים בתאי חיידקים.
תוצאות עיקריות
- ביסוס תפקידה של DNA ligase מינימלית ביצירת ביופילם.
- אפיון של RNA to DNA ligase חדשה.
- תובנות לגבי האופן שבו מיקרואורגניזמים אקסטרומופילים שורדים אתגרים סביבתיים.
- יישומים ביוטכנולוגיים פוטנציאליים של האנזימים שנחקרו.
מסקנות
- המחקר מעמיק את ההבנה של אנזימים המבצעים מטבוליזם של חומצות גרעיניות.
- הממצאים עשויים להוביל ליישומים ביוטכנולוגיים חדשים.
- נדרש מחקר נוסף כדי לבחון את מלוא הפוטנציאל של אנזימים אלו.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
בדיקות אוליגוניוקלאוטידים סינתטיים משוערים מאפשרות אפיון מהיר ולא רדיואקטיבי של אנזימים המפרקים חומצות גרעיניות, ובכך תומכות בתיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה.&ד. סימון פלואורסצנטי והתאמה אישית של תססים מאפשרים הערכה כמותית ובסריקה רחבה (high-throughput) של ספיציפיות אנזימטית, העדפה לקו-פקטורים ותאימות תססים. יכולות אלו מייעלות את הערכתם של ליגזים, נוקלאזים ופולימראזים חדשים, ובכך מאיצות את מיון פורטפוליו המוצרים ומפחיתות אי-ודאות ביולוגית בתהליכי הגילוי.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח של ביו-פרמה&ד'
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של ספציפיות סובסטרט של אנזימים ודרישות קופקטורים לצורך תיקוף פונקציונלי של מטרה.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי בדיקת פעילות אנזימטית על סובסטרטים של חומצות גרעיניות פגומות או לא טבעיות.
- מסייע בביצוע Benchmarking של אנזימים חדשים אל מול סטנדרטים מבוססים לצורך תעדוף תיקי מוצרים.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מספק תשתיות מודולריות ותקניות למבחני פעילות אנזימטית הניתנים לשחזור.
- מספק תוצאות כמותיות מבוססות פלואורסצנציה המתאימות לתהליכי סריקה הניתנים להרחבה.
- מבטל את הצורך בטיפול בחומרים רדיואקטיביים, ובכך מגביר את הבטיחות התפעולית והנגישות במעבדות שונות.
מחקר טרנסלציונלי ופרה-קליני
- מאפשר הערכה של פעילות אנזימטית על אנלוגים של חומצות גרעין סינתטיות או כאלו הרלוונטיות למחלה, כאשר הדבר נתמך על ידי תכנון הסובסטרט.
- תומך ברציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי אספקת פורמטים חסונים וניתנים להעברה של בדיקות.
- מסייע בקבלת החלטות על קידום מותאם-סיכון באמצעות אפיון כמי של האנזים.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
בדיקות אלו, המבוססות על אוליגוניוקלאוטידים, מציבות את אפיון האנזים בממשק שבין הגילוי המוקדם, זיהוי המולקולות המובילות (lead identification) והמחקר הפרה-קליני, ובכך תומכות בבדיקה איטרטיבית של היפותזות ובתיקוף מכניסטי.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בחקירה מונחית-השערה של תפקוד אנזימים ותאימות סובסטרטים.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך הערכה השוואתית של אנזימים.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה מדויקת של פעילויות ליגציה, דגרדציה וקישור באמצעות כימות פלואורסצנציה.
- מחקר תרגומי: מאפשר התאמה לסובסטרטים סינתטיים או כאלו הרלוונטיים למחלה לצורך סנכרון פרה-קליני.
- שימוש חוזר בארגון: מציע פלטפורמה גמישה שאינה רדיואקטיבית, הניתנת להתאמה למגוון מחלקות של אנזימים ולצרכי מחקר שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מעלה את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של אנזימים כמטרה טיפולית.
- ערך תפעולי: משפר את הסטנדרטיזציה, את השחזוריות ואת הבטיחות על ידי ביטול השימוש בחומרים רדיואקטיביים.
- ערך אסטרטגי: משפר את איכות קבלת החלטות ה-go/no-go ואת יעילות ההון בשלבים מוקדמים של מחקר ופיתוח (R&D)&ד'.
- השפעת הפורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות אנזימטיות וערכות כלים לפיתוח המשכי, תוך התאמה לרמת הסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בתכנון אוליגונוקלאוטידים ובאופטימיזציה של בדיקות אנזימטיות.
- דורש גישה לדימוי PAGE מבוסס פלואורסצנציה ולתשתיות ביולוגיה מולקולרית סטנדרטיות.
- דורש סטנדרטיזציה בין-צוותית של פרוטוקולי הכנת סובסטראטים וניתוח נתונים.
- מאפשר התאמה למחלקות אנזימים שונות ולשינויים בסובסטראטים, בהתאם לזמינות האוליגונוקלאוטידים המסחריים.
- עשוי להיות מוגבל על ידי מורכבות תכנון הסובסטראט או תאימות האנזים לאנלוגים סינתטיים.
שאלות נפוצות בביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:24
Assembling and Annealing Nucleic Acid Duplexes for Characterizing Enzymatic DNA Processing with Modified Oligonucleotides
3:54
Urea‐Polyacrylamide Gel Electrophoresis (PAGE) for Probing DNA Enzyme Activities Employing Commercial Oligonucleotides
