זיהוי תאי T נדירים ספציפיים לאנטיגן מריאות עכבר באמצעות פפטיד:טטרמרים מורכבים עיקריים של היסטותאימות
19 ביולי 2024
אנו מספקים פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות עכברים באמצעות העשרת תאי T מבוססי חרוזים מגנטיים וטטרמרים מסוג peptide:major histocompatibility complex (MHC).
המעבדה שלנו חוקרת את התפתחותם של תאי CD4 T בהקשרים שונים של סבילות וחסינות. בפרויקטים שלנו, אנו מתעניינים בעיקר באופן שבו חשיפה לאנטיגן מניעה התפתחות של תת-קבוצות פנוטיפיות של תאי T המבססות זיכרון חיסוני שיכול לשפר את הסבילות לעצמו או את החסינות מפני פתוגנים. לאחרונה התמקדנו בפיתוח תת-קבוצות תאי T רגולטוריות וזיכרון השוכנות ברקמת הריאה.
תאי T שוכנים ברקמה אלה ממלאים תפקיד חשוב בחיזוק הסבילות לאנטיגנים עצמיים במהלך פגיעה ברקמות, או בקידום תגובות דלקתיות לפתוגנים במהלך הדבקה חוזרת. המעבדה שלנו מתמחה במחקר ישיר של תאי T ספציפיים לאנטיגן, אך ריאגנטים טטרמרים MHC פפטידים מותאמים אישית. זה מאפשר לנו לחקור את תאי T אלה ללא שימוש במודלים טרנסגניים של TCR או מניפולציות ניסיוניות אחרות הידועות כגורמות לממצאים ניסיוניים.
למרות שאנו יכולים לזהות בקלות תאי T ספציפיים לאנטיגן עם טטרמרים, תאי T אלה נמצאים לעתים קרובות בתדרים נמוכים מאוד, במיוחד כאשר הם במצב נאיבי או זיכרון. זה גם מאתגר לבודד את תאי T אלה מרקמות שאינן לימפה, שם הם שוכנים לעתים קרובות בעקבות תגובה חיסונית. בעוד שישנם מספר פרוטוקולים מבוססים לבידוד תאי T מריאות עכבר, הפרוטוקול שאנו מציגים כאן עבר אופטימיזציה לזיהוי עוקב של תאי T ספציפיים לאנטיגן בתדר נמוך על ידי צביעת טטרמר.
במסגרת פרוטוקול זה, כללנו גם שתי אפשרויות לשיוך רקמות כדי להתאים טוב יותר למשאבי הספרייה. הפרוטוקול שלנו יסייע לחוקרים להרחיב את השימוש בטטרמרים לתאי T ספציפיים לאנטיגן ברקמת הריאה. זה יוביל למחקרים חזקים יותר in vivo של זיכרון תושב רקמות התפתחות תאי T ותפקודם, שהם נושאים בעלי עניין רב בתחום.
סקירה כללית
מחקר זה מציג פרוטוקול מפורט לבידוד וזיהוי של אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן בריאות של עכברים. המתודולוגיה משתמשת בהעשרה של תאי T מבוססת חרוזי מגנט ובטטראמרים של פפטיד:complex MHC (major histocompatibility complex) כדי להקל על תהליך זה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- אימונולוגיה
- ביולוגיה של תאי T
- מחקר תרגומי
רקע
- המעבדה מתמקדת בפיתוח של תאי CD4 T בהקשרים שונים של סבילות וחסינות.
- המחקר מדגיש כיצד חשיפה לאנטיגן משפיעה על תתי-סוגים פנוטיפיים של תאי T.
- תתי-סוגים של תאי T רגולטוריים ותאי זיכרון ברקמת הריאה עומדים במוקד עניין מיוחד.
- תאי T תושבי רקמה חיוניים לשמירה על סבילות ולתגובה לפתוגנים.
מטרת המחקר
- לבידוד וזיהוי של תאי T ספציפיים לאנטיגן ברקמת ריאה.
- להבנת תפקידם של תאי T אלו בזיכרון חיסוני ובסבילות (tolerance).
- לשימוש בריאגנטים של MHC tetramer עם פפטידים מותאמים אישית לצורך מחקר ישיר ללא ארטיפקטים ניסיוניים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- העשרה של תאי T באמצעות חרוזי מגנט.
- טכנולוגיית טטרמר של פפטיד:Major Histocompatibility Complex (MHC).
- בידוד של אוכלוסיות תאי T מריאות של עכברים.
- ניתוח של פנוטיפים ותפקודים של תאי T.
תוצאות עיקריות
- בידוד מוצלח של אוכלוסיות נדירות של תאי T ספציפיים לאנטיגן.
- זיהוי תתי-אוכלוסיות של תאי T התורמות לתגובות חיסוניות.
- תובנות לגבי תפקידם של תאי T השוכנים בריאות בסבילות ובחסינות.
- תיקוף של המתודולוגיה לחקר תאי T ללא ארטיפקטים.
מסקנות
- הפרוטוקול מאפשר מחקר יעיל של תאי T ספציפיים לאנטיגן ברקמת ריאה.
- הממצאים משפרים את ההבנה של תפקידי תאי T בזיכרון חיסוני ובסבילות (tolerance).
- ניתן ליישם גישה זו במגוון מחקרי אימונולוגיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למסמך סיכום
זיהוי ישיר של תאי T נדירים הסגוליים לאנטיגן ברקמות שאינן לימפואידיות נותן מענה לבקבוק צוואר קריטי בתהליכי גילוי תרופות מונחי-אימונולוגיה ובמחקר תרגומי. שימוש בטטראמרים של פפטיד:MHC עם העשרה מגנטית מאפשר זיהוי ואפיון ברמת ביטחון גבוהה של תתי-אוכלוסיות של תאי T תושבי רקמה, ובכך תומך בפרופיל חיסוני חזוי ובהפחתת סיכונים מכניסטית בשלבי הגילוי המוקדמים ובשלבים הפרה-קליניים. יכולת זו משפרת את קבלת ההחלטות לגבי פורטפוליו של תרופות אימונו-מודולטוריות המכוונות לתגובות חיסוניות סגוליות לרקמה.
יישומים אסטרטגיים במו"פ של ביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה ישירה של אוכלוסיות תאי T ספציפיים לאנטיגן בסביבות רקמה טבעיות.
- תומך בהפחתת סיכונים מכניסטיים על ידי הבהרת תפקידי תתי-אוכלוסיות של תאי T בסבילות ובחסינות.
- מסייע בתיקוף פונקציונלי של מטרות עבור מועמדים לתרופות אימונומודולטוריות.
- משפר את רמת הביטחון החיזויית באסטרטגיות של מודולציה של מסלולים חיסוניים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מספק זרימות עבודה (workflows) מתוקפות לבידוד וכמות של תתי-אוכלוסיות נדירות של תאי T מרקמות מורכבות.
- מבצע סטנדרטיזציה של שלבי ההעשרה והזיהוי לצורך בדיקות המשך הניתנות לשחזור.
- מאפשר קריאות כמותיות מבוססות ציטומטריה זרימתית לסריקת מודולטורים חיסוניים.
- תומך בפיתוח בדיקות ניתנות להרחבה עבור פרופיל חיסוני בתפוקה גבוהה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה את ניתוח תאי ה-T השוכנים ברקמה למודלים של סבילות וחסינות הרלוונטיים למחלה.
- מאפשרת רציפות משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מנגנונים חיסוניים.
- תומכת בקידום מותאם סיכונים של אימונותרפיה המכוונת לתגובות ספציפיות לרקמה.
- מסייעת בזיהוי ביומרקרים תרגומיים עבור אוכלוסיות חיסוניות השוכנות ברקמה.
שילוב תהליכי עבודה וצינורות עיבוד
שיטה זו משתלבת ברצף שבין השלב הגילוי לשלב הפרה-קליני על ידי מתן אפשרות לגילוי ברגישות גבוהה של תאי T ספציפיים לאנטיגן ברקמה, ובכך היא תומכת הן במחקרים מכניסטיים והן באפיון חיסוני תרגומי.
- ביולוגיה של גילוי: מקדמת את בדיקת ההשערות לגבי סבילות וחסינות המתווכות על ידי תאי T in situ.
- סריקה: מספקת תוצאות כמותיות הניתנות לשחזור לצורך זיהוי תתי-אוכלוסיות נדירות של תאי T.
- אנליטיקה: מספקת מדידות מבוססות ציטומטריה של זרימה לצורך ניתוח חיסוני השוואתי.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין ממצאי הגילוי למודלים פרה-קליניים של חסינות תלוית-רקמה (tissue-resident immunity).
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה תהליך עבודה מודולרי הניתן להתאמה לאנטיגנים ולהקשרי רקמה שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של העשרה וזיהוי של תאים נדירים להשגת תוצאות הניתנות לשחזור.
- ערך אסטרטגי: מספק בסיס לקבלת החלטות של go/no-go עבור תוכניות של אימונומודולציה על ידי הבהרת מנגנונים חיסוניים ספציפיים לרקמה.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף של מועמדים המכוונים למסלולים חיסוניים תלויי-רקמה (tissue-resident), תוך התחשבות בסיכון.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בפירוק רקמות, העשרה מגנטית ואנליזה של ציטומטריה מזרימה.
- דורש גישה לריאגנטים ייעודיים כגון טטרמרים של peptide:MHC ועמודי הפרדה מגנטית.
- דורש סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים לצורך הדירות (reproducibility) בין מחקרים.
- ניתן להתאמה לסוגי רקמות ולסגוליות אנטיגניות שונות באמצעות אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- רגישות הזיהוי עשויה להיות מוגבלת על ידי תנובת התאים ושכיחות האנטיגן ברקמת המטרה.
שאלות נפוצות בתחום הביופארמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
2:08
Generating Single‐Cell Suspension from Lung Tissue for Identifying Rare Antigen‐Specific T‐Cell Populations
5:25
Enriching the Lung Sample for T Cells via Magnetic Bead Enrichment
7:40
Staining the Antigen‐Specific T Cells with Peptide:MHC Tetramers for Flow Cytometry Analysis and Sorting
