מערכות AAV ומודלים של עכברים לחקירת ביטוי חוץ רחמי של Neurod1 בתאים שעברו התמרה בזמנים תת-חריפים וכרוניים לאחר שבץ איסכמי
29 בנובמבר 2024
פרוטוקול זה מתאר את הביטוי החוץ רחמי בתיווך ויראלי של Neurod1 לאחר שבץ איסכמי קליפת המוח. Neurod1 מועבר (1) באמצעות מערכת Cre-Flex AAV בעכברים מסוג בר במהלך השלב התת-חריף לאחר שבץ מוחי (7 ימים) ו-(2) באמצעות וקטור AAV יחיד בעכברים מדווחים מותנים במהלך השלב הכרוני שלאחר השבץ (21 ימים).
אנו בוחנים ביטוי חוץ רחמי בתיווך AAV של גורמי שעתוק נוירוגניים כטיפול פוטנציאלי לשבץ איסכמי. ההתמקדות שלנו היא לראות אם ביטוי Neurod1 בתאים המבטאים GFAP במהלך השלבים התת-חריפים והכרוניים לאחר שבץ מוחי מגביר את הנוירונים המתמרים ומתאם עם שיפורים בתפקוד המוטורי. ממצאים אחרונים מראים כי ביטוי גנים בקליפת המוח משתנה לפי אזור עם אותו AAV המחקר שלנו מצא כי מקדם ה-GFAP פעיל יותר בקליפת המוח הקדם-מצחית האמצעית מאשר בקליפת המוח המוטורית, מה שמצביע על כך שתאים מותמרים מגיבים בצורה שונה למקדמים ספציפיים.
לפיכך, טיפולים הכוללים גורמי שעתוק נוירוגניים צריכים להיות מותאמים לאזור מוח היעד. האתגרים הנוכחיים כוללים שונות בגודל נגע שבץ עקב משתנים כמו שיעורי ההזרקה של ET-1 ויעילות התמרה בין אזורי מוח. טיטרים וטרופיזם של AAV על פני אזורי מוח וזני עכברים יכולים להשפיע על יעילות הטרנסדוקציה, ולהשפיע על ההערכה התאית של ביטוי Neurod1 חוץ רחמי לאחר שבץ מוחי.
האתגר העיקרי בהמרת אסטרוציטים לנוירונים הוא להבחין בין נוירונים מתוכנתים מחדש לבין נוירונים קיימים. המעבדה שלנו שואפת לאשר שתכנות מחדש זה מתרחש in vivo על ידי פיתוח כלים חדשים. בסופו של דבר, אנו מבקשים להבין כיצד ביטוי חוץ רחמי של גורם שעתוק עצבי משפר את ההחלמה בבעלי חיים פגועי מוח.
כדי להתחיל, הסר את החיה המורדמת מהתא והנח אותה על משטח נקי. לאחר ניקוי אזור הניתוח של העכבר, הנח את אפו בחרוט האף הסטריאוטקסי וייצב את הגולגולת באמצעות מוטות אוזניים. בעזרת להב אזמל מספר 10, בצע חתך אנכי במקביל למישור הסגיטלי מאחורי נקודת האמצע של העיניים לעצם הקודקודית.
לאחר מכן, יש למשוך בעדינות את העור כדי לחשוף את הגולגולת. לאחר מכן, השתמש בקצה Q כדי לשבש את הפאשיה על הגולגולת ולאפשר לגולגולת להתייבש כדי לחשוף את הברגמה במלואה. בעזרת מקדחה סטריאוטקסית במהירות גבוהה, קדחו שלושה חורי קוצים בקואורדינטות בקליפת המוח המוטורית החושית הימנית.
לאחר מכן, החלף את המקדחה במזרק בגודל 26 המצויד במחט באורך 0.375 אינץ'. טען 1.5 מיקרוליטר של תמיסת אנדותלין-1 מיקרוטולרית 400 מומסת ב-PBS סטרילי לתוך המזרק. שחרר נפח קטן של אנדותלין-1 כדי לצפות בטיפה בקצה המחט, מה שמבטיח זרימה טובה.
הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת לתוך חור הקוצים האמצעי מבלי לנקב את הדורה מאטר. לאחר היישור, הורידו את המחט מילימטר אחד לתוך המוח. בעזרת מזרק המילטון, הוציאו 0.1 מיקרוליטר בכל פעם, והמתינו דקה אחת לפני הזרקת 0.1 מיקרוליטר הבא.
כדי למנוע את חסימת המחט בין הזריקות ואחריהן, שחרר נפח קטן של אנדותלין-1 עד להופעת טיפה בקצה המחט. בעזרת Q-tip סטרילי, נגב את עודפי האנדותלין-1 לפני ההזרקה. לבסוף, תפר את העור שמעל הגולגולת באמצעות תפר סטרילי 4-0 כדי לסגור את הפצע.
לאחר הרדמת העכבר שטופל באנדותלין-1, העבירו את העכבר למסגרת הסטריאוטקסית. בעזרת מספריים כירורגיים חותכים את התפרים על הפצע. בעזרת מלקחיים, הסר את הגלד ומשוך את העור כדי לחשוף את הגולגולת.
לאחר מכן, השתמש בקצה Q סטרילי כדי לייבש את משטח הגולגולת ולאתר את חורי הקוצים. הגדר את זרועות המניפולטור של המנגנון הסטריאוטקסי. הנח מחזיק מחט הנושא מזרק בגודל 26 עם מחט באורך 0.375 אינץ'.
כעת, טען 3.4 מיקרוליטר של תמיסת AAV לתוך המזרק. הורד את קצה המחט מעבר לגולגולת לתוך החור הראשון, הקדמי ביותר. ודא שהמחט לא מנקבת את הדורה מאטר, ואז הורד במילימטר אחד לתוך המוח.
באמצעות מזרק המילטון, הזרקו מיקרוליטר אחד של תמיסת AAV על ידי הוצאת 0.1 מיקרוליטר בכל פעם כפי שהודגם קודם לכן. לאחר מכן תפר את העור שמעל הגולגולת כדי לסגור את הפצע באמצעות תפר פוליאסטר 4-0 Polysorb. הסר את העכבר מהמסגרת הסטריאוטקסית והעבר אותו לכלוב דיור בעלי חיים נקי ומחומם מראש באזור ההתאוששות.
סקירה כללית
מחקר זה בוחן את הביטוי האקטופי של גורם השעתוק הנוירוגני Neurod1 בעקבות שבץ איזכמי קורטיקלי, תוך שימוש בהעברה באמצעות AAV. הפרוטוקול כולל שני שלבים: שלב סוב-אקוטי (7 ימים לאחר השבץ) בעכברים מסוג wild-type, ושלב כרוני (21 ימים לאחר השבץ) בעכברי דגלים (reporter mice) קונדיציונליים. המטרה היא להעריך האם ביטוי של Neurod1 משפר את ההחלמה הנוירונלית ואת התפקוד המוטורי.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- טיפול גנטי
- החלמה משבץ מוחי
רקע
- שבץ מוחי איסכמי מוביל לאובדן נוירונים ולליקויים תפקודיים.
- לתכנות מחדש של נוירונים יש פוטנציאל להשגת החלמה.
- וקטורי AAV משמשים להעברת גנים בהקשר זה.
- עיתוי ההתערבות עשוי להשפיע על התוצאות הטיפוליות.
מטרת המחקר
- לבחון את השפעות הביטוי של Neurod1 על התחדשות נוירונים במודלים לאחר שבץ מוחי.
- לחקור את המתאם בין הביטוי של Neurod1 לבין התאוששות התפקוד המוטורי.
- להעריך את השונות בתגובה בהתבסס על שיטת העברת הגן ועיתומה.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- השתמשו בוקטורים של AAV להעברת Neurod1 באמצעות מערכת Cre-Flex.
- המודל הביולוגי כולל עכברים מסוג wild-type ועכברי דגמי-דיווח (reporter) קונדיציונליים לאחר שבץ מוחי.
- המחקר מתמקד בנקודות זמן שונות (7 ימים ו-21 ימים לאחר השבץ).
- הפרוטוקולים הניסיוניים כוללים הליכים כירורגיים מדויקים להזרקת הוקטור.
- צוינו קשיים בהשגת יעילויות טרנסדוקציה עקביות באזורי מוח שונים.
תוצאות עיקריות
- ביטוי של Neurod1 באסטרוציטים תרם לעלייה במספר הנוירונים שעברו טרנסדוקציה.
- שיפור בתפקודי המוטוריקה נמצא במתאם עם עיתוי הביטוי של Neurod1.
- נצפתה שונות בביטוי הגנים בהתאם למערכות המסירה של AAV.
- תיקוף של תכנות מחדש in-vivo נותר אתגר.
מסקנות
- המחקר מדגים את הפוטנציאל של Neurod1 לקידום ההחלמה לאחר שבץ מוחי.
- הבנת העיתוי והשיטה של העברת הגן עשויה למטב את האסטרטגיות הטיפוליות.
- תובנות ממחקר זה עשויות להנחות גישות עתידיות בתיקון נוירונלי ובשיקום לאחר שבץ מוחי.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
ביטוי אקטופי בתיווך AAV של גורמי שעתוק נוירוגניים מאפשר בחינה מדויקת של תכנות מחדש של נוירונים באזורי מוח לאחר שבץ, ובכך תומך בתיקוף יעדים עבור טיפולים רגנרטיביים. פלטפורמה זו נותנת מענה לאתגרים של פעילות פרומוטר ספציפית לאזור ויעילות טרנסדוקציה, ובכך מגבירה את הביטחון החזוי בקווי תהליך של נוירו-רגנרציה בשלבים מוקדמים. מערכות AAV סטנדרטיות מאפשרות הערכה הדירה של שינויים בגורל תאי המונחים על ידי גורמי שעתוק, דבר המשפיע ישירות על מיון תיקי פרויקטים לאסטרטגיות של תיקון ה-CNS.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר תיקוף פונקציונלי של גורמי שעתוק נוירוגניים במודלים in vivo רלוונטיים למחלה.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי הבהרת תגובות ספציפיות לאזור ולפרומוטור להחדרת גנים.
- מספק פלטפורמה לבדיקה מבוססת היפותזה של תכנות מחדש של נוירונים לאחר פגיעה.
- מסייע בביטחון ניבוי בבחירת מטרות של גורמי שעתוק לפיתוח המשכי.
סריקה ופיתוח בדיקה (Assay)
- מקימ מערכות סטנדרטיות מבוססות AAV לביטוי גנים אקטופי הדיר ב-CNS models.
- מאפשר הערכה כמותית של מספר הנוירונים שעברו טרנסדוקציה ושל ביטוי הגן המדווח (reporter gene).
- תומך בהכנת בדיקות להערכת יעילותם של פקטורים נוירוגניים באזורי מוח שונים.
- מספק פרוטוקולים ניתנים להרחבה המותאמים לזני עכברים שונים וללוחות זמנים ניסיוניים משתנים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתואם עם מודלים רלוונטיים למחלה של שבץ איסכמי לצורך חקירה תרגומית של סמנים ביולוגיים.
- מאפשר רציפות משלב התגלית של תכנות מחדש ועד לתיקוף פרה-קליני של התאוששות תפקודית.
- תומך בהחלטות קידום מותאמות סיכון באמצעות כימות תוצאות נוירונליות לאחר התערבות.
- עוסק באתגרים תרגומיים של הובלת גנים ספציפית לאזור ותכנות מחדש תאי.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
פלטפורמה זו לביטוי אקטופי מבוסס AAV משלבת שלבים החל מהגילוי המוקדם ועד לתיקוף פרה-קליני, ומאפשרת בדיקה מחזורית של היפותזות והפחתת סיכונים מכניסטיים במסלולי פיתוח לתיקון ה-CNS.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת השערת האפס של יעילות גורמים נוירוגניים in vivo.
- סריקה: מספקת פלטים כמותיים וניתנים לשחזור להשוואת פעילות פרומוטור ויעילות טרנסדוקציה.
- אנליטיקה: מאפשרת מדידה של מספר הנוירונים שעברו טרנסדוקציה וביטוי גנים ספציפי לאזור.
- מחקר תרגומי: מגשר בין ממצאי גילוי למודלים פרה-קליניים של התאוששות משבץ מוחי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציע מערכת מודולרית וסתגלנית עבור תוכניות מגוונות של נוירו-רגנרציה.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי בבחירת מטרות ואת ההבנה המכניסטית של תכנות מחדש של נוירונים.
- ערך תפעולי: סטנדרטיזציה של פרוטוקולי העברת גנים וכימות לשם הדירות (reproducibility) בין מחקרים.
- ערך אסטרטגי: מסייע בקבלת החלטות לגבי המשך או הפסקת התהליך (go/no-go) על ידי הבהרת תוצאות ספציפיות לאזור ולפרומוטור.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעדוף מותאם סיכון של מועמדים לגורמים נוירוגניים לשיקום מערכת העצבים המרכזית (CNS).
שיקולי יישום
- נדרשת מומחיות בניתוח סטריאוטקסי ובטיפול בווקטורים מסוג AAV.
- נדרשת גישה לתשתיות של דימות כמותי וניתוח גורל תאים.
- יש צורך בסטנדרטיזציה בין-צוותית של קצבי ההזרקה ובחירת הפרומוטור.
- יש לקחת בחשבון שונות ביעילות הטרנסדוקציה בין אזורי מוח שונים וזני עכברים שונים.
- הבחנה קפדנית בין נוירונים שעברו תכנות מחדש לבין נוירונים קיימים חיונית לצורך פרשנות מדויקת.
