Name: מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-15T13:20:00.000+00:00
Duration: 12 min 8 s
Description: למדו פרוטוקול למיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקיד גנים ספציפיים ברגולציה של תאי T עוזרים ומנגנוני תגובת חיסון.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>טרנסדוקציה רטרו-ויראלית של RNA מנחה לעריכת גנים בהתמיינות Th17

<ol><li>Wu, B., Wan, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+control+of+pathogenic+th17+cells+in+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Int+Immunopharmacol%22%5BJournal%5D)">Molecular control of pathogenic th17 cells in autoimmune diseases.</a> Int Immunopharmacol. 80, 106187(2020).</li>
<li>Dong, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th+17+cells+in+development%3A%3A+An+updated+view+of+their+molecular+identity+and+genetic+programming%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Th 17 cells in development:: An updated view of their molecular identity and genetic programming.</a> Nat Rev Immunol. 8 (5), 337-348 (2008).</li>
<li>Patel, D. D., Kuchroo, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Th17+cell+pathway+in+human+immunity%3A+Lessons+from+genetics+and+therapeutic+interventions%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Th17 cell pathway in human immunity: Lessons from genetics and therapeutic interventions.</a> Immunity. 43 (6), 1040-1051 (2015).</li>
<li>Ghoreschi, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+pathogenic+Th17+cells+in+the+absence+of+TGF-%CE%B2+signalling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Generation of pathogenic Th17 cells in the absence of TGF-β signalling.</a> Nature. 467 (7318), 967-U144 (2010).</li>
<li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+and+molecular+signature+of+pathogenic+th17+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Induction and molecular signature of pathogenic th17 cells.</a> Nat Immunol. 13 (10), 991-999 (2012).</li>
<li>Yang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+reporter+and+conditional+alleles+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying reporter and conditional alleles by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 154 (6), 1370-1379 (2013).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
<li>Doench, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+sgrna+design+to+maximize+activity+and+minimize+off-target+effects+of+crispr-cas9%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Optimized sgrna design to maximize activity and minimize off-target effects of crispr-cas9.</a> Nat Biotechnol. 34 (2), 184-191 (2016).</li>
<li>Holst, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+t-cell+receptor+retrogenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generation of t-cell receptor retrogenic mice.</a> Nat Protoc. 1 (1), 406-417 (2006).</li>
<li>Ordonez, P., Bishop, K. N., Stoye, J. P., Groom, H. C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+SAMHD1+restriction+by+flow+cytometry+in+human+myeloid+U937+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of SAMHD1 restriction by flow cytometry in human myeloid U937 cells.</a> J Vis Exp. (172), (2021).</li>
<li>Akcakaya, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+CRISPR+editing+with+no+detectable+genome-wide+off-target+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">In vivo CRISPR editing with no detectable genome-wide off-target mutations.</a> Nature. 561 (7723), 416-419 (2018).</li>
<li>Bae, S., Park, J., Kim, J. -S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cas-OFFinder%3A+A+fast+and+versatile+algorithm+that+searches+for+potential+off-target+sites+of+cas9+rna-guided+endonucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of cas9 rna-guided endonucleases.</a> Bioinformatics. 30 (10), 1473-1475 (2014).</li>
<li>Singh, Y., Garden, O. A., Lang, F., Cobb, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+helper+T+cells+as+a+genetic+approach+to+study+mechanisms+controlling+their+differentiation+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of helper T cells as a genetic approach to study mechanisms controlling their differentiation and function.</a> J Vis Exp. (117), e54698(2016).</li>
<li>Naviaux, R. K., Costanzi, E., Haas, M., Verma, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+pCL+vector+system%3A+Rapid+production+of+helper-free%2C+high-titer%2C+recombinant+retroviruses%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">The pCL vector system: Rapid production of helper-free, high-titer, recombinant retroviruses.</a> J Virol. 70 (8), 5701-5705 (1996).</li>
<li>Cante-Barrett, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lentiviral+gene+transfer+into+human+and+murine+hematopoietic+stem+cells%3A+Size+matters%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Res+Notes%22%5BJournal%5D)">Lentiviral gene transfer into human and murine hematopoietic stem cells: Size matters.</a> BMC Res Notes. 9, 312-312 (2016).</li>
<li>Zhong, S., Malecek, K., Perez-Garcia, A., Krogsgaard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+transduction+of+T-cell+receptors+in+mouse+T-cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Retroviral transduction of T-cell receptors in mouse T-cells.</a> J Vis Exp. (44), 2307(2010).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0.5 M EDTA (pH 8.0)</td> <td>Solarbio</td><td>E1170</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים ורקמות 100 מ"מ</td><td>BIOFIL</td><td>TCD010100</td><td></td></tr><tr><td>1 M Hepes (חומצה חופשית, סטרילית)</td> <td>Solarbio</td><td>H1090</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים ורקמות 24 בארות</td><td>NEST</td><td>702002</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית תאים ורקמות 48 בארות</td><td>NEST</td><td>748002</td><td></td></tr><tr><td>Brefeldin תמיסה (פי 1,000)</td><td>BioLegend</td><td>420601</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן CD4 נגד עכבר סגול מבריק 650 (RM4-5)</td><td>BioLegend</td><td>100546</td><td></td></tr><tr><td>CD3e נוגדן חד-שבטי (145-2C11), דרגה פונקציונלית, נוגדן חד-שבטי eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>16-0031-82</td><td></td></tr><tr><td>CD44 (IM7), PE, נוגדן חד-שבטי של eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>12-0441-83</td><td></td></tr><tr><td>CD62L (L-Selectin) נוגדן חד-שבטי (MEL-14), APC, eBioscience</td><td>Invitrogen</td><td>17-0621-82&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>מונה תאים</td><td>Nexcelom Bioscience</td><td>Cellometer אוטומטי 2000</td><td></td></tr><tr><td>מסננת תאים (40 &mu; m)</td> <td>מסננת תאים biosharp</td><td>BS-40-CS</td><td></td></tr><tr><td>(70 &mu; m)</td><td><a name="RANGE! צנטריפוגה B14 אינץ' >biosharp</a></td><td>BS-70-CS</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>אפנדורף</td><td>5425&nbsp; צנטריפוגה R</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>eppendorf</td><td>5810 R</td><td></td></tr><tr><td>ChamQ SYBR צבע qPCR מאסטר מיקס</td><td>Vazyme</td><td>Q411-02</td><td></td></tr><tr><td>ClonExpress II ערכת שיבוט שלב אחד</td><td>Vazyme</td><td>C112</td><td></td></tr><tr><td>DH5&alpha; תאים מוכשרים</td><td>Sangon Biotech</td><td>B528413</td><td></td></tr><tr><td>Direct-zol RNA Miniprep</td><td>ZYMO RESEARCH</td><td>R2050</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בינוני</td><td>BasalMedia</td><td>L110KJ</td><td></td></tr><tr><td>EasySep עכבר CD4+ ערכת בידוד תאי T STEMCELL</td><td></td><td>19852</td><td></td></tr><tr><td>eBioscience כדאיות לתיקון צבע eFluor 660</td><td>Invitrogen</td><td>65-0864-18</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מיני פלסמיד EndoFree II</td><td>TIANGEN</td><td>DP118-02</td><td></td></tr><tr><td>ExFect Transfection Reagent</td><td>Vazyme</td><td>T101-01</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, פרימיום פלוס</td><td>Gibco</td><td>A5669701</td><td></td></tr><tr><td>FITC נוגדן IL-17A נגד עכבר (TC11-18H10.1)</td><td>BioLegend</td><td>506907</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת פורמלדהיד</td><td>Macklin</td><td>F864792</td><td></td></tr><tr><td>HiScript IV RT SuperMix עבור qPCR?+מגב gDNA?</td><td>Vazyme</td><td>R423-01</td><td></td></tr><tr><td>Ionomycin</td><td>Beyotime</td><td>S1672</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycin C</td><td>Maokang Biotechnology</td><td>7/7/1950</td><td></td></tr><tr><td>עכבר GRCm38</td><td>NCBI</td><td>RefSeq v.108.20200622</td><td></td></tr><tr><td>OPTI-MEM סרום מופחת בינוני</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>סרום מופחת בינוני</td></tr><tr><td>פסיפיק כחול נגד עכבר CD4 נוגדן CD4 (RM4-5)</td> <td>BioLegend</td><td></td><td></td></tr><tr><td>100531 PE/Cyanine7 נגד עכבר CD25 נוגדן (PC61)</td><td>BioLegend</td><td>102015</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cyanine7 נגד עכבר CD4 נוגדן (GK1.5)</td><td>BioLegend</td><td>100422</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין (10,000 יח'/מ"ל)</td><td>Gibco</td><td>15140122-PMA</td><td></td></tr><tr><td>/TPA&nbsp;</td><td>עכברי Beyotime</td><td>S1819</td><td></td></tr><tr><td>R26-CAG-Cas9&nbsp;</td><td>מרכז אורגניזמים מודל שנחאי</td><td>Cat. מס' NM-KI-00120</td><td></td></tr><tr><td>חלבון TGF-beta 1 רקומביננטי אנושי (מבוטא CHO), CF</td><td>R& D Systems</td><td>11409-BH</td><td></td></tr><tr><td>עכברים רקומביננטיים IL-6</td><td>PeproTech</td><td>216-16</td><td></td></tr><tr><td>מנתח תאי מחקר</td><td>BD Biosciences</td><td>BD LSRFortessa</td><td></td></tr><tr><td>Research Cell Sorter</td><td>SONY</td><td>MA900</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 בינוני</td><td>BasalMedia</td><td>L210KJ</td><td></td></tr><tr><td>SimpliAmp Thermal Cycler PCR System</td><td>Applied Biosystems</td><td>A24811</td><td></td></tr><tr><td>תמיסת נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S8636</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר CD28 נוגדן (37.51)</td><td>BioLegend</td><td>102121</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר IFN-&gamma; נוגדן (XMG1.2)</td><td>BioLegend</td><td>505847</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר IL-4 נוגדן (11B11)</td><td>BioLegend</td><td>504135</td><td></td></tr><tr><td>Ultra-LEAF מטוהר נגד עכבר IL-12/IL-23 p40 נוגדן (C17.8)</td><td>BioLegend</td><td>505309</td><td></td></tr><tr><td>&-Mercaptoethanol (50 מ"מ)</td><td>Solarbio</td><td>M8211</td><td></td></tr></tbody></table>

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך crispr/cas9 לחקר התמיינות th17 במבחנה

Retroviral CRISPR/Cas9-Mediated Gene Targeting for the Study of Th17 Differentiation in Vitro

במחקר שיבטנו את מטרת ה-sgRNA לרצפי קידוד Rorc ו-sgRNA-non-targeting לווקטור pMX-U6-MCS עם חלבון פלואורסצנטי mCherry (איור 1A,B). ייצור רטרו-וירוס בוצע בהתאם לפרוטוקול המתואר באיור 2. הטרנספקציה החלה ביום 0, והקציר הרטרו-ויראלי התרחש ביום השני. ניתן לבדוק את יעילות הטרנספקציה על-ידי עוצמת הפלואורסצנטיות של mCherry (איור 1C). לפני קצירת הנגיף, תאי CD4+ T נאיביים מוינו והופעלו. תאי CD4+ T מופעלים אלה נדבקו לאחר מכן באמצעות זיהום ספין, ואחריו המשך שלבי ההתמיינות כמתואר. לבסוף, יעילות הטרנסדוקציה ותוצאות הדיפרנציאציה הוערכו באמצעות ניתוח ציטומטריית זרימה וניתוח qPCR.
איור 3 מדגים את אסטרטגיית ה-gating המיושמת למיון תאי T נאיביים מסוג CD4+. לאחר בחירת אוכלוסיית התאים הראשית ותאי סינגלט (כפי שמוצג בשני השערים הראשונים של איור 3), תאי +FVD CD4 גודרו כדי להבחין בין תאי CD4 T בתאי Th17 מקוטבים לבין תאי APC. לבסוף, IL-17A המיוצר על ידי תאי CD4 T מייצגים יעילות התמיינות Th17, אשר הצביעה על יעילות הנוקאאוט. אחוז התאים החיוביים mCherry משקף את היעילות של זיהום רטרו-ויראלי, בעוד יעילות הנוקאאוט מסומנת על ידי אחוז התאים החיוביים IL-17A. כדי לשפר את כדאיות התאים ולמזער את משך המיון, הטחול הועשר באמצעות ערכת בידוד תאי CD4+ T של עכבר, וכתוצאה מכך יעילות העשרה עלתה על 90%.
היעילות של זיהום רטרו-וירוס, המצוין על-ידי נוכחות של תאים חיוביים ל-mCherry, היא בדרך כלל בסביבות 40% (איור 4A). למרות שניתן להגביר את יעילות ההדבקה באמצעות ריכוז הנגיף, גישה זו באה על חשבון משך ניסוי ממושך ועלויות גבוהות יותר. בניסויים שלנו, תאים נגועים שגודלו בתרבית ללא קוקטייל התמיינות תאי Th17 שימשו כבקרה שלילית להתמיינות Th17, המסומנת כ-Th0. sgRNA שאינו מכוון שימש כבקרה חיובית, המכונה sgNT. לצורך עריכת גנים, השתמשנו ב-gRNA המכוון לגן RORγt (sgRNA-Rorc), מה שהפחית באופן משמעותי את יעילות התמיינות Th17 (איור 4A). התערבות זו הובילה גם לירידה משמעותית ברמות הביטוי של Rorc ו-IL-17a (איור 4B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig1.jpg"> 
איור 1: דוגמה של sgRNA המשובט לתת-וקטור רטרו-ויראלי ויעילות טרנספקציה. וקטור pMX-U6-MCS שימש כמבנה הראשוני. פיגום ה-gRNA, יחד עם רצפי ה-sgRNA (החלק הכתום) המכוונים לאתר המקושקש (A) ו-(B) Rorc, הוכנסו במורד הזרם של מקדם U6 (החלק הירוק כקטע לריצוף עם פריימרים U6). המיקומים של פריימרים המכילים sgRNA ואתרי פריימר ריצוף מסומנים מתחת לווקטור המעגלי השמות המלאים של הקיצורים על הפלסמיד הם כדלקמן. קיצורים: AmpR = עמידות לאמפיצילין, קרבניצלין ואנטיביוטיקה קשורה; LTR = חזרה מסוף ארוך; MMLVψ = אות אריזה של נגיף לוקמיה מולוני מורין; gag = קטוע Moloney murine leukemia virus (MMLV) גן gag חסר קודון התחלה. (C) הדמיה מיקרוסקופית של mCherry בתאי Plat-E נגועים בפלסמיד DNA. סרגל קנה מידה: 500 פיקסלים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig2.jpg"> 
איור 2: המחשה סכמטית של הפרוטוקול. יום לפני הטרנספקציה, צפיפות תאי Plat-E צריכה להיות מותאמת לטווח הנכון. למחרת (יום 0), לבצע transfection ולהחליף בינוני 12 שעות מאוחר יותר. ביום הראשון, מיין והפעל את תאי T נאיביים מעכברים המבטאים Cas9. לאחר מכן (יום 2), קצרו את תרבית העל המכילה את הנגיף ושלבו עם תאי T המופעלים לצורך התמרה רטרו-ויראלית. התאים הנגועים מתמיינים לתאי Th17 למשך 3-4 ימים ומנותחים באמצעות FACS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig3.jpg"> 
איור 3: אסטרטגיית Gating למיון תאי T נאיביים CD4. צביעת פני השטח בוצעה על תאי CD4 T מועשרים כדי לתייג CD4, CD25, CD44 ו- CD62L. אסטרטגיית הגאטינג שננקטה הייתה כדלקמן: בתחילה, לימפוציטים היו מגודרים על בסיס פרמטרים של פיזור קדמי ופיזור צד. לאחר מכן, תאים בודדים זוהו באמצעות FSC-H ו- FSC-W. תאי CD4+CD25 גודרו כדי להוציא תאי T רגולטוריים (Tregs). לבסוף, זוהו תאי T נאיבייםגבוהים CD44 CD62L. תאי T נאיביים CD4+ שבודדו נאספו לניסויים הבאים. קיצורים: FSC = פיזור קדימה; SSC = פיזור צד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66966/66966fig4.jpg"> 
איור 4: דוגמה להתמרה מוצלחת של תאי T פעילים והתמיינות Th17. (A) יעילות ההתמיינות של Th17 מופחתת באופן משמעותי, אשר נערך על ידי RORγt gRNA (gating on mCherry+ IL-17a+population). (B) ביטוי יחסי של Rorγt ו-IL-17a ב-Th0 (תאים נגועים בתרבית ללא קוקטייל התמיינות תאי Th17), sgNT (sgRNA שאינו ממוקד) ו-sgRNA-Rorc (sgRNA המכוון לגן RORγt ). p &lt; 0.001 (מבחן t של תלמיד דו-זנבי לא מזווג; הנתונים מוצגים כממוצע ± SEM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66966/66966fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="2">רכיבי תגובת PCR</td>
			<td colspan="4">תוכנית PCR</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>רכיב</td>
			<td>נפח (μL)</td>
			<td>צעד</td>
			<td>טמפ.</td>
			<td>זמן</td>
			<td>מחזור</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2 × תערובת פנטה (צבע פלוס)</td>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>95ºC</td>
			<td>3 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ddH20</td>
			<td>20</td>
			<td>2</td>
			<td>95ºC</td>
			<td>15 שניות</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>פריימר-F (10 מיקרומטר)</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>56ºC</td>
			<td>15 שניות</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">פריימר-R (10 מיקרומטר)</td>
			<td rowspan="2">2</td>
			<td rowspan="2">4</td>
			<td rowspan="2">72ºC</td>
			<td rowspan="2">5 דקות 30 שניות</td>
			<td>עבור לשלב 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35 ×</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>תבנית (~ 30 ng)</td>
			<td>1</td>
			<td>5</td>
			<td>72ºC</td>
			<td>5 דקות</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>6</td>
			<td>12ºC</td>
			<td>∞</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: רכיבי תגובת PCR ותוכנית PCR לבניית וקטור gRNA.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

T helper cells that produce IL-17A, known as Th17 cells, play a critical role in immune defense and are implicated in autoimmune disorders. CD4 T cells ...

retroviral-crisprcas9-mediated-gene-targeting-for-study-th17

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

אימונולוגיה וזיהומים

סרטון זה מדגים בדיקה לביצוע עריכת גנים בתאי T אנושיים באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9. תערובת של תאי T ראשוניים CD4+ ו- CD8+ משולבת עם קומפלקס ריבונוקלאו פרוטאין CRISPR-Cas9, המכוון לגנים ספציפיים לנוקאאוט. לאחר ההתחשמלות, ה-sgRNA מנחה את Cas9 לרצף הדנ"א של המטרה, ויוצר חתכים מדויקים. חתכים אלה מתוקנים לאחר מכן על ידי מנגנון חיבור הקצה הלא הומולוגי של התא, המוביל לנוקאאוט גנטי.

טכניקת CRISPR-Cas9 לעריכת גנים בתאי T

העברת גני adenoviral לתוך CD4 נאיבי תאי T מהונדס עם ביטוי של הקולטן אדנווירוס Coxsackie מאפשרת ניתוח המולקולרי של התמיינות תאי T...

התמרה adenoviral של CD4 תמימים תאי T ללמוד בידול Treg

מערכות ניסיוניות רבות כבר נוצלו כדי להבין את המנגנונים המסדירים פיתוח תאי T ולתפקד תגובה חיסונית. הנה גישה גנטית באמצעות תמרת retroviral מתוארת, אשר היא כלכלי, זמן יעיל, והכי חשוב, מאוד אינפורמטיבי בזיהוי מסלולים רגולטוריים.

Retroviral תמרה של Helper T תאים כגישה גנטית לחקר מנגנוני בקרת הבידול והתפקוד שלהם

פרוטוקולים כדי ליצור קווים מוטנטים hPSC באמצעות פלטפורמת iCRISPR וכדי לבדל hPSCs לתאי β-כמו גלוקוז-תגובה מתוארת. שילוב של טכנולוגית עריכת הגנום עם בידול מכוון hPSC מספק פלטפורמה חזקה עבור הניתוח השיטתי של תפקיד גורמי שושלת בהתפתחות אנושית והתקדמות מחלה.

הגנום עריכה בימוי בידול של hPSCs עבור חקירת גורמים המשפיעים Lineage בהתפתחות האנושית הלבלב

אלקטרופורציה מהדור הבא היא שיטה יעילה להעברת תאי Th17 אנושיים עם RNA קטן כדי לשנות את ביטוי הגנים והתנהגות התאים.

RNA הקטן Transfection ב ראשוני האדם TH17 תאים על ידי הדור הבא Electroporation

אנו מציגים הגנום הנדסה זרימת עבודה עבור הדור של הדגמים החדשים במבחנה להידבקות ב- HIV-1 זה מסכם את הדברים proviral אינטגרציה באתרים גנומית שנבחרו. פילוח של עיתונאים HIV-derived בהנחייתם של מניפולציה הגנום CRISPR Cas9-בתיווך, הספציפיות-לאתר. פרוטוקולים מפורט דור שיבוט תא בודד, הקרנה של אימות המטרה הנכונה הינם מסופקים.

CRISPR-Cas9 מבוססי הגנום הנדסה ליצירת מודלים Jurkat כתב להידבקות ב- HIV-1 עם אתרים שנבחרו אינטגרציה Proviral

תיאר הם פרוטוקולים עבור עריכת הגנום יעיל מאוד של גזע המטפאות מורקיים ומחולל קדמון (HSPC) על ידי מערכת CRISPR/Cas9 כדי לפתח במהירות מערכות מודל העכבר עם המטפאות ספציפיים שינויים גנים.

לנטינגיו CRISPR/Cas9 בתיווך הגנום עריכה לחקר התאים המטפאות במודלים למחלות

פרוטוקול זה מתאר את ההתמיינות של תאי CD4+ T נאיביים לתאי Th17 פתוגניים במבחנה. באופן ספציפי, בשילוב עם גישה מבוססת ציטומטריה של זרימה מרובת פרמטרים, ניתן לקבל 90% טוהר של תאי Th17 פתוגניים מתאי T נאיביים CD4+ באמצעות שיטת התמיינות זו.

התמיינות חוץ גופית של תאי T נאיביים CD4+ לתאי Th17 פתוגניים בעכבר

פרוטוקול זה מספק זרימת עבודה יעילה ליצירה ובדיקה של תאי T רגולטוריים של קולטני אנטיגן כימריים אנושיים (CAR Tregs).

יצירת תאי T רגולטוריים של קולטן אנטיגן כימרי אנושי

קו התאים THP-1 נמצא בשימוש נרחב כמודל לחקירת התפקודים של מונוציטים/מקרופאגים אנושיים בתחומי מחקר שונים הקשורים לביולוגיה. מאמר זה מתאר פרוטוקול עבור הנדסה יעילה מבוססת CRISPR-Cas9 ובידוד שיבוטים של תא יחיד, המאפשר ייצור של נתונים פנוטיפיים חסונים וניתנים לשחזור.

נוקאאוט גנים בתיווך CRISPR-Cas9 מבוסס אלקטרופורציה בתאי THP-1 ובידוד שיבוט של תא בודד

למדו פרוטוקול למיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה. שיטה זו מאפשרת חקירת תפקיד גנים ספציפיים ברגולציה של תאי T עוזרים ומנגנוני תגובת חיסון.

מיקוד גנים רטרו-ויראלי בתיווך CRISPR/Cas9 לחקר התמיינות Th17 במבחנה

גלה סרטונים נוספים