Name: אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 6 s
Description: למדו על אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל. שיטה זו מאפשרת מסירה יעילה של חומרים לתאים תוך שמירה על חיוניות גבוהה וניטור בזמן אמת של תהליכי הביניים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>שיטת TEEI לניתוח אלקטרופורציה וחיזוי מסירה בתאי A431

<ol><li>Brooks, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+and+highly+controllable+methods+for+in+vitro+intracellular+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">High throughput and highly controllable methods for in vitro intracellular delivery.</a> Small. 16 (51), e2004917(2020).</li>
<li>Stewart, M. P., Langer, R., Jensen, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracellular+delivery+by+membrane+disruption%3A+Mechanisms%2C+strategies%2C+and+concepts%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Rev%22%5BJournal%5D)">Intracellular delivery by membrane disruption: Mechanisms, strategies, and concepts.</a> Chem Rev. 118 (16), 7409-7531 (2018).</li>
<li>Canatella, P. J., Karr, J. F., Petros, J. A., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+study+of+electroporation-mediated+molecular+uptake+and+cell+viability%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Quantitative study of electroporation-mediated molecular uptake and cell viability.</a> Biophys J. 80 (2), 755-764 (2001).</li>
<li>Pliquett, U., Gift, E. A., Weaver, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+the+electric+field+and+anomalous+heating+caused+by+exponential+pulses+with+aluminum+electrodes+in+electroporation+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochem+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Determination of the electric field and anomalous heating caused by exponential pulses with aluminum electrodes in electroporation experiments.</a> Bioelectrochem Bioenerg. 39 (1), 39-53 (1996).</li>
<li>Pan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+membrane+damage+and+cargo+delivery+in+nano-electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Cell membrane damage and cargo delivery in nano-electroporation.</a> Nanoscale. 15 (8), 4080-4089 (2023).</li>
<li>Boukany, P. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanochannel+electroporation+delivers+precise+amounts+of+biomolecules+into+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanochannel electroporation delivers precise amounts of biomolecules into living cells.</a> Nat Nanotechnol. 6 (11), 747-754 (2011).</li>
<li>Chang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Micro-%2Fnanoscale+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Lab+Chip%22%5BJournal%5D)">Micro-/nanoscale electroporation.</a> Lab Chip. 16 (21), 4047-4062 (2016).</li>
<li>Patino, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+high-throughput+localized+electroporation+workflow+with+deep+learning-based+analysis+for+cell+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Adv%22%5BJournal%5D)">Multiplexed high-throughput localized electroporation workflow with deep learning-based analysis for cell engineering.</a> Sci Adv. 8 (29), 7637(2022).</li>
<li>Sagvolden, G., Giaever, I., Pettersen, E. O., Feder, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+adhesion+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell adhesion force microscopy.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 96 (2), 471-476 (1999).</li>
<li>Ishibashi, T., Takoh, K., Kaji, H., Abe, T., Nishizawa, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+porous+membrane-based+culture+substrate+for+localized+in+situ+electroporation+of+adherent+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Sensors+Actuators+B%3A+Chem%22%5BJournal%5D)">A porous membrane-based culture substrate for localized in situ electroporation of adherent mammalian cells.</a> Sensors Actuators B: Chem. 128 (1), 5-11 (2007).</li>
<li>Mukherjee, P., Nathamgari, S. S. P., Kessler, J. A., Espinosa, H. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Combined+numerical+and+experimental+investigation+of+localized+electroporation-based+cell+transfection+and+sampling%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Combined numerical and experimental investigation of localized electroporation-based cell transfection and sampling.</a> ACS Nano. 12 (12), 12118-12128 (2018).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+equivalent+circuit+model+for+localized+electroporation+on+porous+substrates%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectron%22%5BJournal%5D)">An equivalent circuit model for localized electroporation on porous substrates.</a> Biosens Bioelectron. 199, 113862(2022).</li>
<li>Brooks, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transepithelial+electrical+impedance+increase+following+porous+substrate+electroporation+enables+label-free+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Transepithelial electrical impedance increase following porous substrate electroporation enables label-free delivery.</a> Small. 20 (25), 2310221(2023).</li>
<li>Vindiš, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+electrotransfer+into+mammalian+cells+using+commercial+cell+culture+inserts+with+porous+substrate%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Gene electrotransfer into mammalian cells using commercial cell culture inserts with porous substrate.</a> Pharmaceutics. 14 (9), 1959(2022).</li>
<li>Ye, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+electroporation+with+real-time+impedance+assessment+using+a+constriction+microchannel%5BTitle%5D)+AND+%22Micromachines%22%5BJournal%5D)">Single-cell electroporation with real-time impedance assessment using a constriction microchannel.</a> Micromachines. 11 (9), 856(2020).</li>
<li>Bednarek, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+methods+for+measuring+the+permeability+of+cell+monolayers%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vitro methods for measuring the permeability of cell monolayers.</a> Methods Protoc. 5 (1), 17(2022).</li>
<li>Harhaj, N. S., Antonetti, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+tight+junctions+and+loss+of+barrier+function+in+pathophysiology%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology.</a> Int J Biochem Cell Biol. 36 (7), 1206-1237 (2004).</li>
<li>Hunter, R. J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHunter%2C+RJ+%22Zeta+potential+in+colloid+science%3A+Principles+and+applications%22">Zeta potential in colloid science: Principles and applications</a>. 2, Academic Press. (2013).</li>
<li>Wong, P. K., Wang, T. -H., Deval, J. H., Ho, C. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrokinetics+in+microdevices+for+biotechnology+applications%5BTitle%5D)+AND+%22IEEE%2FASME+Trans+Mechatron%22%5BJournal%5D)">Electrokinetics in microdevices for biotechnology applications.</a> IEEE/ASME Trans Mechatron. 9 (2), 366-376 (2004).</li>
<li>Qian, K., Wang, Y., Lei, Y., Yang, Q., Yao, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+experimental+and+theoretical+study+on+cell+swelling+for+osmotic+imbalance+induced+by+electroporation%5BTitle%5D)+AND+%22Bioelectrochemistry%22%5BJournal%5D)">An experimental and theoretical study on cell swelling for osmotic imbalance induced by electroporation.</a> Bioelectrochemistry. 157, 108637(2024).</li>
<li>Fox, M. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electroporation+of+cells+in+microfluidic+devices%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Bioanal+Chem%22%5BJournal%5D)">Electroporation of cells in microfluidic devices: A review.</a> Anal Bioanal Chem. 385 (3), 474-485 (2006).</li>
</ol>

אלקטרופורציה היא טכניקה שבה תאים נחשפים לשדה חשמלי, ויוצרים נקבוביות זמניות בקרום התא שדרכן מטענים, כולל חלבונים, רנ"א ודנ"א, יכולים לעבור 1,2. הגרסה הנפוצה ביותר היא אלקטרופורציה בתפזורת (BEP). BEP מבוצע על ידי מילוי קובטה באלקטרוליט המכיל מיליוני תאים, חושף את האלקטרוליט למתח גבוה, ומאפשר למטען להיכנס לתאים באמצעות דיפוזיה או אנדוציטוזה1. ישנם יתרונות רבים ל- BEP, כולל תפוקה גבוהה ומערכות רבות הזמינות מסחרית. עם זאת, ישנן מגבלות למשלוח ה- BEP. מיקום תאים לא עקבי ביחס לאלקטרודות ומיגון שדה חשמלי מתאים סמוכים גורם לשונות משמעותית בחשיפה לשדה חשמלי במהלך BEP 3,4. למתח הגבוה הנדרש ל-BEP יש גם השפעה שלילית משמעותית על כדאיות התא5. מאז הקמתה בשנת 20116, יש עניין גובר בשיטת אלקטרופורציה הנקראת אלקטרופורציה של מצע נקבובי (PSEP), אם כי לעתים מתייחסים אליה בשמות אחרים, כולל אלקטרופורציה מקומית וננו-אלקטרופורציה או מיקרו-אלקטרופורציה 1,7,8. בניגוד לתרחיף התא של BEP, PSEP מתבצע על תאים הנצמדים למצע נקבובי. לא רק שמצב דבק מועדף עבור רוב קווי התאים האנושיים9, אלא שהנקבוביות במצע מתמקדות גם בזרם החשמלי, וממקמות את הפוטנציאל החשמלי הטרנסממברנלי (TMP) לאזורים ספציפיים בקרום התא10,11. לוקליזציה זו מאפשרת הפחתה משמעותית במתח המופעל, הפחתת נזק והגדלת כדאיות התא. שילוב זה של השפעות מסייע לשלוט בהתפתחות נקבוביות קרום התא, וכתוצאה מכך אספקה עקבית ויעילה יותר 1,5,12.
מחקר שנערך לאחרונה הציג מכשיר PSEP עם מערך אלקטרודות מצופה זהב בעל שש בארות להחזקת תוספות קרום נקבוביות זמינות מסחרית13 (איור 1A,B), פרקטיקה שהוצגה לראשונה על-ידי Vindis et al.14. המכשיר יכול להפעיל פולסים ולמדוד את העכבה החשמלית על פני חד-שכבה של התא, המכונה עכבה חשמלית טרנסאפיתל (TEEI), בזמן אמת13. ממשק המשתמש של המכשיר מאפשר שליטה מלאה על צורת הגל והקוטביות של האלקטרופורציה. חשוב לציין, ניתן להשתמש במדידות עכבה בזמן אמת כדי לחזות תוצאות משלוח ללא צורך בריאגנטים יקרים או בסמנים פלואורסצנטיים, מושג המכונה משלוח ללא תוויות15.
פלטפורמת PSEP מורכבת משני רכיבים חשמליים עיקריים בהתאמה אישית: הגוף העיקרי של המכשיר, המאכלס את מחולל הדופק וציוד המדידה TEEI, ומערך האלקטרודות, שבו מוכנסים המצעים הנקבוביים, והאלקטרופורציה מתרחשת. דיאגרמות עבור כל הרכיבים האלקטרוניים והמודפסים בתלת-ממד בהתאמה אישית ניתן למצוא ב- GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI. בנוסף לאלקטרוניקה המותאמת אישית, נדרש גם מחשב כדי שהפלטפורמה תתפקד כראוי. התוכנה המותאמת אישית דורשת הפעלת MATLAB (גרסה 2021a ואילך) ו- Microsoft Excel לאחסון נתונים וגישה אליהם לצורך ניתוח. התוכנית שולטת באלקטרוניקה המותאמת אישית ומספקת את ממשק המשתמש הגרפי (GUI) להתאמת הגדרות. תוכניות אלה היו זמינות גם ב- GitHub: https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI.
נתונים ראשוניים מצביעים על כך שתהליך זה אפשרי עבור סוגים שונים של תאים דבקים (איור 1C), אולם מאמר זה ידון רק בהכנה של תאי A431 באמצעות פרמטרים שנמצאו אופטימליים עבור קו תאים זה על-ידי ברוקס ועמיתיו. בנוסף, מכיוון שמטען הפרופידיום יודיד (PI) הוא ציטוטוקסי, מבוצעים שני ניסויים, הראשון עם מדיה טרנספקציה PI בריכוז גבוה כדי לכמת את יעילות המסירה, והשני עם מדיה של תרביות תאים בלבד למדידת TEEI על פני טווחי זמן ארוכים יותר. הניסויים האלה משתמשים בצורות גל אלקטרופורציה זהות, מה שמאפשר לתוצאות להיות מתואמות (איור 1D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמת הרכבת מערך אלקטרודות ונתוני יסוד. (A) מודל CAD של תוספת בתוך באר של מערך האלקטרודות. (B) מודל CAD של מערך האלקטרודות. (C) עלייה בעכבה עקב PSEP עבור קווי תאים נבחרים, n = 3 לכל קו תא. שורת שגיאה: שגיאת תקן של הממוצע. (ד) יעילות אספקה לעומת TEEI מגדילים את נתוני המתאם. יעילות המסירה חושבה על ידי חלוקת מספר התאים המסומנים הן בתמונות PI והן בתמונות קלצאין מניסויי מסירה במספר הכולל של תאים שזוהו עם Hoechst. ספירת התאים נקבעה באמצעות צינור CellProfiler מותאם אישית, n = 6 לכל מתח. שורת שגיאה: (ציר x וציר y) שגיאת תקן של הממוצע. נתון זה משוכפל מברוקס ואחרים 13 באישור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

<table><tbody><tr><td>15 מ"ל צינור צנטריפוגה חרוטי</td><td>תרמו מדעי</td><td>339651</td><td></td></tr><tr><td>2 שבבים חד פעמי המוציטומטר</td><td>בולדוג ביו</td><td>DHC-N01</td><td></td></tr><tr><td>75 ס"מ2 בקבוק תרבית רקמות</td><td></td><td>FB012937</td><td></td></tr><tr><td>A431 תאים</td><td>ATCC</td><td>CRL-1555</td><td></td></tr><tr><td>Calcein AM</td><td>Invitrogen</td><td>C3099</td><td></td></tr><tr><td>Class II סוג A2 ארון בטיחות ביולוגית</td><td>Labgard</td><td>NU-543-600</td><td></td></tr><tr><td>רכיבים מותאמים אישית</td><td>YangLab</td><td></td><td>https://github.com/YangLabUNL/PSEP-TEEI</td></tr><tr><td>צינור צנטריפוגה חד פעמי (50 מ"ל)</td> <td>fisherbrand</td><td>05-539-6</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>A5670401</td><td></td></tr><tr><td>מערכת שאיבת נוזלים</td><td>vacuubrand</td><td>20727403</td><td></td></tr><tr><td>HERACELL 240i</td><td>Thermo Scientific</td><td>51026331</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Thermo Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>פיברונקטין פלזמה אנושית</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>FIBRP-RO</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלורסנט הפוך</td><td>Zeiss</td><td>491916-0001-000</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ הפוך</td><td>Labomed</td><td>TCM 400</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>cytiva</td><td>SH30256.02</td><td></td></tr><tr><td>צינור PCR 200 ומיקרו; L</td><td>Sarstedt</td><td>72.737</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין / סטרפטומיצין</td><td>ג'יבקו</td><td>15140148</td><td></td></tr><tr><td>פיפטה (0.2-2 ומיקרו; L)</td> <td>פיפטה FBE00002</td><td></td><td></td>עלית</tr><tr><td>של פיברנד (100-1000 ומיקרו; L)</td> <td>פיפטה עלית FBE01000</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פיפטה (20-200 ומיקרו; L)</td> <td>פיפטה עלית</td><td>FBE00200</td><td></td>של</tr><tr><td>פיפטה (2-20 ומיקרו; L)</td><td>fisherbrand Elite</td><td>FBE00020</td><td></td></tr><tr><td>Propidium Iodide</td><td>Invitrogen</td><td>P1304MP</td><td></td></tr><tr><td>Response Tube 1.5 מ"ל</td><td>Sarstedt</td><td>72.690.300</td><td></td></tr><tr><td>Sorvall ST 16R צנטריפוגה</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>75004240</td><td></td></tr><tr><td>Thincert (24-well)</td><td>Greiner Bio-One</td><td>662 641</td><td>0.4 ומיקרו; קוטר נקבוביות m, 2x106 ס"מ-2 צפיפות נקבוביות,</td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות PET שקופה (24 בארות)</td> <td>fisherbrand</td><td>FB012929</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T8154-20 מ"ל</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין</td><td>Gibco</td><td>15090046</td><td></td></tr></tbody></table>

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

Porous Substrate-Based Electroporation with Transepithelial Electrical Impedance Monitoring

הפרוטוקול הנתון קובע שיטה לשימוש במדידות TEEI כדי לבחון את תהליכי הביניים של אלקטרופורציה ולבצע תחזיות מסירה, במיוחד עבור קו תאי A431 ומטען PI. בעוד שינוי פרוטוקול זה נדון בהמשך המאמר, חשוב לציין כעת כי בעוד הערכים הספציפיים עשויים להשתנות, מגמות כלליות בתגובה נשארות עקביות. לדוגמה, נתוני TEEI שיורדים מתחת לקו הבסיס הראשוני תואמים למוות תאי, בעוד שהעלייה המרבית בערך TEEI מעל המינימום תואמת ליעילות המסירה13. מגמות כלליות אלה והשלכותיהן נבחנו להלן.
כפי שמוצג באיור 2A, מגוון של מגמות מדידה של TEEI והדמיית תאים יכולות להתעורר בעת שימוש בפלטפורמת PSEP. התוצאה האידיאלית של פרוטוקול זה היא לייצר עקומה דומה לנתונים הבריאים הממוטבים המוצגים באיור 2Ai. זה מאופיין כתוצאה האידיאלית, שכן אין ירידה מתחת לקו הבסיס, המציין מעט מאוד, אם בכלל, מוות תאי. בנוסף, לעקומה הבריאה הממוטבת יש את העלייה הגדולה ביותר ב- TEEI מהמינימום, מה שמצביע על רמה גבוהה של יעילות מסירה13. המסקנות האלה נתמכות על-ידי הדמיה פוסט-PSEP של חד-שכבה של התא, אשר חושפת מוות תאי זניח וחד-שכבה בריאה של תאים (איור 2Aiii). יתר על כן, ניסוי העברה מוצלח באמצעות צורות גל זהות של PSEP יכול להיות מאופיין על-ידי התמונות המוצגות באיור 2B. יישום נכון של צורת גל אלקטרופורציה וריכוז מטען מביאים לרמה גבוהה של עקביות מסירה וכדאיות התא.
הבריאות והמפגש של חד-שכבת התא הם קריטיים ליישום מוצלח של תחזיות מסירה מבוססות TEEI16,17. אפילו עם צורת גל ממוטבת, חד-שכבה של תאים לא בריאים או לא שלמים גורמת לתגובת TEEI מופחתת, כפי שמודגם על-ידי הנתונים הלא בריאים הממוטבים באיור 2Aii. עם זאת, שימו לב שהתמונות עבור תוצאה זו (איור 2Avi) עדיין תואמות את הפרשנות של תגובת TEEI שניתנה על ידי ברוקס ואחרים 13. אין טבילה מתחת לקו הבסיס, מה שמצביע על מוות תאי קרוב לאפס (איור 2C,D). בנוסף, הגידול המופחת מהמינימום מתאים להשפעה שלילית על יעילות המסירה, מאחר שפחות תאים בשכבה החד-שכבתית מפחיתים את מסירת ה-PI הכוללת (איור 2C,D).
אם צורת גל לא אופטימלית מוחלת, ניתן לראות ירידות משמעותיות עוד יותר בתגובת TEEI. בהתאם לאנרגיה הכוללת ולמסגרת הזמן שבה היא מיושמת, צורות גל לא ממוטבות יכולות להפיק תוצאות החל מירידה ביעילות ועד להשמדה כמעט מוחלטת של חד-שכבתי התא (איור 2Ai,iii,v). הן העקומות הלא ממוטבות והן העקומות המאוד לא ממוטבות מראות ירידה משמעותית מקו הבסיס, מה שמצביע על מוות תאי משמעותי. עם זאת, צורות גל לא ממוטבות יותר ויותר מעכבות את התאוששות התא, וכתוצאה מכך יעילות המסירה פוחתת.
יעילות המסירה חושבה על ידי חלוקת מספר התאים המסומנים הן בתמונות PI והן בתמונות קלצאין מניסויי מסירה במספר הכולל של תאים שזוהו עם Hoechst. המוות חושב על ידי לקיחת התאים המסומנים ב-PI בניסויי מדידה של TEEI וחלוקה במספר הכולל של תאים שזוהו עם Hoechst. ספירת התאים נקבעה באמצעות צינור מותאם אישית של CellProfiler עבור שני המדדים.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66971/66971fig02.jpg"> איור 2: עקומות תגובת TEEI והדמיה למצבים נפוצים. (A) (i) נתוני תגובת TEEI הממחישים אחוז שינוי TEEI עבור תנאים ממוטבים ולא ממוטבים. (ii) השוואת תגובת TEEI בין חד-שכבות בריאות ולא בריאות בתנאי צורת גל אופטימליים. (ג'-ו') הדמיה מייצגת של תוצאות אפשריות עבור תנאי צורת גל אופטימליים ולא אופטימליים המראים מוות תאי (אדום) ותאים חיים (ירוק). (vi) הדמיה מייצגת של חד-שכבה לא בריאה לאחר החלת תנאי צורת גל אופטימליים המראים מוות תאי (אדום) תאים חיים (ירוק). (B) תמונות המציגות העברת PI מוצלחת (אדום), תאים חיים (ירוק) ומיקומי גרעינים (כחול). כל התמונות הובהרו לבהירות. פסי קנה מידה: 1000 מיקרומטר. (C) ירידה TEEI מקו הבסיס שלפני PSEP למינימום שלאחר PSEP ועלייה ממינימום פוסט-PSEP לשיא שלאחר PSEP עבור מתחים נתונים. (D) יעילות המסירה ואחוזי מוות של תאים עבור מתחים נתונים. קווי שגיאה מייצגים את ה- SEM (n = 6). (C,D) הועתק מברוקס ואחרים 13 באישור. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66971/66971fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Porous substrate electroporation (PSEP) is an emerging method of electroporation that provides high throughput and consistent delivery. Like many other ...

porous-substrate-based-electroporation-with-transepithelial

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

יישומים טיפוליים רבים דורשים הובלה בטוחה ויעילה של נשאי תרופות והמטענים שלהם על פני מחסומי תאים שבגוף. מאמר זה מתאר התאמה של שיטות הוקמו על מנת להעריך את השיעור ומנגנון של תחבורה של nanocarriers סמים (NCS) על פני מחסומים סלולריים, כגון במערכת העיכול (GI) אפיתל.

מודלים ושיטות להערכת תחבורה של ליפידיות פני מחסומים נייד

טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני משולב עם תאי חיים ומשמש לניטור שטף יונים על פני מחסום האפיתל במערכת העיכול. במחקר זה, עלייה בשטף יונים, הקשורים להפרעה בצומת הדוקים, הנגרמת על ידי הנוכחות של EGTA chelator סידן (גליקול-BIS אתילן (אתר בטא aminoethyl)-N, N, N ', אצטית N'-טטרה חומצה), הוא נמדדה.

חישה של שיבוש טישו גדר עם טרנזיסטור אלקטרוכימי אורגני

פרוטוקול זה מסוקר Cell-מצע חשמלי עכבת חישה, שיטה להקליט ולנתח את ספקטרום העכבה של תאי חסיד לכימות של התקשרות סלולרי, התפשטות, תנועתיות, ותגובות תאיות לגירויים תרופתיים ורעילים. זיהוי של חדירות האנדותל והערכה של קשרים בין תאים ותא מצע מודגשים.

חשמל Cell-מצע עכבת חישה לכימות של האנדותל למניעת הפצת נשק, תפקוד מחסום, ותנועתיות

שתי שיטות מוצגים כאן כדי לקבוע פונקציה מכשול המעי. מטר אפיתל (וולט/אוהם) משמש עבור מדידות של ההתנגדות החשמלית transepithelial של epithelia בתרבית ישירות בבארות תרביות רקמה. בעכברים, שיטת gavage FITC-לתוספי משמשת כדי לקבוע את חדירות המעי ויוו.

במבחנה , גישות In Vivo כדי לקבוע חדירות תאים אפיתל המעי

כאן, אנו מדגימים כיצד להגדיר וולט-אמפר-מונה זול עם תדר פלט מיתכנת שניתן להשתמש בו עם המקל מסחרית זמין אלקטרודות עבור transepi, מדידות התנגדות חשמלית החשמל.

גישה פשוטה לבצע מדידות הטיר באמצעות עצמית וולט-אמפר מונה עם תדר פלט ניתן לתיכנות

כאן, אנו מתארים את ההכנה של מונו-שכבות אפיתל מעיים שמקורן באורגנואידים אנושיים לחקר תפקוד מחסום המעיים, חדירות והובלה. מכיוון שאורגנואידים מייצגים את התגובה המקורית של רקמת האפיתל לגירויים חיצוניים, מודלים אלה משלבים את היתרונות של יכולת ההרחבה של קווי התאים ואת הרלוונטיות והמורכבות של הרקמה הראשונית.

מונו-שכבת אפיתל שמקורה באורגנואידים: מודל במבחנה רלוונטי מבחינה קלינית לתפקוד מחסום המעי

פרוטוקול זה מתאר את טכניקות המיקרו-פבריקציה הנדרשות לבניית התקן אלקטרופורציה מיקרופלואידי במעבדה על שבב. מערך הניסוי מבצע טרנספקציות מבוקרות ברמת תא בודד בזרימה רציפה וניתן להרחיב אותן לתפוקות גבוהות יותר עם בקרה מבוססת אוכלוסייה. ניתן ניתוח המציג את היכולת לעקוב באופן חשמלי אחר מידת החדירה של קרום התא בזמן אמת.

ייצור והפעלה של זרימה רציפה, מערכת מיקרו-אלקטרופורציה עם זיהוי חלחול

לחקר תגובות של תאים מעוררים במבחנה, הפרוטוקול מתאר ניטור אופטי של שינויים ביצירת פוטנציאל הפעולה עקב אלקטרופורציה במודל תא מעורר פשוט של תאי HEK מהונדסים גנטית וכן שינויים במתח הטרנסממברני עם מיצוי אוטומטי של פרמטרים רלוונטיים.

ניטור שינויים הנגרמים על ידי אלקטרופורציה ביצירת פוטנציאל פעולה בתאי HEK מהונדסים גנטית

מחקר זה מתאר פרוטוקול ליצירת חד-שכבות דו-ממדיות של אורגנואידים חזיריים שמקורם במעי הדק והגס. הצמיחה של חד-שכבות אלו מסומנת על ידי הגדלת ערכי TEER, המעידים על שלמות אפיתל חזקה. בנוסף, חד-שכבות אלה מציגות תגובות הפרשה פיזיולוגיות בניסויי תא אוסינג לאחר יישום פורסקולין.

אורגנואידים דו-ממדיים במעי חזיר המשקפים את התכונות הפיזיולוגיות של המעיים הטבעיים

פרוטוקול זה משתמש במודלים חישוביים כדי לכמת ספי אלקטרופורציה הפיכים ובלתי הפיכים באמצעות התפלגות מרחבית של תאים שעברו טרנספטציה בתוך חיקוי רקמה תלת מימדי לניתוח תפוקה גבוהה של פרוטוקולי אלקטרופורציה.

מודל רקמות תלת מימדי בעל יכולת תפוקה גבוהה לכימות ספי אלקטרופורציה

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לייצור מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי ייחודי לחקר הוויסות האלקטרומכני של הומאוסטזיס של רקמת האפיתל. המכשיר מפעיל זרמים חשמליים פיזיולוגיים סטטיים בניצב למישור הרקמה, ומשפיע על הידבקות תאים, התפשטות ושחול. הדמיית תאים חיים ומדידות מתח מכני חושפות מנגנונים של תהליכים אלה.

חשיפת בקרה אלקטרומכנית של הומאוסטזיס רקמות באמצעות מכשיר מיקרופלואידית דו-שכבתי

למדו על אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל. שיטה זו מאפשרת מסירה יעילה של חומרים לתאים תוך שמירה על חיוניות גבוהה וניטור בזמן אמת של תהליכי הביניים.

אלקטרופורציה מבוססת מצע נקבובי עם ניטור עכבה חשמלית טרנסאפיתל

גלה סרטונים נוספים