Name: זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:35:00.000+00:00
Duration: 3 min 55 s
Description: למד זיהוי הגברה גנטית בדגימות FFPE באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו. פרוטוקול זה מספק שיטה אופטימלית לחקור DNA כרומוזומלי נוסף בסרטן ולשפר את איכות הנתונים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

S.W. הוא חוקר ונתמך על ידי המכון למניעת סרטן ומחקר של טקסס (RR210034)

פרוטוקול מחקר זה אושר על ידי מועצת הביקורת המוסדית (IRB) של המרכז הרפואי של אוניברסיטת טקסס סאות'ווסטרן. הסכמה מדעת התקבלה מכל המטופלים לפני הניתוח.
1. ריאגנטים והכנת חומרים
<ol><li>הכינו את תמיסת הנתרן כלורי 0.2 N (HCl) במנדף על ידי הוספה איטית של 8.212 מ"ל HCl (37% w/w או 12.1 N) ל-491.788 מ"ל של ddH2O. יש לאחסן בטמפרטורת החדר (RT). אזהרה: הוסיפו חומצה למים באיטיות. אין להוסיף מים לחומצה.</li>
	<li>הכן תמיסת חומצת לימון 10 mM (pH 6.0) על ידי המסת 1.47 גרם של Tri-sodium ציטראט (דיהידראט) ב 400 מ"ל של ddH2O. השתמש HCl כדי להתאים ל- pH 6.0, ולאחר מכן להביא את הנפח הסופי ל 500 מ"ל עם ddH2O. אחסן את המאגר ב- RT.</li>
	<li>הכן את תמיסת 10% Tween-20 על ידי הוספת 100 μL של Tween-20 עד 900 μL של ddH2O. אחסן אותה ב- RT.</li>
	<li>הכן את פתרון IGEPAL 10% על ידי הוספת 5 מ"ל של IGEPAL CA-630 ל 45 מ"ל של ddH2O. אחסן אותו ב- RT.</li>
	<li>הכן את תמיסת SSC 20x (pH 7.0, 3 M NaCl, 0.3 M נתרן ציטראט) על ידי המסת 44.1 גרם של Tri-sodium ציטראט (דיהידראט) ו- 87.65 גרם נתרן כלורי (NaCl) ב- 900 מ"ל של ddH2O. השתמש ב- HCl כדי להתאים ל- pH 7.0, ולאחר מכן הבא את הנפח הסופי ל- 1000 מ"ל עם ddH2O. אחסן את המאגר ב- RT.</li>
	<li>הכן את פתרון SSC 2x על ידי הוספת 100 מ"ל של 20x SSC ל- 900 מ"ל של ddH2O. במידת הצורך, להוסיף 0.5 מ"ל של חומר משמר (טבלה של חומרים). אחסן אותו ב- RT.</li>
	<li>הכן את מאגר הכלאת הבדיקה על ידי ערבוב 910 μL של ddH2O, 500 μL של 20x SSC, 50 μL של 10% Tween-20, 40 μL של RNase A, 1 מ"ל של 50% דקסטרן סולפט, ו 2.5 מ"ל של פורממיד. Aliquot לתוך 1 מ"ל ולאחסן אותם ב -20 ° C.</li>
	<li>הכן את ה- SSC 0.4x עם תמיסת IGEPAL 0.3% על ידי ערבוב 100 מ"ל של 2x SSC, 15 מ"ל של 10% IGEPAL ו- 385 מ"ל של ddH2O. אחסן אותו ב- RT.</li>
	<li>הכן את 2x SSC עם פתרון IGEPAL 0.1% על ידי הוספת 5 מ"ל של 10% IGEPAL ל 495 מ"ל של 2x פתרון SSC. אחסן אותו ב- RT.</li>
	<li>יש להכין את מאגר העיכול Proteinase K לפני השימוש על ידי הוספת 1 μL של Proteinase K ל-99 μL של מאגר Tris-EDTA.</li>
	<li>הכן מלאי אחסון DAPI של 1 מ"ג/מ"ל על-ידי המסת 1 מ"ג של DAPI ב-1 מ"ל של ddH2O. אחסן אותו בטמפרטורה של -20°C והרחק מאור. הכן את פתרון העבודה של DAPI על-ידי הוספת 1 μL ממלאי האחסון של DAPI ל- 999 μL של תמיסת SSC כפולה. יש להרחיק מאור עד לשימוש.</li>
</ol>2. טיפול מקדים לדוגמה
הערה: השקופית המשמשת כאן מכילה את הדגימה.
<ol><li>התיישן את המגלשה בטמפרטורה של 60-90 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות או למשך הלילה (איור 1). הערה: שלב זה מקל על המסת פרפין. בדרך כלל, 20 דקות של חימום מספיק. ניתן להאריך אותו למשך לילה כדי להתאים ללוח הזמנים.</li>
	<li>נטרלו את המגלשה על ידי טבילתה בקסילן או בתחליפיו בצנצנת קופלין למשך 10 דקות. חזור על שלב זה עם קסילן טרי או תחליפים. בצעו את כל השלבים הבאים של טיפול מקדים ושטיפה בצנצנת קופלין. הערה: תחליפי קסילן הם חלופות בטוחות וידידותיות לסביבה לקסילן. אחד התחליפים (ראה טבלת חומרים) מתפקד טוב כמו קסילן, אם לא טוב יותר. למרות שתחליפי קסילן מייצרים פחות ריח מאשר קסילן, מומלץ להשתמש בהם בתוך מכסה אדים. אם תחליפי קסילן אינם נגישים, כל ההליכים תואמים לדפרפיניזציה מבוססת קסילן ללא שינויים.</li>
	<li>שטפו את תחליף הקסילן באתנול 100% למשך 5 דקות.</li>
	<li>יש לייבש את המגלשה עם טבילה של אתנול 70% למשך 5 דקות.</li>
	<li>טבלו את המגלשה לתוך 0.2 N חומצה הידרוכלורית (HCl) ב-RT למשך 20 דקות. הערה: HCl מחלץ ביעילות חלבונים מסיסים בחומצה, כגון חלבונים גרעיניים בסיסיים, כדי לשפר את נגישות הדנ"א לבדיקות FISH11.</li>
	<li>יש לטבול את המגלשה בתמיסת חומצת לימון חמה בעומק 10 מ"מ ולדגור בטמפרטורה של 90-95 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הערה: טיפול בחומצת לימון בטמפרטורות גבוהות מחלץ באופן דומה חלבונים מסיסים בחומצה. שני טיפולי החומצה נחשבים לחלץ חלבוני מטריצה חוץ-תאיים כדי להפחית אוטופלואורסצנטיות12. מומלץ לחמם מראש את תמיסת הלימון לטווח הטמפרטורות הרצוי לפני החלתה על המגלשה. מיקרוגל יכול להיות דרך נוחה לעשות זאת. אמבט מים, כמו למשל עם סיר סו-ויד, הוא הפתרון היעיל והחסכוני ביותר לדגירת טמפרטורה גבוהה.</li>
	<li>שטפו את השקופית לזמן קצר ב-2x SSC כדי לנטרל pH.</li>
	<li>לעכל את הרקמה על ידי הוספת 100-200 μL (מספיק כדי לכסות לחלוטין את הרקמה בהתאם לגודל של קטע) של Proteinase K digestion buffer ולדגור ב RT במשך 1 דקות. הערה: עיכול פרוטאינאז K מגביר עוד יותר את הנגישות לבדיקות FISH ומפחית אוטופלואורסצנציה. זמן העיכול צריך להיות אופטימלי על בסיס סוגי הרקמות. ברוב המקרים, 1 דקה של עיכול מספיק. עיכול יתר מוביל למורפולוגיה של גרעינים בצורת הילה, ויש לקצר את זמן העיכול.</li>
	<li>להפסיק מיד את העיכול Proteinase K ולייבש את המגלשה על ידי טבילתו לתוך אתנול 70% במשך 2 דקות, ולאחר מכן טיפול 85% ו 100% אתנול במשך 2 דקות כל אחד.</li>
</ol>3. דגים והדמיה
<ol><li>הכינו את תערובת ההכלאה של FISH על ידי דילול 2 μL של מלאי בדיקות FISH עם 8 μL של מאגר הכלאה, ולאחר מכן מרחו אותו על השקופית. כסו את הדגימה בתלוש כיסוי. הערה: מלאי בדיקות FISH הכולל בשימוש נע בין 0.5-4 μL, בהתאם לאיכות התמונה. אם האות נמוך מדי, הגדל את קלט הבדיקה. הפחיתו את קלט הבדיקה FISH אם הרקע גבוה מדי, במיוחד כאשר נצפתה פסולת פלואורסצנטית מחוץ לגרעינים. חיץ ההכלאה יכול להיות זה המסופק עם הגשושיות שנרכשו מסחרית או מוכן כמו בסעיף 1.</li>
	<li>הניחו את המגלשות על פלטה חשמלית, כגון מערכת הכלאה של חפיר שקופיות, כדי לפרק DNA בטמפרטורה של 75°C למשך 2-5 דקות. לאחר מכן, העבירו את המגלשה לפלטה חמה אחרת בטמפרטורה של 37°C כדי לבצע הכלאה למשך הלילה. הערה: אם בפלטה החמה יש מגש מים או מיכל מים כדי לשמור על הלחות במהלך הכלאה, אין צורך באיטום הכיסוי במלט גומי.</li>
	<li>לאחר הכלאה, יש לטבול את המגלשה בטמפרטורה של 40-60 מעלות צלזיוס עם 0.4x SSC מחומם עם חיץ כביסה IGEPAL CA-630 0.3%, ולאחר מכן להסיר בזהירות את הכיסוי. ממשיכים את הכביסה פעמיים במשך 5 דקות כל אחד בחושך, עם תסיסה במשך 10-15 שניות ראשונות. הערה: טבילת המגלשה במאגר הכביסה מסייעת לשחרר בעדינות את הכיסוי.</li>
	<li>שטפו את המגלשה ב-SSC עם 0.1% IGEPAL CA-630 למשך 5 דקות ב-RT בחושך, עם תסיסה במשך 10-15 השניות הראשונות.</li>
	<li>כדי להרוות אוטופלואורסצנטיות, טפל בשקופית עם ערכת המרווה האוטופלואורסצנטית (ראה טבלת חומרים) על ידי מריחת 150 μL של מגיב (50 μL + 50 μL של ריאגנטים A, B, C) למשך 2-5 דקות, ולאחר מכן שטוף אותו עם 2x SSC במשך 5 דקות. הערה: זהו שלב אופציונלי. אוטופלואורסצנטיות רקמות מקורה בעיקר ברכיבי מטריצה חוץ-תאיים, כגון קולגן ואלסטין. הוא גם מושפע באופן משמעותי מליזוזומים ולמיטוכונדריה, בזכות תכולת הליפופוצין, NADPH וקו-אנזים הפלבין שלהם. קיבוע אלדהיד ונוכחות תאי דם עשויים גם להגביר את האוטופלואורסצנטיות היטב13,14.</li>
	<li>הכתימו את המגלשה עם DAPI למשך 10 דקות. שטפו את המגלשה עם 2x SSC buffer במשך 5 דקות. הערה: אם השקופית אינה מטופלת על ידי ערכת המרווה האוטופלואורסצנטית, ניתן להפחית את צביעת DAPI לשתי דקות.</li>
	<li>טבלו במהירות את המגלשה במים נטולי יונים, למשך לא יותר משנייה אחת, ולאחר מכן יבשו אותה במהירות על ידי ספיגת לחות נוספת עם מגבת נייר. הערה: זהו שלב אופציונלי. טיפול במים שעברו דה-יוניזציה מונע ביעילות שקיעת גבישי מלח של חיץ SSC במגלשה ומשפר את איכות ההדמיה. עם זאת, בתנאי יונים נמוכים כאלה, קשרי המימן בין הגשושית FISH לבין דנ"א ממוקד נחלשים, מה שמוביל לדיסוציאציה של הגשושית ולאובדן אותות. לכן, שמירה על שלב הטיפול במים לזמן קצר מאוד היא קריטית.</li>
	<li>יבש את המגלשה ולאחר מכן טען אותה עם אמצעי הרכבה נגד דהייה. יש לאטום את הכיסוי בלק לפני ההדמיה. הערה: אם השקופית מטופלת על-ידי מגיב מרווה אוטופלואורסצנטי, טען את השקופית עם אמצעי הרכבה נגד דעיכה בהתאם להוראת היצרן. יתר על כן, בהתאם לסוג של מדיה הרכבה, התקשות או לא התקשות, הדגימה חייבת להירפא במשך 1-24 שעות לפני איטום והדמיה. מומלץ לרפא את הדגימה לפחות בן לילה כדי להשיג את מדד השבירה הטוב ביותר להדמיה.</li>
	<li>השתמש בעדשת שמן 60× כדי ללכוד אות פלואורסצנטי. השתמש בערוץ DAPI כדי לכוונן את המיקוד. הקפד להשיג ערימות Z מרובות. בדרך כלל, 5-10 z-stacks עם מרווח של 1 מיקרומטר מספיקים. בצע הקרנה תלת-ממדית מרבית כדי להשיג את הרזולוציה הטובה ביותר. החל deconvolution או אלגוריתמים אחרים לניקוי רקע כדי לשפר עוד יותר את איכות התמונה.</li>
</ol>

שיפור ניתוח FISH עבור גורמים אונקוגניים בדגימות רקמה סרטנית

<ol><li>ICGC/TCGA Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pan-cancer+analysis+of+whole+genomes%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Pan-cancer analysis of whole genomes.</a> Nature. 578 (7793), 82-93 (2020).</li>
<li>Wu, S., Bafna, V., Chang, H. Y., Mischel, P. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA%3A+An+emerging+hallmark+in+human+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Pathol%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA: An emerging hallmark in human cancer.</a> Annu Rev Pathol. 17, 367-386 (2022).</li>
<li>Luebeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+in+the+cancerous+transformation+of+Barrett%27s+oesophagus%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA in the cancerous transformation of Barrett's oesophagus.</a> Nature. 616 (7958), 798-805 (2023).</li>
<li>Nathanson, D. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+therapy+resistance+mediated+by+dynamic+regulation+of+extrachromosomal+mutant+EGFR+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Targeted therapy resistance mediated by dynamic regulation of extrachromosomal mutant EGFR DNA.</a> Science. 343 (6166), 72-76 (2014).</li>
<li>Kim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extrachromosomal+DNA+is+associated+with+oncogene+amplification+and+poor+outcome+across+multiple+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Extrachromosomal DNA is associated with oncogene amplification and poor outcome across multiple cancers.</a> Nat Genet. 52 (9), 891-897 (2020).</li>
<li>Pal Choudhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acquired+cross-resistance+in+small+cell+lung+cancer+due+to+extrachromosomal+DNA+amplification+of+MYC+paralogs%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Discov%22%5BJournal%5D)">Acquired cross-resistance in small cell lung cancer due to extrachromosomal DNA amplification of MYC paralogs.</a> Cancer Discov. 14 (5), 804-827 (2024).</li>
<li>Greytak, S. R., Engel, K. B., Bass, B. P., Moore, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accuracy+of+molecular+data+generated+with+FFPE+biospecimens%3A+Lessons+from+the+literature%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Accuracy of molecular data generated with FFPE biospecimens: Lessons from the literature.</a> Cancer Res. 75 (8), 1541-1547 (2015).</li>
<li>Chrzanowska, N. M., Kowalewski, J., Lewandowska, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+fluorescence+in+situ+hybridization+%28FISH%29+in+diagnosis+and+tailored+therapies+in+solid+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Molecules%22%5BJournal%5D)">Use of fluorescence in situ hybridization (FISH) in diagnosis and tailored therapies in solid tumors.</a> Molecules. 25 (8), 1864(2020).</li>
<li>Cui, C., Shu, W., Li, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization%3A+Cell-based+genetic+diagnostic+and+research+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization: Cell-based genetic diagnostic and research applications.</a> Front Cell Dev Biol. 4, 89(2016).</li>
<li>Finn, E. H., Misteli, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-throughput+DNA+FISH+protocol+to+visualize+genome+regions+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A high-throughput DNA FISH protocol to visualize genome regions in human cells.</a> STAR Protoc. 2 (3), 100741(2021).</li>
<li>Watters, A. D., Bartlett, J. M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescence+in+situ+hybridization+in+paraffin+tissue+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Fluorescence in situ hybridization in paraffin tissue sections.</a> Mol Biotechnol. 21 (3), 217-220 (2002).</li>
<li>Richardson, S. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-fits-all+pretreatment+protocol+facilitating+fluorescence+in+situ+hybridization+on+formalin-fixed+paraffin-embedded%2C+fresh+frozen+and+cytological+slides%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cytogenet%22%5BJournal%5D)">One-fits-all pretreatment protocol facilitating fluorescence in situ hybridization on formalin-fixed paraffin-embedded, fresh frozen and cytological slides.</a> Mol Cytogenet. 12, 27(2019).</li>
<li>Monici, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+and+tissue+autofluorescence+research+and+diagnostic+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Annu+Rev%22%5BJournal%5D)">Cell and tissue autofluorescence research and diagnostic applications.</a> Biotechnol Annu Rev. 11, 227-256 (2005).</li>
<li>Davis, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+and+diminishing+autofluorescence+in+formalin-fixed+paraffin-embedded+human+respiratory+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Histochem+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Characterizing and diminishing autofluorescence in formalin-fixed paraffin-embedded human respiratory tissue.</a> J Histochem Cytochem. 62 (6), 405-423 (2014).</li>
<li>Cancer Genome Atlas Network. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+molecular+portraits+of+human+breast+tumours%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Comprehensive molecular portraits of human breast tumours.</a> Nature. 490 (7418), 61-70 (2012).</li>
<li>Liang, Z., et al. Chromatin-associated RNA dictates the ecDNA interactome in the nucleus. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLiang%2C+Z+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2023).</li>
<li>Lange, J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+evolutionary+dynamics+of+extrachromosomal+DNA+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">The evolutionary dynamics of extrachromosomal DNA in human cancers.</a> Nat Genet. 54 (10), 1527-1533 (2022).</li>
<li>Hung, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ecDNA+hubs+drive+cooperative+intermolecular+oncogene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">ecDNA hubs drive cooperative intermolecular oncogene expression.</a> Nature. 600 (7890), 731-736 (2021).</li>
<li>Storlazzi, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+amplification+as+double+minutes+or+homogeneously+staining+regions+in+solid+tumors%3A+origin+and+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: origin and structure.</a> Genome Res. 20 (9), 1198-1206 (2010).</li>
<li>Guerin, T. M., Marcand, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Breakage+in+breakage-fusion-bridge+cycle%3A+an+80-year-old+mystery%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Genet%22%5BJournal%5D)">Breakage in breakage-fusion-bridge cycle: an 80-year-old mystery.</a> Trends Genet. 38 (7), 641-645 (2022).</li>
<li>Nguyen, H. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3D+mapping+and+accelerated+super-resolution+imaging+of+the+human+genome+using+in+situ+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">3D mapping and accelerated super-resolution imaging of the human genome using in situ sequencing.</a> Nat Methods. 17 (8), 822-832 (2020).</li>
<li>Deshpande, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+landscape+of+focal+amplifications+in+cancer+using+AmpliconArchitect%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Exploring the landscape of focal amplifications in cancer using AmpliconArchitect.</a> Nat Commun. 10 (1), 392(2019).</li>
<li>Rajkumar, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcSeg%3A+Semantic+segmentation+of+metaphase+images+containing+extrachromosomal+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">EcSeg: Semantic segmentation of metaphase images containing extrachromosomal DNA.</a> iScience. 21, 428-435 (2019).</li>
</ol>

S.W. הוא חבר במועצה המדעית המייעצת של Dimension Genomics Inc.

FISH היא אפשרות מהירה ומשתלמת לאבחון ציטוגנטי. במיוחד בקביעה אם ecDNA קיים בסרטן, ראיות FISH נשארות תקן הזהב1. FISH ברקמת FFPE מאפשר קביעה מהירה של מצב הגן בדגימות הביופסיה של המטופל, ומאפשר אבחון מהיר יותר ומעקב אחר שינויים לאורך התקדמות המחלה. טכניקה זו חשובה במיוחד לבדיקת דגימות קליניות שכבר נאספו לפתולוגיה.
פרוטוקול זה כולל מספר שלבים קריטיים. הצעד הראשון הוא deparaffinization יסודי. פרפין שיורי יכול לשבש הכלאה של FISH. אם הדגימה עדיין נראית שעווה לאחר שלב 2, יש לטפל בה שוב עם קסילן טרי או תחליפים.
שנית, מיצוי ועיכול חלבונים הם קריטיים. תהליכים אלה לא רק משפרים את נגישות הדנ"א לגשושית FISH, אלא גם מפחיתים באופן משמעותי את הפלואורסצנטיות האוטומטית. פרוטוקול זה כולל שלושה שלבי דה-פרוטאיזציה. בעוד הטיפול עם 0.2 N HCl ו 10 mM חומצת לימון הוא פשוט, העיכול proteinase K עשוי לדרוש אופטימיזציה. עיכול יתר הוא השגיאה הנפוצה ביותר בעת שימוש בפרוטאינאז K, וכתוצאה מכך גרעינים בצורת הילה. קיצור זמן העיכול ישפר את המורפולוגיה של הגרעינים. בנוסף, מומלץ לא לעכל יותר מארבע דגימות בו זמנית כדי למזער את הפרש הזמן בין הדגימה הראשונה לדגימה האחרונה. חשוב לציין כי גם גרעין שלם עשוי להופיע כהילה תחת הגדלה גבוהה ומיקרוסקופיה ברזולוציה גבוהה. הסיבה לכך היא שהגרעין אינו נמצא באותו מישור מוקד. לכן, מומלץ לקחת מספר ערימות Z ולבצע היטל מקסימלי כדי לבדוק את המורפולוגיה הגרעינית.
לבסוף, מומלץ להרוות autofluorescence. למרות שמיצוי חומצה ועיכול פרוטאינאז K יכולים להפחית באופן משמעותי את הרקע שמקורו בחלבון, מטבוליטים פלואורסצנטיים עדיין עשויים להשפיע על איכות ההדמיה.
בעוד FISH מציע רזולוציה מרחבית חסרת תקדים בזיהוי הגברה של גנים מוקדיים, יש לו מגבלות. ראשית, התוכן והתפוקה נמוכים בהשוואה לגישות מבוססות PCR או ריצוף מהדור הבא (NGS). בדרך כלל, ניתן להחיל אחת עד שלוש בדיקות FISH בצבעים שונים על שקופית אחת ללא ציוד מיוחד. עם זאת, ההתקדמות בטכנולוגיות אוטומציה הפכה את FISH בעל תוכן גבוה ותפוקה גבוהה, כגון ריצוף באתרו 21, לאפשרי. שנית, תכנון הגשושית FISH דורש מידע מוקדם. המאמצים המתמשכים לזהות אירועי הגברה מוקדית חוזרים ונשנים בסרטן אפשרו יצירת לוחות FISH מתוכננים מראש ליישומים מעבדתיים וקליניים. לדוגמה, אונקוגנים ממשפחת MYC מוגברים לעתים קרובות כ- ecDNA בסרטן ריאות של תאים קטנים כדי לתווך עמידות לכימותרפיה. לכן, פאנל FISH המתמקד בגנים MYC, MYCL ו-MYCN יכול לזרז את קביעת תגובות הטיפול בביופסיות. לשם השוואה, NGS מאפשר סינון בלתי משוחד יותר של גנים מעניינים. עם זאת, מבין הטכנולוגיות מבוססות NGS, רק ריצוף גנום שלם עם ניתוח יקר חישוב22 יכול לאפיין ecDNA.
לסיכום, אנו מציגים הנחיות חזקות ומקיפות לחקירת הגברה של גנים מוקדיים בדגימות FFPE. על ידי בחינת תבנית האות FISH, מתברר באופן חד משמעי האם וכיצד מוקד הגן מוגבר. אנו צופים שילוב של למידת מכונה בניתוח תמונה23 של גרעינים בין-פאזיים כדי לחלץ מידע ציטוגנטי לגבי מספר העתק וצורת ההגברה (כרומוזום או ecDNA), ובכך לייעל את תהליך האבחון המולקולרי ולשפר את הבנתנו את המנגנונים הפתוגנטיים בסרטן.

המחקר של הגברה אונקוגן מוקד הוא חיוני כפי שהוא מניע היווצרות סרטן, התקדמות, ועמידות לטיפול1. חשוב לציין, אונקוגנים וגנים אימונו-רגולטוריים עשויים להתעצם כדנ"א חוץ-כרומוזומלי (ecDNA), שהתורשה הא-סימטרית שלהם מקדמת הטרוגניות גנטית בסרטן 2,3. ecDNA נקשר לעמידות לטיפול ולתוצאות קליניות שליליות 4,5,6.
דגימות רקמה משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE) מייצגות משאב ארכיוני עצום במעבדות פתולוגיות, ומציעות מידע רב למחקרים רטרוספקטיביים. עם זאת, חילוץ נתונים מולקולריים מדגימות FFPE באמצעות PCR או ריצוף הוא מאתגר עקב פיצול חומצות גרעין, התפרקות וקישור צולב במהלך קיבוע7. בין מגוון הטכניקות הזמינות לאנליזה מולקולרית של רקמות FFPE, הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH) הוכחה כיעילה להדמיית רצפי DNA ספציפיים8.
למרות ההתקדמות של טכניקות אבחון מולקולאריות מודרניות, היכולת של FISH לדמיין ולכמת הגברה גנטית ברמת התא הבודד מספקת תובנות חשובות לגבי המנגנונים המולקולריים העומדים בבסיס גידולים ותוצאות קליניות. על ידי שימוש בגשושיות המסומנות באופן פלואורסצנטי המשלימות את גן המטרה המעניין, FISH יכול לפתור בנוחות את הלוקליזציה של אונקוגן ועשוי להסיק את צורת הגברת האונקוגן (כגון ecDNA) בתוך תאים בודדים, דבר שהוא בלתי אפשרי או יקר באמצעות טכנולוגיות אחרות. לכן, FISH מציעה דרך חסכונית להעריך את הטרוגניות הגידול ואת האבולוציה השבטית9. יתר על כן, ההתקדמות באוטומציה, הדמיה וניתוח חישובי אפשרה ניתוח בתפוקה גבוהה של נתוני FISH, ואפשרה כימות חזק של הגברת גנים על פני קבוצות רקמה גדולות10.
עם זאת, יישום FISH על רקמת FFPE מציב אתגרים אינהרנטיים, כולל ממצאים צולבים ואוטופלואורסצנטיות ברקע. התגברות על מכשולים אלה דורשת אופטימיזציה זהירה של כל הליך כדי להבטיח תוצאות מדויקות וניתנות לשחזור. מאמר זה מספק פרוטוקול שלב אחר שלב, ממוטב במלואו ליישום FISH כדי לחקור הגברה גנטית בדגימות רקמת FFPE. באמצעות בדיקה המכוונת למוקד הגן ERBB2 (HER2), אנו מראים כי FISH יכול לזהות מצב הגברה של ERBB2 בדגימות FFPE מחולות סרטן השד. ניתן אפילו להעריך אם ERBB2 מוגבר כ- ecDNAs. על ידי סינתזה של ספרות קיימת וממצאי הניסוי שלנו, אנו מבהירים את השיקולים המתודולוגיים, האתגרים הטכניים והמלכודות האפשריות של ניתוח מבוסס FISH. כמו כן, אנו דנים ברלוונטיות הקלינית של פרופיל הגברה גנטית בסוגי סרטן שונים, ומדגישים את משמעותו הפרוגנוסטית ואת הפוטנציאל שלו לאסטרטגיות טיפוליות מותאמות אישית.
לסיכום, מאמר זה מדגיש את חשיבותו של FISH ככלי רב ערך לחקר הגברה גנטית בדגימות רקמת FFPE, המציע תובנות חסרות תקדים על הביולוגיה של הגידול ומנחה קבלת החלטות קליניות באונקולוגיה. עם המשך השכלול והאינטגרציה עם בדיקות מולקולריות משלימות, ניתוח מבוסס FISH עומד לשפר עוד יותר את הבנתנו את הפתוגנזה של סרטן ולשפר את תוצאות המטופלים בעידן הרפואה המדויקת.

<table><tbody><tr><td>DAPI</td><td>Tocris Bioscience</td><td>5748</td><td>צביעת גרעין</td></tr><tr><td>דקסטרן סולפט 50% תמיסה</td><td>EMD Millipore Sigma</td><td>S4030</td><td>מאגר הכלאה בדיקה</td></tr><tr><td>ERBB2 (HER2) FISH Probe</td><td>Empire Genomics</td><td>ERBB2-20-RE</td><td>FISH בדיקה</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>Decon Labs</td><td>2716</td><td>רקמות מייבשות ולחות</td></tr><tr><td>פורממיד</td><td>תרמו סיינטיפיק כימיקלים</td><td>205821000</td><td>מאגר הכלאה</td></tr> בדיקה <tr><td>פורמולה 83 (תחליף קסילן)</td><td>CBG ביוטק</td><td>CH0104A</td><td>הסרת פרפין</td></tr><tr><td>חומצה הידרוכלורית</td><td>פישר כימיקל</td><td>A144-500</td><td>טיפול מקדים לדוגמא</td></tr><tr><td>IGEPAL CA-630&nbsp;</td><td>Thermo Scientific Chemicals</td><td>J19628K2</td><td>שטיפת שקופיות</td></tr><tr><td>Proclin 300</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>48914-U</td><td>חומר משמר למאגר SSC (אופציונלי)</td></tr> <tr><td>Proteinase K (800 יחידות/מ"ל)</td><td>New England Biolabs</td><td>P8107S</td><td>עיכול חלבון</td></tr><tr><td>RNase A (20 מ"ג/מ"ל)</td><td>New England Biolabs</td><td>T3018L</td><td>מאגר הכלאה</td></tr> בדיקה <tr><td>מערכת הכלאה</td> <td>של חפיר שקופיותBoekel Scientific</td><td>280001</td><td>דגנציה והכלאה של מדגם. פלטות חימום חלופיות מקובלות.</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>פישר כימיקל</td><td>S2713</td><td>מאגר SSC</td></tr><tr><td>נתרן ציטראט דיהידראט</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>FLBP3271</td><td>מאגר SSC וטיפול מקדים לדוגמא</td></tr><tr><td>מאגר Tris-EDTA (TE)</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP2473500</td><td>מאגר עיכול פרוטאינאז K</td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP337-500</td><td>מאגר הכלאה בדיקה</td></tr><tr><td>Vectashield אנטי-דהייה הרכבה</td><td>מדיה וקטור מעבדות&nbsp;</td><td>H190010</td> וקטור <td>הרכבה לשקופיות</td></tr><tr><td>TrueVIEW</td><td>Vector Laboratories&nbsp;</td><td>SP8400</td><td>ערכת מרווה אוטומטית-פלואורסצנטית</td></tr></tbody></table>

זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו

Robust Detection of Gene Amplification in Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples by Fluorescence In Situ Hybridization

הגברה של גנים מוקדיים, כגון DNA חוץ-כרומוזומלי (ecDNA), ממלאת תפקיד חשוב בהתפתחות סרטן ובעמידות לטיפול. בעוד שמתודולוגיות מבוססות ריצוף מאפשרות זיהוי בלתי משוחד של ecDNA, טכניקות מבוססות ציטוגנטיקה, כגון הכלאה פלואורסצנטית באתרו (FISH), נשארות זמן וחסכוניות לזיהוי ecDNA בדגימות קליניות. היישום של FISH בדגימות רקמה משובצות פרפין קבועות פורמלין (FFPE) מציע אפיק ייחודי לאיתור גנים מוגברים, במיוחד כאשר דגימות בנות קיימא אינן זמינות לבדיקת קריוטיפ. עם זאת, חסרים נהלים קונצנזואליים עבור טכניקה זו. פרוטוקול זה מספק הוראות מקיפות, ממוטבות לחלוטין, שלב אחר שלב לביצוע FISH לזיהוי הגברה גנטית, כולל ecDNA, בדגימות רקמת FFPE המציבות אתגרים ייחודיים שפרוטוקול זה שואף להתגבר עליהם ולתקנן אותם. על ידי ביצוע פרוטוקול זה, חוקרים יכולים לרכוש באופן משכפל נתוני הדמיה באיכות גבוהה כדי להעריך את הגברת הגנים.

השתמשנו בדגימות FFPE הן מסרטן שד חיובי ל-HER2 והן מסרטן שד שלילי כדי להדגים את התוצאה של הדמיית FISH. הגברה של HER2 (המקודד על ידי הגן ERBB2 ) היא סמן חיובי בשל הזמינות והיעילות של טיפולי מיקוד מולקולרי HER2. נהפוך הוא, חולות עם סרטן שד טריפל נגטיב, שאינן מבטאות HER2, קולטן אסטרוגן (ER) וקולטן פרוגסטרון (PR), מתמודדות עם תוצאות גרועות בשל אפשרויות טיפוליות מוגבלות. לכן, קביעת סטטוס HER2 היא קריטית במחקר וטיפול בסרטן השד15.
בדגימת סרטן השד הטריפל נגטיב, רוב הגרעינים מציגים שתי נקודות נפרדות המייצגות אותות HER2/ERBB2 FISH. לחלק מהגרעינים עשויה להיות נקודה אחת בלבד עקב הטיית חתך (איור 2, משמאל). לעומת זאת, דגימות חיוביות ל-HER2 מציגות שפע של אותות FISH עם שני דפוסים שונים. תבנית אחת מראה נקודות מפוזרות ברחבי הגרעין (איור 2, באמצע). דפוס זה הוא מאפיין של מורפולוגיה של ecDNA, שכן ecDNA לא יכול לתפוס שטח גרעיני ייחודי ומאורגן16. יתר על כן, ההפרדה הא-סימטרית של ecDNA במהלך מיטוזה גורמת לשינויים במספר ההעתקות, מה שמוביל להטרוגניות אותות בקרב גרעינים17. גרעינים מסוימים עשויים להראות צבירים מזדמנים, מה שמעיד על רכזות ecDNA18 (איור 2, מימין). הסוג השני של הגברה HER2 מציג בעיקר אגרגטים דחוסים בצורת מוט. מורפולוגיה זו מצביעה ככל הנראה על הגברה מבוססת כרומוזומים, כגון אזורי צביעה הומוגניים (HSR)19 או באמצעות מחזור שבירה-היתוך-גשר (BFB)20. יש לציין כי הגברה של ecDNA, HSR ו-BFB יכולה להתקיים יחד באותו גרעין. לכן, מומלץ לבחון גרעינים מרובים כדי להסיק את צורת ההגברה המוקדית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig01.jpg"> איור 1: סכמטי עבור FISH בדגימות FFPE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66978/66978fig02.jpg"> איור 2: תמונת FISH מייצגת בדגימות FFPE של סרטן השד. הגדלה: פי 600; סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66978/66978fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מספק שיטה הניתנת לשחזור כדי להמחיש הגברה גנטית בדגימות רקמה משובצות פרפין קבוע פורמלין (FFPE).

Focal gene amplification, such as extrachromosomal DNA (ecDNA), plays an important role in cancer development and therapy resistance. While ...

robust-detection-gene-amplification-formalin-fixed-paraffin-embedded

Research

JoVE Journal

Cancer Research

מחקר סרטן

ampliPHOX טכנולוגיית זיהוי colorimetric מוצג כחלופה זולה גילוי הקרינה עבור microarrays. בהתבסס על photopolymerization, ampliPHOX מייצר נקודות פולימר מוצק לעין עירומה רק כמה דקות. תוצאות הם צילמו אז לפרש באופן אוטומטי עם חבילת תוכנה פשוטה אך רבת עוצמה.

ampliPHOX איתור Colorimetric על ה-DNA microarray לשפעת

סרטון זה מתאר אסטרטגיית הכלאה רציפה הכוללת הכלאה של גשושיות mRNA ל-mRNA מטרה ספציפי. לאחר הכלאת הגשושיות, הגברת האות מבוצעת כדי לשפר את הרזולוציה באמצעות הפחתת יחס אות לרעש במהלך RNA-CISH של דגימות היסטולוגיות.

הכלאת בדיקה והגברת אותות בהכלאה של RNA באתרו: טכניקה לאיתור רצפי RNA ספציפיים במקטעי רקמות

הקמנו ניאון בפרוטוקול הכלאה באתרו לצורך זיהוי של גנום נגיף ה-DNA מתמשך בתוך סעיפי רקמות של מודלים של בעלי חיים. פרוטוקול זה מאפשר לימוד תהליך זיהום על ידי codetection של הגנום הנגיפי, מוצרי RNA שלו, וחלבונים נגיפיים או סלולריים בתוך תאים בודדים.

איתור של הגנום והתמלילים של וירוס ה-DNA מתמיד ברקמות עצבית על ידי פלורסנט באתרו הכלאת שילוב עם Immunostaining

כאן, אנו מציגים שיטה פשוטה לביצוע הכלאה של DNA פלואורסצנטי באתרו (DNA ISH) כדי לדמיין רצפים הטרוכרומטיים חוזרים ונשנים על כרומוזומים המותקנים בשקופיות. השיטה דורשת ריאגנטים מינימליים והיא רב-תכליתית לשימוש עם בדיקות קצרות או ארוכות, רקמות שונות וזיהוי עם אותות פלואורסצנטיים או שאינם מבוססי פלואורסצנטיות.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

המטרה של הווידאו הזה היא להדגים כיצד לבצע מיצוי DNA אוטומטי מהקווים קבוע פורמלין מוטבע פרפין התייחסות (FFPE) סטנדרטיים תא וניתוח אגל דיגיטלי PCR (ddPCR) כדי לזהות מוטציות נדירות בסביבה קלינית. זיהוי מוטציות בדגימות FFPE מדגים את התועלת הקלינית של ddPCR בדגימות FFPE.

העסקת דיגיטלי אגל PCR לזיהוי מוטציות V600E BRAF בשורות תאי ההפניה תקן קבוע פורמלין מוטבע-פרפין

לוקליזציה של ביטוי גנים לסוגי תאים ספציפיים יכולה להיות מאתגרת בשל היעדר נוגדנים ספציפיים. כאן אנו מתארים פרוטוקול לזיהוי משולש בו זמנית של ביטוי גנים על ידי שילוב של RNA פלואורסצנטי כפול הכלאה באתרו עם צביעה חיסונית.

שילוב קרינה זוגית<em&gt; באתרו</em&gt; כלאה עם Immunolabelling עבור איתור של הביטוי של שלושה גנים בסעיפי מוח עכבר

קרינה פלואורסצנטית מקומיים הכלאה (דגים) נדרש לעיתים קרובות בשילוב עם histopathology ואבחון מולקולרי לבחירה של טיפול ברפואה אישית. מקבע הרומן רקמת-קישור קרוס, ללא פורמלין המאפשר באיכות גבוהה מורפולוגיות, מולקולרית וניתוחים דגים מן הדגימה זהה על ידי תוספת של שלב קיבוע שאחרי לפני דגים מוצג.

פרוטוקול עבור HER2 דגים באמצעות מקבע-קישור קרוס, ללא פורמלין רקמות כדי לשלב את היתרונות של הקפאה-שימור קיבוע פורמלין

המתואר RNA בחיי עיר הכלאה פרוטוקול מאפשרת הגילוי של RNA כל עוברי דרוזופילה או רקמות גזור. באמצעות לוחות 96-ובכן microtiter tyramide אות הגברה, תעתיקים שניתן לאתר ברזולוציה גבוהה, רגישות, ואת התפוקה, בעלות נמוכה יחסית.

ברזולוציה גבוהה פלורסנט בחיי עיר הכלאה של עוברי דרוזופילה ורקמות באמצעות הגברה Tyramide אות

Expand-Assisted Fluorative Fluorescence In Situ Hybridization (EASI-FISH) היא טכניקה חזקה המשלבת מיקרוסקופ הרחבה עם הכלאה פלואורסצנטית באתרה (FISH) כדי לזהות ביטוי של גנים מרובים ברקמה עבה. פרוטוקול זה מתאר את ההתקדמות האחרונה בשיטה ואת התאמתה לתיוג מערכת העצבים המרכזית של דרוזופילה השלמה.

זיהוי מולטיפלקס של ביטוי גנים במוח הדרוזופילה השלם באמצעות פלואורסצנציה איטרטיבית בסיוע הרחבה בהכלאה באתרה

הפרוטוקול מתאר בדיקת הכלאה אימונופלואורסצנטית טנדם עם רקמה משובצת פרפין קבועה בפורמלין כדי לזהות ולכמת מיקרו-RNA וחלבונים מרובים בו זמנית.

הגברה וזיהוי של מיקרו-RNA באמצעות הכלאה נעולה של חומצת גרעין-באתרה כשיטת זיהוי וכימות חדשה

למד זיהוי הגברה גנטית בדגימות FFPE באמצעות הכלאה פלואורסצנטית באתרו. פרוטוקול זה מספק שיטה אופטימלית לחקור DNA כרומוזומלי נוסף בסרטן ולשפר את איכות הנתונים.

זיהוי חזק של הגברה גנטית בדגימות משובצות פרפין קבועות פורמלין על ידי הכלאה פלואורסצנטית באתרו

גלה סרטונים נוספים