מעגלים אימונומטבוליים בזיהום לקידום טיפולים מכווני מארח

ביולוגיה מערכתית מציעה תובנה לגבי הרשתות והמנגנונים הביולוגיים במודלים של זיהום, בעוד ביולוגיה סינתטית מאפשרת טיפול מדויק. אנו חוקרים את האימונומטבוליזם בזיהום לישמניה גדול ואת הפוטנציאל של מעגלים ביוסינתטיים לפתרון מחלות, ומחוללים מהפכה באימונותרפיה. בשנים האחרונות, ביולוגיה סינתטית הראתה הבטחה גדולה לקראת פיתוח אסטרטגיות חדשות ויעילות יותר להילחם בלישמניאזיס.

חלק מהפיתוחים האחרונים הם בתחום הנדסת ציטוקינים סינתטיים, מעגל סינתטי דו-יציב CRISPR-Cas9 ופפטידים סינתטיים נחקרים כטיפוליים. הפרוטוקול שלנו מכוון לחלבון המאכסן, אשר מווסת על ידי הטפיל לצורך הישרדותו. כך אנו חוקרים את ההשפעה על המעגל לא רק על הטפיל, אלא גם על הפונדקאי.

יתר על כן, חקרנו את ההשפעה של מעגל סינתטי על טיפול באורתוגונליות ובפונקציית המודולריות בעת המסירה במארח. כדי להתחיל, במחשב, פתחו את תוכנת TinkerCell ולחצו על לשונית החלקים. בחר את רכיב מקדם CMV מהספרייה והנח אותו על בד הציור כדי לסמל את מקדם cytomegalovirus בתוך המעגל הסינתטי.

לאחר מכן אחזר את אתר קשירת המדכא המקביל לאופרטור הטטרציקלין ומקם אותו בסמוך למקדם על הבד, תוך שילוב עם מקדם CMV. גרור ושחרר את אתרי הכניסה הפנימיים של הריבוזום ואת אזור הקידוד אל בד הציור, תוך שילובם עם המרכיבים הגנטיים הקיימים. שנה את שם אזור הקידוד כמדכא מגיב טטרציקלין.

מיזוג אלמנטים גנטיים אלה כדי להקל על בניית החלקים הסינתטיים. שלבו על הבד אזור ספייסר הניתן לפיצול על ידי וירוס טסכו-וירוס חזירי 12A. להציג אזור קידוד נוסף, succinate dehydrogenase או SDHA, המייצג את הגן של עניין במבנה סינתטי ולשלב אותו עם אלמנטים אחרים.

בצמוד לאזור קידוד SDHA, שלב אזור ספייסר נוסף הניתן לפיצול על ידי פרוטאז תאי טסכווירוס חזירי 12A. הציגו אזור קידוד המייצג את גן המדווח ותייגו אותו כ-GFP לתוך המבנה. לצד GFP, צרף מסיים.

כדי לאמת את היווצרותו של מעגל גנטי פונקציונלי, לחץ על חלק כלשהו של המעגל. המעגל מופיע באדום בעת לחיצה. מכרטיסיית התגובה, הקצה שיעורי ויסות למדכא המגיב לטטרציקלין, SDHA ו- GFP כדי להגדיר את תגובת התרגום בתוך המעגל הסינתטי.

הוסיפו מולקולה קטנה מלשונית החלקים וקראו לה דוקסיציקלין. כדי להקצות פונקציית גל לדוקסיציקלין, מהכרטיסייה חלקים וחיבור, בחר קלט ולחץ על קלט גל. בלשונית תגובה, לחץ על תגובת הדחקה.

גרור ושחרר את קצב התגובה על בד הציור בין dox לבין מדכא המגיב לטטרציקלין. כדי להגדיר את קינטיקה התגובה בין dox לבין tetracycline responsive repressor, לחץ פעמיים על סמל פונקציית הגל ב- dox והתאם את doxycycline.sin. משרעת ל-10.

כדי ליישם את תגובת ויסות השעתוק בין חלבון המדכא המגיב לטטרציקלין לבין אתר הקישור המדכא, בחר את התגובה מכרטיסיית התגובה והנח אותה על בד הציור בין המדחס המגיב לטטרציקלין לבין אופרטור הטטרציקלין. לחץ פעמיים על כל רכיב ותגובה כדי להגדיר ריכוז ופרמטר ראשוניים לסימולציה. לחץ על סימולציה, בחר דטרמיניסטי, והדמיה את המעגל עבור 100 יחידות זמן.

התאם את גרף הסימולציה מלוח הבקרה והתבונן בתבנית הגרף עבור SDHA וחלבוני דיכוי המגיבים לטטרציקלין. פתח את הרישום של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים, ולאחר מכן לחץ על חיפוש והזן את שם הרכיב הגנטי. כדי להשיג את רצף הנוקלאוטידים של מקדם CMV, לחץ על רצף החלק קבל ושמור את הקובץ כקובץ טקסט.

כדי לקבל את רצף קידוד החלבונים של SDHA, פתח את NCBI ובחר נוקלאוטיד מהתפריט הנפתח לצד חלון החיפוש. הקלד succinate dehydrogenase ו Mus musculus ולחפש רצף נוקלאוטידים. לחץ על CDS אפשרות כדי לקבל את רצף הקידוד של SDHA ולשמור את הרצף בקובץ טקסט.

מיזגו ברצף את רצף הנוקלאוטידים של כל חלקי הבקרה הגנטית בקובץ אחד. הוסף קודון התחלה ATG מיד לאחר רצף קוזאק והסר קודוני עצירה פנימיים כדי למנוע היווצרות של פוליפפטידים מתהווים. פתח את אתר Expasy והדבק את רצף הנוקלאוטידים.

לחץ על תרגם את רצף אופציה, ולאחר מכן בחר חמישה פריים שלוש פריים פריים אחד והסר את קודוני העצירה. כדי להתחיל, תרבית תאים RAW264.7 ב 37 מעלות צלזיוס עד 90% מפגש מושגת. הכינו את הדגימות הבאות כדי לקבוע את ההשפעה מסלקת הטפילים של המעגל הסינתטי המושרה.

גרדו את תאי RAW264.7 מבקבוק בגודל 25 סנטימטרים רבועים. צנטריפוגו את מתלה התא ב-300G למשך חמש דקות והשהו מחדש את הגלולה במיליליטר אחד של מדיום DMEM מלא. העבר 10 מיקרוליטר של תרחיף התא המושעה מחדש לתוך צינור 100 מיקרוליטר.

מוסיפים 10 מיקרוליטר של 0.5% טריפאן כחול לתאים ומערבבים היטב. טען 10 מיקרוליטר של תערובת תאים וטריפאן כחול על תא ספירת התאים וקח ספירת תאים מארבעה תאים. צלחת פעמיים 10 בחזקת ארבעה תאים לכל באר בכיסוי, מחליקה תחתית צלחת 96 באר ודגרה ב 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני במשך 24 שעות.

כדי להכין דגימה נגועה שש שעות, צנטריפוגה מיליליטר אחד של שלב נייח לישמניה גדול promastigotes ב 7, 273G במשך 10 דקות להשעות מחדש את הגלולה ב 500 מיקרוליטר של DMEM מדיום שלם. לאחר הספירה, מוסיפים פעמיים 10 בחזקת חמישה פרומסטיגוטים L.Major בצלחת תחתית 96 באר החלקה. לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שש שעות.

לאחר הדגירה, לשטוף את התאים שלוש פעמים עם PBS. כדי להכין את דגימות IMT ו- IMTI, גדל פעמיים פי 10 בחזקת חמישה פרומסטיגוטים L.Major במשך 6, 12, 18 ו -24 שעות. בצינור של 1.5 מיליליטר, מוסיפים 24 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ומיקרוגרם אחד של פלסמיד מעגל סינתטי.

בצינור נוסף של 1.5 מיליליטר, הוסף 24 מיקרוליטר של מדיום סרום מופחת ומיקרוליטר אחד של פוליאתילנימין או PEI. אני מערבבת היטב על ידי פיפטינג לפחות 10 פעמים ודוגרת בטמפרטורת החדר במשך חמש דקות. מעבירים את תערובת PEI לצינור 1.5 מיליליטר המכיל את הדנ"א ומערבבים היטב.

לדגור על הצינור במשך 10 דקות. השליכו את המדיה מהבארות על הצלחת התחתונה של מכסה 96 בארות ושטפו את התאים שלוש פעמים עם PBS. בעזרת פיפטה, מוסיפים את תערובת ה-DNA-PEI לתאים ומנערים בעדינות את הצלחת.

לדגור על התאים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני למשך שלוש שעות. לאחר מכן, הוסיפו 200 מיקרוליטר של מדיום סרום טרי מופחת לתאים, נערו בעדינות את הצלחת ודגרו במשך 24 שעות בחום של 37 מעלות צלזיוס עם 5% פחמן דו חמצני. למחרת, השליכו את המדיום.

לאחר שטיפת התאים פעמיים עם PBS, יש להוסיף לתאים מדיה מלאה המכילה גנטיצין ודוקסיציקלין ולדגור במשך 24 שעות. סימולציה של המעגל הסינתטי חשפה דינמיקה תנודתית הן ב-SDHA והן במדכא הטטרציקלין. הכנסת המעגל הסינתטי לתוך Escherichia coli DH5-alpha הביאה למושבות מותמרות שהפגינו עמידות לקנמיצין, דבר המעיד על טרנספורמציה יעילה.

טרנספקציה עם המעגל הסינתטי ואינדוקציה עם דוקסיציקלין הגדילה באופן משמעותי את ביטוי GFP בתאי IMT לאורך זמן. לאחר טרנספקציה והשראת דוקסיציקלין, נצפתה ירידה משמעותית בעומס הטפיל התוך תאי במקרופאגים נגועים. רמות הציטוקינים של אינטרלוקין 10 ואינטרלוקין 12 היו הגבוהות ביותר לאחר שש שעות לאחר ההדבקה, ללא הבדל משמעותי שנצפה בטרנספקציה והשראת מעגלים סינתטיים.

עלייה משמעותית בגורם נמק הגידול אלפא, אינטרפרון גמא וגורם גדילה בטא נצפתה בדגימת IMTI של 24 שעות, מה שמצביע על הגברת הרגולציה של ציטוקינים מעודדי דלקת.