Name: מעגלים אימונומטבוליים בזיהום לקידום טיפולים מכווני מארח (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-13T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: חקור מעגלים סינתטיים נשלטים בטטרacycline לטיפול בזיהום Leishmania major. הפרוטוקול מציג שיטה לשילוב מערכות ביולוגיה סינתטית באימונותרפיה מכוונת מארח.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

המחברים רוצים להודות למנהל המועצה למחקר וחדשנות ביוטכנולוגיה - המרכז הלאומי למדעי התא (BRIC-NCCS), פונה על התמיכה במחקר שלנו ובמתקן הביואינפורמטיקה BRIC-NCCS.

תכנון מעגלים סינתטיים מבוקרי טטרציקלין לטיפול בלישמניאזיס

<ol><li>Chen, J. Y., Zhou, J. K., Pan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunometabolism%3A+Towards+a+better+understanding+the+mechanism+of+parasitic+infection+and+Immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Immunometabolism: Towards a better understanding the mechanism of parasitic infection and Immunity.</a> Front Immunol. 12, 661241(2021).</li>
<li>Ferreira, C., Estaquier, J., Silvestre, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune-metabolic+interactions+between+Leishmania+and+macrophage+host%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Immune-metabolic interactions between Leishmania and macrophage host.</a> Curr Opin Microbiol. 63, 231-237 (2021).</li>
<li>Ty, M. C., Loke, P., Alberola, J., Rodriguez, A., Rodriguez-Cortes, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+profile+of+human+macrophages+after+Leishmania+and+Trypanosoma+cruzi+infection%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+one%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic profile of human macrophages after Leishmania and Trypanosoma cruzi infection.</a> PloS one. 14 (12), e0225588(2019).</li>
<li>Horácio, E. C. A., Hickson, J., Murta, S. M. F., Ruiz, J. C., Nahum, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Perspectives+From+systems+biology+to+improve+knowledge+of+Leishmania+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Infection+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Perspectives From systems biology to improve knowledge of Leishmania drug resistance.</a> Front Cell Infection Microbiol. 11, 653670(2021).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immuno-metabolic+signaling+in+leishmaniasis%3A+insights+gained+from+mathematical+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinfo+Adv%22%5BJournal%5D)">Immuno-metabolic signaling in leishmaniasis: insights gained from mathematical modeling.</a> Bioinfo Adv. 3 (1), vbad125(2023).</li>
<li>Mandlik, V., Limbachiya, D., Shinde, S., Mol, M., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+circuit+of+inositol+phosphorylceramide+synthase+in+Leishmania+a+chemical+biology+approach%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Synthetic circuit of inositol phosphorylceramide synthase in Leishmania a chemical biology approach.</a> J Chem Biol. 6 (2), 51-62 (2013).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biology+for+combating+leishmaniasis%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biology for combating leishmaniasis.</a> Front Microbiol. 15, 1338749(2024).</li>
<li>Volpedo, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+history+of+live+attenuated+centrin+gene-deleted+Leishmania+vaccine+candidates%5BTitle%5D)+AND+%22Pathogens%22%5BJournal%5D)">The history of live attenuated centrin gene-deleted Leishmania vaccine candidates.</a> Pathogens. 11 (4), 431(2022).</li>
<li>Almeida, F. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmaniasis%3A+Immune+cells+crosstalk+in+macrophage+polarization%5BTitle%5D)+AND+%22Trop+Med+Infect+Dis%22%5BJournal%5D)">Leishmaniasis: Immune cells crosstalk in macrophage polarization.</a> Trop Med Infect Dis. 8 (5), 276(2023).</li>
<li>Duarte, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Leishmania+type+II+dehydrogenase+is+essential+for+parasite+viability+irrespective+of+the+presence+of+an+active+complex+I%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Leishmania type II dehydrogenase is essential for parasite viability irrespective of the presence of an active complex I.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (42), e2103803118(2021).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome+profiling+identifies+genes%2Fpathways+associated+with+experimental+resistance+to+paromomycin+in+Leishmania+donovani%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Parasitol+Drugs+Drug+Resist%22%5BJournal%5D)">Transcriptome profiling identifies genes/pathways associated with experimental resistance to paromomycin in Leishmania donovani.</a> Int J Parasitol Drugs Drug Resist. 7 (3), 370-377 (2017).</li>
<li>Bolintineanu, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+changes+in+tetracycline+repressor+binding+upon+mutations+in+the+tetracycline+operator%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chem+Eng+Data%22%5BJournal%5D)">Investigation of changes in tetracycline repressor binding upon mutations in the tetracycline operator.</a> J Chem Eng Data. 59 (10), 3167-3176 (2014).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+synthetic+circuit+for+buffering+gene+dosage+variation+between+individual+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A synthetic circuit for buffering gene dosage variation between individual mammalian cells.</a> Nat Comm. 12 (1), 4132(2021).</li>
<li>Verbič, A., Praznik, A., Jerala, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+guide+to+the+design+of+synthetic+gene+networks+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">A guide to the design of synthetic gene networks in mammalian cells.</a> FEBS J. 288 (18), 5265-5288 (2021).</li>
<li>Gasteiger, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExPASy%3A+The+proteomics+server+for+in-depth+protein+knowledge+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nuc+Acid+Res%22%5BJournal%5D)">ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis.</a> Nuc Acid Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
<li>Rabhi, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+signature+of+Leishmania+infected+mice+macrophages%3A+a+metabolic+point+of+view%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic signature of Leishmania infected mice macrophages: a metabolic point of view.</a> PLoS Negl Trop Dis. 6 (8), e1763(2012).</li>
<li>Renkema, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SDHA+mutations+causing+a+multisystem+mitochondrial+disease%3A+novel+mutations+and+genetic+overlap+with+hereditary+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Human+Gene%22%5BJournal%5D)">SDHA mutations causing a multisystem mitochondrial disease: novel mutations and genetic overlap with hereditary tumors.</a> Eur J Human Gene. 23 (2), 202-209 (2015).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Artificial+intelligence+channelizing+protein-peptide+interactions+pipeline+for+host-parasite+paradigm+in+IL-10+and+IL-12+reciprocity+by+SHP-1%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Mol+Basis+Dis%22%5BJournal%5D)">Artificial intelligence channelizing protein-peptide interactions pipeline for host-parasite paradigm in IL-10 and IL-12 reciprocity by SHP-1.</a> Biochim Biophys Acta Mol Basis Dis. 1868 (10), 166466(2022).</li>
<li>Khandibharad, S., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+ATAC+sequencing+identifies+sleepy+macrophages+during+reciprocity+of+cytokines+in+L.+major+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Spectr%22%5BJournal%5D)">Single-cell ATAC sequencing identifies sleepy macrophages during reciprocity of cytokines in L. major infection.</a> Microbiol Spectr. 12 (3), e0347823(2024).</li>
<li>Costello, A., Badran, A. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+biological+circuits+within+an+orthogonal+central+dogma%5BTitle%5D)+AND+%22Trend+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Synthetic biological circuits within an orthogonal central dogma.</a> Trend Biotechnol. 39 (1), 59-71 (2021).</li>
<li>Cooling, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standard+virtual+biological+parts%3A+a+repository+of+modular+modeling+components+for+synthetic+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Standard virtual biological parts: a repository of modular modeling components for synthetic biology.</a> Bioinformatics. 26 (7), 925-931 (2010).</li>
<li>Brophy, J. A. N., Voigt, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+genetic+circuit+design%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Principles of genetic circuit design.</a> Nat Meth. 11 (5), 508-520 (2014).</li>
<li>Chan, V. W., Dreolini, L. F., Flintoff, K. A., Lloyd, S. J., Mattenley, A. A. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aChan%2C+VW+%22The+effect+of+increasing+plasmid+size+on+transformation+efficiency+in+Escherichia+coli%22">The effect of increasing plasmid size on transformation efficiency in Escherichia coli</a>. , (2002).</li>
<li>Rouches, M. V., Xu, Y., Cortes, L. B. G., Lambert, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+plasmid+system+with+tunable+copy+number%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">A plasmid system with tunable copy number.</a> Nat Comm. 13 (1), 3908(2022).</li>
<li>Li, P., He, Y., Zhang, J., Fang, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-dependent+metalloprotease+1+promotes+apoptosis+of+RAW264.7+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Chinese+J+Cell+Mol+Immunol%22%5BJournal%5D)">Zinc-dependent metalloprotease 1 promotes apoptosis of RAW264.7 macrophages.</a> Chinese J Cell Mol Immunol. 31 (12), 1585-1587 (2015).</li>
<li>Stein, S. C., Falck-Pedersen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sensing+adenovirus+infection%3A+activation+of+interferon+regulatory+factor+3+in+RAW+264.7+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Sensing adenovirus infection: activation of interferon regulatory factor 3 in RAW 264.7 cells.</a> J Virol. 86 (8), 4527-4537 (2012).</li>
<li>Cheung, S. T., Shakibakho, S., So, E. Y., Mui, A. L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transfecting+RAW264.7+cells+with+a+luciferase+reporter+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transfecting RAW264.7 cells with a luciferase reporter gene.</a> J Vis Exp. (100), (2015).</li>
<li>Fus-Kujawa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+overview+of+methods+and+tools+for+transfection+of+eukaryotic+cells+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">An overview of methods and tools for transfection of eukaryotic cells in vitro.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 701031(2021).</li>
<li>Das, A. T., Tenenbaum, L., Berkhout, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tet-On+systems+for+doxycycline-inducible+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Tet-On systems for doxycycline-inducible gene expression.</a> Curr Gene Ther. 16 (3), 156-167 (2016).</li>
<li>De Boeck, J., Verfaillie, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Doxycycline+inducible+overexpression+systems%3A+how+to+induce+your+gene+of+interest+without+inducing+misinterpretations%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Doxycycline inducible overexpression systems: how to induce your gene of interest without inducing misinterpretations.</a> Mol Biol Cell. 32 (17), 1517-1522 (2021).</li>
<li>Wu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((5-Methoxyl+Aesculetin+abrogates+lipopolysaccharide-induced+inflammation+by+suppressing+MAPK+and+AP-1+pathways+in+RAW+264.7+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">5-Methoxyl Aesculetin abrogates lipopolysaccharide-induced inflammation by suppressing MAPK and AP-1 pathways in RAW 264.7 Cells.</a> Int J Mol Sci. 17 (3), 315(2016).</li>
<li>Tomiotto-Pellissier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+polarization+in+Leishmaniasis%3A+Broadening+horizons%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Macrophage polarization in Leishmaniasis: Broadening horizons.</a> Front Immunol. 9, 2529(2018).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

התוצאות המתקבלות מדגישות את היעילות של הצינור, אשר כבר מתועל לתכנון ויישום של מעגל סינתטי. בניית המעגל הסינתטי הזה הייתה צעד לקראת פיתוח רפואה מדויקת למחלות זיהומיות כמו לישמניאזיס. באמצעות הרכבה בסיליקו של חלקים גנטיים וסימולציה דטרמיניסטית, נוטרה ההשפעה המודולרית הייחודית של מערכת Teton. השפעת המעגל, יש לציין, עשויה הייתה להוביל לביטוי דו-יציב הדדי של TetR ו-SDHA/GFP. הביטוי של SDHA היה מחזורי, מה שעשוי להצביע על כך שרק בנוכחות דוקסיציקלין הביטוי שלו גדל. כדי לצפות בשינויים אפשריים בדפוסי ביטוי לאורך תקופה, נבחרה יחידת זמן של 100. התוצאות מצביעות על כך שהמעגל הסינתטי הראה התנהגות מחזורית עבור TetR ו-SDHA/GFP, שככל הנראה מיוחסת לאופיו האורתוגונלי21. הרכבת חלקים גנטיים מרישום החלקים של iGEM מילאה תפקיד מרכזי, שכן היא סיפקה רכיבים גנטיים הדרושים לבניית מעגלים סינתטיים22. סידור מודולרי של חלקים גנטיים הוא חיוני מכיוון שהתרגום והתפקוד של המעגל עלולים להיפגע, מה שעלול להוביל לביטוי לא יעיל ולאפקט מודולרי בתאים23.
גודל ההוספה של המעגל הסינתטי היה בערך 1.3 קילובייט כדי להבטיח שגודל הווקטור לא יהיה גדול מדי, מה שעלול להפחית את יעילות הטרנספורמציה24. בחירת וקטור מתאים היא שלב קריטי מכיוון שהוא חייב להיות בעל חלקים גנטיים, החיוניים להגדלת מספר העותקים במערכת החיידקים ולהניב העתק פלסמיד גבוה, ומנגנון הביטוי שלו חייב להסתגל היטב במערכת היונקים25. וקטור pEGFP-N1 מאופיין היטב בקו התאים RAW264.7 ובעל מבנה פלסמיד קומפקטי עם אתר שיבוט מרובה26. פתרונות חיץ מתוקננים במעבדה שימשו לבידוד פלסמיד כדי להבטיח ייצור של פלסמיד מרוכז וטהור מאוד, אשר אומת באמצעות הערכה ספקטרופוטומטרית ו- AGE. החדרת המעגל הסינתטי לווקטור pEGFP-N1 אומתה באמצעות עיכול הגבלה, והדגימות נותחו על AGE וריצוף. תוצאות AGE ייצגו רצועת הוספה של 1.3 קילו-בתים, רצועת 4.7 קילו-בתים של וקטור pEGFP-N1 ורצועת 6 קילו-בתים של המעגל הסינתטי כולו. 
טרנספקציה באמצעות יחס של 1:1, 1:2 ו-2:1 של DNA: בוצעה יחסי PEI, כאשר היחס שנצפה של 1:1 עבד בצורה הטובה ביותר מבלי לשבש את המורפולוגיה של התא (הנתונים לא מוצגים). מומלץ להשתמש בריכוז 400 מיקרוגרם/מ"ל - 1000 מק"ג/מ"ל של G418 לבחירת תאים נגועים27. 500 מיקרוגרם / מ"ל של G418 שימש לבחירת תאים נגועים מכיוון שהוא דיכא ביעילות את הצמיחה של תאים שאינם נגועים מבלי לפגוע בצמיחת תאים או במורפולוגיה של תאים נגועים (הנתונים אינם מוצגים). בהתחשב בחשיבותו של פנוטיפ התא ביעילות הטרנספקציה, במיוחד בקווי תאי מקרופאגים, שיכולים לעבור התמיינות ולהפוך למאתגרים לטרנספקציה, מספר מעבר נמוך של קו התאים RAW264.7 שימש להתמרה28. מספרי מעבר תאים עשויים גם להיות גורם קריטי ביעילות הטרנספקציה. מספר מעבר גבוה עלול להוביל להעברה לא יעילה29. Dox הוא הגורם המועדף למערכת ההשראות Tet-ON בגלל יעילות הקישור הגבוהה שלו ל-TetR, פיזור רקמות חיובי, רעילות נמוכה וזמן מחצית חיים של 24 שעותו-30. לאחר הטרנספקציה, תאים הושרו עם dox במשך 24 שעות, והם נצפו עבור ביטוי GFP. עבור תאי RAW264.7, ריכוז הדוקס המשמש להשראת מעגל סינתטי היה 1 מיקרוגרם/מ"ל אשר נופל בטווח המומלץ של 1-2 מיקרוגרם/מ"ל31 (הנתונים אינם מוצגים). עם זאת, הרגולציה של ריכוז SDHA לאחר האינדוקציה לא נקבעה. באופן כללי, הקביעה והסטנדרטיזציה של מספר מעבר התא, DNA: ריכוז PEI, ריכוז סמן בחירת טרנספקציה של יונקים וריכוז השראת דוקסיציקלין הם גורמים מכריעים בתהליך הטרנספקציה.
בעקבות השראת המעגל הסינתטי לאחר ההדבקה בנקודות זמן שונות, נצפתה ירידה משמעותית בעומס הטפיל התוך-תאי. השוואה של עומסי הטפילים בין דגימות נגועות לדגימות IMTI חשפה עומס נמוך יותר בתאים המושרים עם המעגל הסינתטי, ככל הנראה מיוחס לביטוי SDHA. מכיוון שביטוי SDHA קשור לייצור NO, תאי IMTI נצפו כבעלי צורה מורפולוגית לא סדירה ומחוספסת, המתרחשת בקו התאים RAW264.7 כאשר NO מיוצר32. רמות IL-10 ו- IL-12 לאחר זיהום של 6 שעות היו הגבוהות ביותר מכיוון שדווח כי שני הציטוקינים מווסתים בנקודת זמן זו, אשר עוברת שינוי פנוטיפי נוסף כדי לייצר IL-10 יותר מאשר IL-1219. מכיוון שרמות IL-10 ו- IL-12 לא שינו באופן משמעותי לאחר הטרנספקציה, ובדגימות IMTI בוצע פרופיל ציטוקינים כדי לזהות תגובות ציטוקינים מעודדות ואנטי דלקתיות. 
רמות ביטוי של TNF-α, IFN-γ ו- TGF-β זוהו בדגימות IMTI של 6 שעות, IMT ו- 24 שעות. כדי לחסל טפילים תוך-תאיים, TNF-α ו-IFN-γ חיוניים בעיקר מכיוון שהם גורמים להתפרצויות חמצון באמצעות ייצור NO. מקרופאגים מקוטבים M2 מבטאים TGF-β, אשר מוריד ציטוקינים מעודדי דלקת33. דגימת IMTI של 24 שעות הראתה ביטוי מוגבר של TNF-α ו- IFN-γ מאשר TGF-β, מה שמרמז על כך שהמקרופאגים, לאחר העברה וזיהום עם L. major, עשויים היו מקוטבים לפנוטיפ מבטא ציטוקינים פרו-דלקתיים. המחקר, אם כן, מספק תובנה לגבי השינויים הפנוטיפיים הנגרמים על טרנספקציה עם מעגל סינתטי ומדגיש את דינמיקת הזיהום. ניתן לחקור את ההשפעה של המעגלים הסינתטיים כטיפוליים, שכן האינדוקציה שלהם הגדילה את ביטוי הציטוקינים הפרו-דלקתיים באופן משמעותי בהשוואה לציטוקין אנטי דלקתי. לפיכך, המחקר לא רק ביסס את צנרת הבנייה וההולכה של מעגלים סינתטיים, אלא גם הוכיח את הפוטנציאל הטיפולי שלו במודל לישמניאזיס באמצעות הגברת הרגולציה של ציטוקינים פרו-דלקתיים בתאים מארחים מאותגרי לישמניה.

התקדמות הרפואה ההוליסטית והאינטגרטיבית מהווה קשר משמעותי שזוהה בין שינויים מטבוליים בתאי מערכת החיסון לבין יכולתם לווסת את הפנוטיפ של תאי מערכת החיסון במחלות זיהומיות. מטבוליזם חיסוני מציע פרספקטיבות חדשות להבהרת הפתוגנזה של מחלות זיהומיות נפוצות בבני אדם. יתר על כן, הוא מספק טכניקות מבטיחות לפיתוח חיסונים ותרופות על ידי זיהוי מטרות חדשות להתערבות1. תכנות מחדש מטבולי של תאי מערכת החיסון מזוהה במחלות זיהומיות שונות, כולל לישמניאזיס. לישמניה spp. אחראי לגרימת לישמניאזיס, אשר לישמניה מז'ור (L. major) גורמת ללישמניאזיס עורי (CL). L. טפילים עיקריים גורמים להשפעה משמעותית על חילוף החומרים של תאים מארחים, במיוחד במקרופאגים, לצורך התרבות והישרדות כטפילים תוך-תאיים2. מקרופאגים יכולים בדרך כלל להתקוטב לתת-קבוצות המופעלות באופן קלאסי (M1) או לחילופין מופעלות (M2) שבהן תאי M1 מכילים הפרשת ציטוקינים פרו-דלקתית גבוהה וייצור של תחמוצת החנקן (NO) באמצעות חילוף החומרים של מיני חנקן. תאי M2 מפגינים רמות גבוהות של ציטוקינים אנטי דלקתיים ומפגינים פעילות ארגינאז גבוהה באמצעות מטבוליזם של חנקן3. לכן, שני הפנוטיפים לא רק נבדלים זה מזה בתגובה החיסונית שלהם, אלא גם במסלולים המטבוליים שלהם.
ביולוגיה מערכתית של לישמניאזיס שואפת לזהות מטרות מולקולריות לתכנון טיפולים חדשניים באמצעות תכנון ופיתוח תרופות. שחזור רשתות איתות ומסלולים מטבוליים מסייע בהבנת הלישמניאזיס כמודל הוליסטי ומפיק תובנות לזיהוי המרכיב העיקרי המניע את המצב החולה. מודלים מתמטיים הם אחת הגישות האנליטיות השימושיות המועדפות ביותר להבנת המורכבות של לישמניאזיס4. רשתות אימונומטבוליות ומודלים מתמטיים אפשרו זיהוי של סוקצינאט דהידרוגנאז (SDHA) כמרכיב מרכזי בפנוטיפ M1, המתבטא בחיסול הטפיל5. לביולוגיה סינתטית יש יישומים באבחון, פיתוח חיסונים וטיפולים בלישמניאזיס. מטבוליזם הממוקד באפנון תגובה חיסונית יכול להיות מושג באמצעות כלים ביולוגיים סינתטיים. עבור אפנון של סינתאז אינוזיטול פוספוריל סרמיד המווסת את חילוף החומרים של ספינגולפידים ומשנה את האיתות החיסוני של המאכסן, נעשה שימוש במעגל גנטי בעל התנהגות דו-יציבה כדי לכוונן באופן סינתטי את החוסן הפנימי של L. מודל זיהום מז'ורי 6,7. לפיכך, מערכות וביולוגיה סינתטית יכולות לספק פלטפורמה מבוססת מודל להנדסה גנטית לפיתוח רפואה מדויקת במערכת מודל לישמניה.
פנוטיפ M1 מסומן על ידי ביטוי של רשתות איתות אימונו-מטבוליות שבהן הייצור של ציטוקינים דלקתיים ומסלולים מטבוליים משפר באופן סינרגטי את חיסול הטפילים. קיטוב M1 מסמל ייצור של ציטוקינים מעודדי דלקת כגון אינטרלוקין-12 (IL-12), אינטרפרון-גמא (IFN-γ) וגורם נמק הגידול אלפא (TNF-α). מסלולים מטבוליים המועשרים מאוד בפנוטיפ M1 כוללים גליקוליזה, מסלול פנטוז פוספט ומחזור חומצה טריקרבוקסילית קטועה (מחזור TCA)5. מחזור TCA הקטוע מכוון את מכונות סילוק הטפילים באמצעות רמות סוקצינאט וציטראט מוגברות, המדריכות את הייצור של NO3. הצטברות של סוקצינאט על ידי SDHA מובילה להפעלה של גורם שעתוק גורם היפוקסיה-אינדוקציה 1-אלפא (HIF-1α), אשר גורם לייצור של IL-1β8. בפנוטיפ M2 נצפים חמצון חומצות שומן, עלייה בניצול גלוטמין וזרחן חמצוני משופר של גלוקוז יחד עם ייצור ציטוקינים אנטי דלקתיים כגון אינטרלוקין-10 (IL-10), התמרת גורם גדילה בטא (TGF-β), אינטרלוקין-4 (IL-4) ואינטרלוקין-13 (IL-13)3. M2 מציג מיטוכונדריה מוארכים כתכונה ייחודית, המובילה ליעילות משופרת בייצור אנרגיה. הם משתמשים בחומצות שומן, גלוקוז וגלוטמין כמצעים כדי לתדלק את מחזור TCA, ובכך מייצרים ATP באמצעות זרחן חמצוני בקצב גבוה יותר כדי לקדם צמיחה ושגשוג של טפילים9. אנזים SDHA האחראי להצטברות סוקצינאט באמצעות TCA קטוע יכול לא רק לקדם ייצור NO אלא גם ליזום צריכת חמצן תלוית סוקצינאט באמצעות הובלת אלקטרונים10. במקרופאגים נגועים בלישמניה, SDHA מווסת פי 2.17, מה שמצביע על כך שגם הנשימה האירובית עשויה להיות מופחתת11. על מנת להגביר את צריכת הסוקצינאט כדי לגרום לייצור NO בתיווך ציטוקינים מעודדי דלקת ולקדם סילוק טפילים, ביטוי של SDHA הוא חיוני.
המעגל הסינתטי מציע טיפולים מדויקים וממוקדים שעשויים לשנות את המערכת החולה כדי להשיג תנודה דו-יציבה שעשויה לשחזר פנוטיפ בריא ברמה המרחבית-טמפורלית. העברת המעגל הסינתטי והביטוי הופכים את המערכת לדינמית וחזקה. גורם מרכזי אחד התורם לקידום הביולוגיה הסינתטית טמון ביכולת להרכיב חלקים ואלמנטים גנטיים באופן מודולרי כדי לאפשר יצירת ארכיטקטורות מורכבות ופונקציות מותאמותאישית 12. אילוצים הקשורים לטכניקות ביטוי מסורתיות דרבנו את הופעתם של מעגלים סינתטיים אינדוקטיביים מבוססי אופרון טטרציקלין, ובכך אפשרו הערכה מהירה של פלסמיד והעברה קלה בין סוגי תאים שונים13. חלבון TetR, כאשר הוא קיים כדימר, מפגין זיקה חזקה לאופרון טט (TetO), ומדכא למעשה שעתוק. עם זאת, עם האינטראקציה של הליגנד שלו, דוקסיציקלין (dox), TetR עובר שינוי מבני, וכתוצאה מכך ניתוקו מ-TetO, וכתוצאה מכך מאפשר לשעתוק להתקדם ללא הפרעה. מעגל זה יכול להציג בקרת תרגום חלבונים14. לכן, באמצעות המתודולוגיה שהוגדרה, המעגל הסינתטי המתוכנן מבוסס אופרון טטרציקלין איפשר לבטא SDHA בווקטור pEGFP-N1. הערכת יעילות הטרנספורמציה של המעגל ותפוקתו סיפקה תובנות לגבי יכולת המסירה. באמצעות הגבלת העיכול של הווקטור, אושרה קביעת יעילות השיבוט. יתר על כן, קו תאי מקרופאג עכבר RAW264.7 נגוע שמקורו במקרופאגים פריטוניאליים של עכברי Balb/c נצפה עבור ביטוי חלבון פלואורסצנטי ירוק תלוי מינון דוקסיציקלין (GFP) בתאים נגועים. בנוסף, אפקט חיסול הטפיל בתאים נגועים אומת עם ביטוי של המעגל הסינתטי. יתר על כן, נצפו אינדוקציה וביטוי של ציטוקינים פרו דלקתיים, אשר כוונו באמצעות עלייה בנקודת הזמן של זיהום במעגל הסינתטי נגוע ומושרה תאים, אשר היה קשור ישירות עם תפקוד של המעגל הסינתטי.

<table><tbody><tr><td>10 &mu; טיפים L</td><td>Tarson</td><td>521050</td><td></td></tr><tr><td>10X מאגר הגבלה</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>הגבלת עיכול</td></tr><tr><td>1 מ"ל טיפים</td><td>Tarson</td><td>521016</td><td></td></tr><tr><td>1 מ"ל צינור</td><td>Eppendorf</td><td>30121023</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu; L טיפים</td><td>Tarson</td><td>521010</td><td></td></tr><tr><td>25cm2 בקבוק</td><td>קורנינג</td><td>430639</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>4',6-diamidino-2-phenylindole</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>D1306</td><td>מכתים גרעיניים</td></tr><tr><td>50 מ"ל צינור</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>60 מ"מ לוחות</td><td>Falcon</td><td>353002</td><td></td></tr><tr><td>6X TrackIt מאגר</td> <td>טעינה ציאן/כתוםThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>טעינת דגימות עבור AGE</td></tr><tr><td>96 באר כיסוי צלחת תחתונה</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>160376</td><td>להדמיה קונפוקלית וטרנספקציה</td></tr><tr><td>96 באר מיקרו צלחת בדיקה שטוחה Tarson</td><td></td><td>941196</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td>עבור AGE</td></tr><tr><td>Agarose ג'ל אלקטרופורזה</td><td>מכלול GeNei</td><td>93</td><td>עבור AGE</td></tr><tr><td>זרימה למינרית חיידקית</td><td>ESCO Lifesciences</td><td>2120765</td><td>לטרנספורמציה</td></tr><tr><td>סידן כלורי</td><td>Merck</td><td>C4901</td><td>הכנת חוצץ / מגיב</td></tr><tr><td>תרבית תאים זרימת אוויר למינרית</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>1323TS</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>מגרד תאים</td><td>Genetix</td><td>90020</td><td>לתרבית</td></tr><tr><td>תאים מפזר תאים</td><td>פישר </td> צנטריפוגה <td>12822775</td><td></td></tr><tr><td>מדעית לצינורות 1.5 מ"ל</td> צנטריפוגה <td>EP5404000537</td><td></td><td>אפנדורף</td></tr><tr><td>לבז 50 מ"ל</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>75004210</td><td></td></tr><tr><td>כלורופרומי</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>67-66-3</td><td>לחממת CO2 לבידוד RNA</td></tr><tr><td></td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>3110</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>Cuvette</td><td>Eppendorf</td><td>6138000018</td><td>אומדן ריכוז הפלסמיד</td></tr><tr><td>CYTIVA IQ 500 מצלמת ג'ל</td><td>Cytiva</td><td>29655893</td><td>עבור AGE</td></tr><tr><td>DEPC מטופל H2O 1000 מ"ל</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>750023</td><td>לבידוד RNA</td></tr><tr><td>דוקסיציקלין</td><td>Merck</td><td>33429</td><td>לאינדוקציה של תאים מועברים</td></tr><tr><td>, בלוק חימום יבש</td><td>Labnet</td><td></td><td>לטרנספורמציה והשבתה של אנזימי הגבלה</td></tr><tr><td>Dulbecco's Modified Eagle Medium</td><td>המרכז הלאומי למדעי</td><td></td> התא <td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>אתנול</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>1.00983</td><td>הכנת חוצץ / ריאגנט</td></tr><tr><td>אתידיום ברומיד</td><td>סיגמא</td><td>E7637</td><td>עבור AGE</td></tr><tr><td>אתילנדיאמין חומצה טטראצטית</td><td>Fischer Scientific</td><td>12635</td><td>Buffer / הכנת ריאגנטים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ Evos brightfield</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>AMEX1000</td><td></td></tr><tr><td>ExPasy</td><td>https://web.expasy.org/translate/</td><td></td> <td>לבניית מעגל סינטטי</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Gibco</td><td>16000-044</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>תוכנת FV31S-SW</td><td>Olypmus</td><td></td><td>רכישת תמונה</td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Gibco</td><td>1563411</td><td>לטרנספקציה</td></tr><tr><td>שיטת הרכבה גיבסון לשיבוט</td><td>BIOMATIK</td><td></td><td>בניית מעגל סינטטי</td></tr><tr><td>Graphpad פריזמה</td><td>Graphpad</td><td></td><td>ניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>ערכת שעתוק הפוך cDNA בקיבולת גבוהה</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4368814</td><td>לסינתזת cDNA</td></tr><tr><td>איזופרופנול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>13825</td><td>הכנת חוצץ/ריאגנט</td></tr><tr><td>Kanamycin</td><td>Sigma</td><td>60615</td><td>לטרנספורמציה ובחירת מושבה</td></tr><tr><td>מרק לוריא ברתיני</td><td>Himedia</td><td>M1245</td><td>לתרבית E.coli</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד</td><td>Fischer Scientific</td><td>BP214</td><td>הכנת חוצץ/ריאגנט</td></tr><tr><td>מיקרו פילט מיקרופילט זרימת אוויר למינרית אנכית</td><td>מיקרופילט</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp מהיר 8 צינורות רצועה, 0.1 מ"ל</td><td>ThermoFischer 4358293 מדעי</td><td></td><td>עבור qRT-PCR</td></tr><tr><td>מיקרו אמפר אופטי 8-כובע רצועות</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4323032</td><td>עבור qRT-PCR</td></tr><tr><td>מיקרוגל</td><td>תנור LG</td><td>MC-7649DW</td><td>עבור AGE</td></tr><tr><td>Mm00434228_m1 (IFN-&gamma;)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman בדיקות</td></tr><tr><td>Mm00443258_m1 (TNF)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman בדיקות</td></tr><tr><td>Mm01321739_m1(TGFB)</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4331182</td><td>Taqman בדיקות</td></tr><tr><td>עכבר ELISA Kit IL-10</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS614</td><td>עבור ELISA</td></tr><tr><td>עכבר ELISA Kit IL-12</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>BMS616</td><td>עבור ELISA</td></tr><tr><td>Multiskan Sky עם מסך מגע + &mu; צלחת טיפה</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>51119600DP</td><td>עבור ELISA</td></tr><tr><td>MX-M מיקסרים מיקרופלייט 96 בארות תרבית תאים מיקסר צלחת מתכוונן 0-1500 סל"ד מעבדה שייקר מערבל</td><td>DIAB</td><td></td><td></td></tr><tr><td>המרכז הלאומי לביוטכנולוגיה מידע</td><td>https://www.ncbi.nlm.nih.gov</td><td></td><td>לבניית מעגל סינטטי</td></tr><tr><td>תא נויבאואר</td><td>מרינפלד מעולה</td><td>640010</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>לא מאוורר 25 ס"מ2 בקבוק</td><td>קורנינג</td><td>353014</td><td>לטיפוח טפיל</td></tr><tr><td>NotI</td><td>BioLabs</td><td>R3189M</td><td>אנזים הגבלה</td></tr> מים <tr><td>ללא נוקלאז</td><td>Biodesign</td><td>1QIA</td><td>הכנת ריאגנטים</td></tr><tr><td>תא אולימפוס סנס מימד שולחן עבודה 2.3 תוכנת</td><td>Olypmus</td><td></td><td>עיבוד תמונה</td></tr><tr><td>אולימפוס FV 3000</td><td>אולימפוס</td><td></td><td>להדמיה קונפוקלית</td></tr><tr><td>מדיה OPTI-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>מדיה לטרנספקציה</td></tr><tr><td>וקטור pEGFP-N1 משובט עם מעגל סינטטי</td><td>Biomatik</td><td></td><td></td></tr><tr><td>פניצילין</td><td>ThermoFischer</td><td>Scientific 15070063</td><td>לתרבית תאים</td></tr><tr><td>פוליאתילנימין</td><td>MERCK</td><td>764965</td><td>לטרנספקציה</td></tr><tr><td>אשלגן אצטט</td><td>פישר Scientific</td><td></td><td>YBP364500 הכנת מאגר / ריאגנט</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>פישר Scientific</td><td>BP366</td><td>הכנת מאגר / ריאגנט</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>P5655</td><td>הכנת מאגר / ריאגנט</td></tr><tr><td>חבילת אספקת חשמל</td><td>BIORAD</td><td>1645070</td><td>לרישום AGE</td></tr><tr><td>של חלקים ביולוגיים סטנדרטיים</td><td>https://parts.igem.org/Main_Page</td><td></td><td>לבניית מעגל סינטטי</td></tr><tr><td>RNAiso Plus</td><td>Takara</td><td>38220090</td><td>לבידוד</td></tr><tr><td>RNA RNase A</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td></td><td>12091021 Buffer / Reagent</td></tr><tr><td>Institute Roswell Park Memorial Institute Medium</td><td>National Center for Cell Science לטיפוח</td><td></td><td></td></tr><tr><td>חממת שייקר</td><td>טפילים REMI</td><td>CIS 24 plus</td><td>לתרבית E.coli</td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>Qualigens</td><td>Q27605</td><td>הכנת מאגר / ריאגנט</td></tr><tr><td>נתרן דודציל סולפט</td><td>סיגמא-אולדריץ</td><td>' L3771</td><td>הכנת חוצץ / ריאגנט</td></tr><tr><td>נתרן הידרוקסיד</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15895</td><td>הכנת מאגר / מגיב</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא</td><td>S5136</td><td>מאגר / מגיב הכנה</td></tr><tr><td>ספקטרופוטומטר</td><td>אפנדורף</td><td></td><td>אומדן ריכוז פלסמיד</td></tr><tr><td>ספין ווין</td><td>טרסון</td><td>1020</td><td></td></tr><tr><td>StepOne פלוס מערכת PCR בזמן אמת</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>272006777</td><td>עבור qRT-PCR</td></tr><tr><td>תוכנת StepOne גרסה 2.3</td><td>טכנולוגיות</td><td></td><td>חיים עבור qRT-PCR</td></tr><tr><td>TaqMan מהיר אוניברסלי PCR מאסטר מיקס (2X), ללא AmpErase UNG</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>4366072</td><td></td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td> טינקר <td>בנייה וסימולציה של מעגלים סינתטיים</td></tr><tr><td>TrackIt 1 Kb Plus סולם DNA</td><td>ThermoFischer Scientific</td><td>10488085</td><td>עבור AGE</td></tr><tr><td>Tris (הידרוקסימתיל) אמינומתאן הידרוכלוריד</td><td>Himedia</td><td>MB029</td><td>הכנת מאגר / ריאגנט</td></tr><tr><td>Tris-acetate-EDTA</td><td>SERVA</td><td>42549.1</td><td>הכנת חוצץ / ריאגנט</td></tr><tr><td>טריפן כחול</td><td>סיגמא</td><td>T8154</td><td>לספירת תאים</td></tr><tr><td>XhoI</td><td>BioLabs</td><td>R0146S</td><td>אנזים הגבלה</td></tr></tbody></table>

מעגלים אימונומטבוליים בזיהום לקידום טיפולים מכווני מארח

Immunometabolic Circuits in Infection for Advancing Host Directed Therapies

אימונומטבוליזם הוא גורם מכריע בהתקדמות הלישמניאזיס. גישה המבוססת על ביולוגיה סינתטית זכתה לתשומת לב משמעותית כצעד לקראת התערבות טיפולית המתמקדת בגורמים הקשורים למארח המניעים לישמניאזיס. ביולוגיה סינתטית כרוכה בהנדסה של רכיבים גנטיים באופן אורתוגונלי ומודולרי כדי לווסת במדויק מערכות ביולוגיות, תוך הקניית פונקציות חדשות לתאים. במחקר המוצג, הבהרה של צינור שיטתי לפיתוח מעגל סינתטי מבוסס טטרציקלין אינדוקטיבי (TetON) נועדה לספק דהידרוגנאז סוקצינאט כסוכן טיפולי כדי להקל על חיסול טפילי לישמניה תוך תאיים. הפרוטוקול המתואר מתאר את התכנון של מעגל סינתטי ואת האימות הבא שלו. האסטרטגיה המוצעת מתרכזת גם בשילוב מעגלים סינתטיים בעמוד השדרה של הפלסמיד כרכב משלוח. בנוסף, מכונות משלוח המשתמשות בננו-חלקיקים מבוססי פוליפלקסים להעברת מעגלים סינתטיים שימשו בקווי תאי מקרופאגים מורינים מבלי לפגוע במורפולוגיה התאית. נעשתה סטנדרטיזציה של השיטה לבחירת תאים נגועים וקביעת ריכוז אינדוקציה אופטימלי לביטוי מעגלים סינתטיים. תצפיות חושפות הפחתה מובהקת בעומס הטפיל התוך-תאי בתאים נגועים בהשוואה לתאים נגועים. ציטוקינים מעודדי דלקת באו לידי ביטוי לאחר ההדבקה בתאים סינתטיים שעברו זיהוק וגרמו להם כמנגנון לקידום סילוק טפילים. זה מדגיש את השיטה המבוססת על ביולוגיה סינתטית כגישה חזקה בלישמניאזיס על ידי התמקדות בגורמים מארחים הקשורים להתקדמות המחלה.

סידור החלקים הגנטיים המרכיבים את המעגל הסינתטי לביטוי המעגל הסינתטי מוצג באיור 1A. החלקים המתאימים שוכפלו בווקטור pEGFP-N1 בצורה אורתוגונלית ומודולרית, המיוצגת באיור 1B. הסימולציה של המעגל הסינתטי חשפה דינמיקה תנודתית הן ב-SDHA והן במדכא הטטרציקלין. תצפית זו מצביעה על דפוס ביטוי הדדי המאופיין בפונקציות גל מחזוריות. העלייה בריכוז SDHA עשויה להיות מיוחסת להשראת דוקסיציקלין, בעוד שהביטוי של TetR עשוי לנבוע מירידה ברמות של דוקסיציקלין (איור 1C). בהינתן הביטוי התנודתי המושרה של SDHA ו-TetR שנצפה בסיליקו, תוכננה ויושמה אסטרטגיה להעברת מעגל סינתטי באמצעות וקטור פלסמיד pEGFP-N1.
חלקי iGEM שזוהו במחקר כוללים BBa_K1493803 עבור TetO, BBa_K4344028 עבור רצף Kozak, BBa_C0040 עבור TetR ו-BBa_K1537016 עבור P2A, בהתאמה. מזהה ההצטרפות של NCBI עבור SDHA הוא NM_025848. רכיבים אלה הורכבו כדי לבנות מעגל סינתטי TetON המושרה על ידי דוקסיציקלין, המשתרע על פני סך של 1317 זוגות בסיסים (קובץ משלים 1). מכיוון ש-TetO מתפקד כאלמנט מווסת DNA, הרצף שלו לא תורגם. הרצף במורד הזרם של רצף קוזאק, המשתרע מ-5' TetR עד לקצה 3' של P2A, הממוקם במורד הזרם של SDHA, נבחר באימות סיליקו של תרגום. התצפית חשפה את היעדרם של קודוני עצירה פנימיים, מה שהבטיח תרגום רצוף לכל אורך הרצף (קובץ משלים 2). החלקים הרגולטוריים של מעגל סינתטי בהיקף של 1317 bp הוכנסו בין אתרי הגבלה NotI ו-XhoI, שנמצאים 5' במעלה הזרם של EGFP (איור 1B). תוצאות הרצף מדגישות שרצף ההוספה שוכפל בפלסמיד (קובץ משלים 3).
הכנסת מעגל חיסוני-מטבולי לזן E. coli DH5α הובילה לצמיחתן של מושבות מותמרות המציגות עמידות לקנמיצין, האנטיביוטיקה המשמשת כסמן סלקטיבי במהלך טרנספורמציה חיידקית. הנוכחות השופעת של מושבות שעברו טרנספורמציה על לוח הבחירה הייתה גבוהה יותר, מה שמרמז על כך שהתאים המוכשרים הציגו פוטנציאל גבוה לטרנספורמציה, מה שמעיד על יעילות פרוטוקול הטרנספורמציה שנעשה בו שימוש (איור 1D).
מושבה אחת בודדה ונזרעה ב 10 מ"ל של LB בתוספת קנמיצין לבידוד פלסמיד. תפוקת הפלסמיד הנגזרת מתרבית של 10 מ"ל מפורטת בטבלה 1. שיטה סטנדרטית לבידוד פלסמיד הופעלה עבור הליך זה. תמיסות החיץ הוכנו יום לפני בידוד הפלסמיד, ותנאי הדגירה הותאמו כדי למקסם את תפוקת הפלסמיד. ריכוז הפלסמיד שהתקבל עלה על 1 מיקרוגרם / μL, עם יחסים של 260/280 ו- 260/230 העולים על 1.8 ו- 2.0, בהתאמה. ממצאים אלה מצביעים על כך שהפלסמידים שבודדו היו בעלי טוהר גבוה וללא מזהמים כגון חלבונים, EDTA, פחמימות ופנול.
שינוי הניידות האלקטרופורטית עבור המעגל הסינתטי המבודד הוערך. עיכול ההגבלה בוצע באמצעות אנזימי הגבלה NotI ו- XhoI, שכן אלה היו אתרי ההגבלה שבהם הוכנס המעגל הסינתטי. שתי רצועות נצפו על ג'ל אגרוז 1%, רצועה אחת ליד 1500 bp ואחת בין 4 kb ל 5 kb. בהתחשב בכך שגודל ההוספה הוא 1317 bp, סביר להניח שהפס ב- 1500 bp מתאים ל- insert. לווקטור pEGFP-N1 יש גודל של 4.7 קילובייט. לפיכך, הרצועה ליד 5 kb היא בהנחה להיות וקטור pEGFP-N1. כתוצאה מכך, הוסק כי מעגל סינתטי שלם ושלם נמצא בתוך וקטור המסירה. נוסף על כך, זוהה פס של כ-6 קילו-בתים עבור המעגל הסינתטי השלם והלא מעוכל, מה שמצביע על כך שווקטור pEGFP-N1 מכיל תוספת של כמעט 1.3 קילו-בתים בתוך וקטור הפלסמיד (איור 1E).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig01.jpg"> איור 1: תכנון ותיקוף של מעגל סינתטי. (A) ייצוג מעגלים סינתטיים על ידי הרכבה של חלקים גנטיים ורכיבים רגולטוריים. (B) גרף סימולציה דטרמיניסטי המראה ביטוי מחזורי של SDHA ו-TetR ביחידות זמן של 100. (C) מושבות סינתטיות של E. coli DH5α עמידות בפני קנמיצין. היחידה היא יחידה בת 100 זמן מכיוון שהיא סימולציה דטרמיניסטית. (D) אלקטרופורזה של ג'ל אגרוז של מעגל סינתטי שלם ומעוכל הגבלה באמצעות אנזימי הגבלה NotI ו- XhoI. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>ריכוז פלסמיד (מק"ג/מ"ל)</td>
			<td>260/280</td>
			<td>260/230</td>
		</tr><tr><td>1248.5</td>
			<td>1.95</td>
			<td>2.45</td>
		</tr><tr><td>1123.1</td>
			<td>1.89</td>
			<td>2.43</td>
		</tr><tr><td>1155.8</td>
			<td>1.87</td>
			<td>2.41</td>
		</tr><tr><td>1056.8</td>
			<td>1.94</td>
			<td>2.47</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: תפוקת מבנה מעגל סינתטי המתקבל לאחר בידוד פלסמיד. הטבלה מציגה את ריכוז הפלסמיד במק"ג/מ"ל, ביחס של 260/280 ו-260/230.
בתאי הבקרה ובתאים הנגועים, עוצמת הפלואורסצנטיות שנצפתה הייתה נמוכה עבור GFP. עם זאת, טרנספקציה של המעגל הסינתטי עם יחס של 1:1 של פלסמיד ו- PEI עם 500 מיקרוגרם / מ"ל G418 ואינדוקציה עם 1 מיקרוגרם / μL dox נצפתה כגורמת לביטוי GFP גבוה בתאי IMT. בתאי IMTI של 6 שעות, ביטוי GFP היה גם גבוה יותר באופן משמעותי, אם כי ביטוי GFP היה נמוך יותר מאשר במדגם IMT (איור 2A,B). יתר על כן, נצפתה עלייה בביטוי GFP בדגימות IMTI של 12 שעות, 18 שעות IMTI ו- 24 שעות IMTI. עלייה זו עשויה לנבוע מעלייה בזמן ההדבקה, אשר עשויה הייתה לגרום לשינויים מטבוליים גבוהים יותר במקרופאגים על ידי טפיל מגורים17. רמות SDHA תוך תאיות עשויות להיות מושפעות עקב עלייה בזמן ההדבקה18. כאשר דוקס נוסף לדגימות IMTI אלה, רמות SDHA באמצעות מעגלים סינתטיים עשויות היו לעלות, ובכך להוביל לעלייה בביטוי של SDHA.
צביעת DAPI נעשתה כדי לזהות את מספר הטפילים החיים במקרופאגים. במקרופאגים נגועים עיקריים של 6 שעות , המספר שנצפה של טפילים תוך-תאיים היה 6 תאים לכל מקרופאג, שהוא גבוה יותר בהשוואה למדגם IMTI של 6 שעות, שבו היו 1-2 טפילים תוך-תאיים לכל מקרופאג. לאחר טרנספקציה והשראת דוקס, נצפתה ירידה משמעותית בעומס הטפילים התוך-תאיים בנקודות זמן שונות של הדבקה (איור 2C). תצפיות הראו כי מעגלים סינתטיים עשויים לגרום להשפעות מסלקות טפילים על ידי גירוי ביטוי SDHA.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig02.jpg"> איור 2: מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי. תמונות של דגימות 'בקרה', 'נגוע', 'IMT' ו'IMTI'. (A) ניתוח ביטוי של GFP בכל דגימות הניסוי עם סרגל קנה מידה של 50 מיקרומטר לביקורת, 6 שעות נגועות ו-IMT, 20 מיקרומטר ל-6 שעות IMTI, 10 מיקרומטר ל-12 שעות IMTI, 18 שעות IMTI, 24 שעות IMTI בהתאמה. הערוצים בהם נעשה שימוש היו DIC, DAPI, GFP ותמונות ממוזגות של כל הערוצים. (B) ANOVA חד-כיווני עם מבחן תיקון של Tukey של כל דגימות הניסוי (n=3) עבור ביטוי GFP (p &lt; 0.05 נחשב משמעותי) קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. (C) בוצע ניתוח ANOVA חד-כיווני עם בדיקת תיקון של Tukey של עומס הטפילים ב-100 תאי מקרופאגים עבור דגימות מ-(A) (n=3) (p &lt;-0.05 נחשב משמעותי). קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
זיהוי רמות IL-10 ו- IL-12 במדיה של כל הדגימות גילה כי ריכוז IL-10 ו- IL-12 היה הגבוה ביותר לאחר 6 שעות לאחר ההדבקה עם ירידה ברמות הציטוקינים לאחר זיהום 24 שעות. לא היה הבדל משמעותי ברמות IL-10 ו- IL-12 לאחר טרנספקציה ואינדוקציה של מעגלים סינתטיים. כמו כן, היה הבדל לא משמעותי ברמות IL-10 ו- IL-12 בדגימות נקודות זמן IMTI (איור 3). הדגימה הנגועה של 6 שעות כבר דווחה כמראה ביטוי של IL-10 ו- IL-1219,20, התבוננות בהבדל לא משמעותי ב- IL-10 ו- IL-12 גרמה לנו לחקור את ההשפעה של מעגל סינתטי על ציטוקינים אחרים.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig03.jpg"> איור 3: ELISA של IL-10 ו-IL-12 כדי לזהות את רמות ההפרשה שלהם במדיה של דגימות שונות. דגימות (n = 2) כוללות בקרה, 6 שעות נגועות, 24 שעות נגועות, IMT, 6 שעות IMTI, 12 שעות IMTI, 18 שעות IMTI, 24 שעות IMTI. בוצע ניתוח ANOVA דו-כיווני עם בדיקת התיקון של טוקי (עמ' &lt;.05 נחשב משמעותי). קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
זיהוי רמות תעתיק של TNF-α, IFN-γ ו-TGF-β בדגימות IMTI נגועות של 6 שעות, IMT ו-24 שעות גילה כי נצפתה עלייה משמעותית ב-TNF-α פי 2.5 בדגימת IMTI של 24 שעות בהשוואה לדגימות זיהום ו-IMT (איור 4). במדגם IMTI של 24 שעות, נצפתה עלייה של פי 35 ברמות IFN-γ בהשוואה לדגימות זיהום ו- IMT. רמות TGF-β, למרות שהן הראו עלייה משמעותית פי 1.5 במדגם IMTI של 24 שעות, שינוי הקיפול היחסי היה נמוך יותר בהשוואה ל- TNF-α ו- IFN-γ, דבר המצביע על כך שציטוקינים מעודדי דלקת מווסתים באופן משמעותי בדגימת IMTI של 24 שעות.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66980/66980fig04.jpg"> איור 4: ניתוח qRT-PCR של ציטוקינים. (A) TNF-α, (B) IFN-γ ו-(C) TGF-β עבור 6 שעות דגימות IMTI נגועות של 6 שעות (n=2). בוצע ANOVA חד כיווני עם מבחן התיקון של טוקי (p &lt; 0.05 נחשב משמעותי). קווי שגיאה מייצגים סטיית תקן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/66980fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
קובץ משלים 1: רצף נוקלאוטידים של חלקים גנטיים שהורכבו ליצירת המעגל הסינתטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%201_RE.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: רצף מתורגם של מעגל סינתטי המבטא TetR, P2A ו-SDHA. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%202_RE.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 3: תוצאת ריצוף של המעגל הסינתטי המשובט בפלסמיד pEGFP-N1. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66980/Supplementary%20file%203_RE.docx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

כאן מוצג פרוטוקול לתכנון, בנייה ואספקה של מעגל סינתטי מבוסס טטרציקלין מבוקר טטרציקלין. ניתן ללמוד את השפעת המעגלים הסינתטיים על סילוק טפילים וביטוי ציטוקינים על ידי תיעול הצינור המוצג. פרוטוקול זה רלוונטי לחוקרים החוקרים טיפולים מבוססי מעגלים סינתטיים במחלות זיהומיות.

Immuno-metabolism is a pivotal determinant in the progression of leishmaniasis. Synthetic biology-based approach has garnered significant attention as a ...

immunometabolic-circuits-infection-for-advancing-host-directed

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

מונוציטים הם מרכיבים אינטגרליים של מערכת החיסון המולדת האנושית המסתמכים על חילוף חומרים גליקוליטי כאשר הם מופעלים. אנו מתארים פרוטוקול זרימה ציטומטרית למדידת ביטוי טרנספורטר גלוקוז וספיגת גלוקוז על ידי סך כל המונוציטים ותת-אוכלוסיות המונוציטים בדם מלא טרי.

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

פרוטוקול זה מתאר כיצד לחסן עכברי C57BL/6J בזן EGD של ליסטריה מונוציטוגנס (L. monocytogenes) ולמדוד תגובות אינטרפרון-γ (IFN-γ) על ידי תאי הרג טבעי (NK), תאי T הורגים טבעיים (NKT) ולימפוציטים מסוג T אדפטיביים לאחר הדבקה. פרוטוקול זה מתאר גם כיצד לבצע מחקרי הישרדות בעכברים לאחר הדבקה במינון LD50 שונה של הפתוגן.

זיהום הניסיון עם<em&gt; חיידקי ליסטריה</em&gt; כמודל תגובות לימוד מארח אינטרפרון-γ

פרוטוקול זה מתאר עבודה מפורט עבור הדור של ex-vivo אפיון של וירוסים oncolytic ביטוי של immunomodulators, באמצעות וירוסי חצבת קידוד bispecific תא T engagers כדוגמה. יישום והתאמה וקטור פלטפורמות אחרות, transgenes נאיץ את ההתפתחות של הרומן immunovirotherapeutics לתרגום קליניים.

Paramyxoviruses עבור Immunomodulation, ממוקדות הגידול: הערכה לשעבר Vivo ועיצוב

אנו מתארים היקפית אנושית תא היקפי (pbmc)-מבוסס הומניזציה מודל העכבר מבע שתלת עבור מחקר translational-אונקולוגיה. פרוטוקול זה יכול לשמש כמנחה כללי להקמת ולאפיון מודלים דומים להערכת הטיפול של I-O.

תא היקפי של דם מונאפרור (PBMC) חרט הומניזציה מודל Xenograft עבור מחקר הטרנסג-אונקולוגיה (I-O)

בעידן האימונותרפיה והפרופיל הגנומי של התא הבודד, ביולוגיה של סרטן דורשת כלים חדשניים במבחנה וחישוביים לחקר הממשק הגידולי-חיסוני בהקשר מרחבי-זמני נכון. אנו מתארים פרוטוקולים לניצול תרביות מיקרופלואידיות מיקרופלואידיות של גידולים חיסוניים בסביבות דו-ממדיות ותלת-ממדיות, התואמים לניטור דינמי ורב-פרמטרי של תפקודים תאיים.

מודלים של תרבית משותפת מיקרופלואידית לניתוח התגובה החיסונית במיקרו-סביבות גידוליות במבחנה

בדיקות חיסוניות מבוססות דם מלא מספקות כלי קל וחסכוני במשאבים לניתוח חסינות ספציפית לאנטיגן למטרות אבחון ומחקר. מאמר זה מספק פרוטוקול אופטימלי מבוסס דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח מקיף של חסינות המאכסן לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים, כולל גרסה בנפח נמוך עבור חולים ילדים ובעלי חיים קטנים.

בדיקת דם מלא עם גירוי משותף כפול לניתוח ספציפי לאנטיגן של חסינות המארח לפתוגנים פטרייתיים ונגיפיים

דוח זה מתאר פרוטוקול אוטומטי לבדיקות אימונופלואורסצנטיות מרובות (mIF) על מכתים שקופיות אוטומטי. זה מדגים את יכולת השחזור הגבוהה של פרוטאומיקה מרחבית על צביעות רקמות סטנדרטיות בתפוקה גבוהה ומצלמות פלואורסצנטיות שלמות, שהיא אידיאלית עבור מבחני mIF מותאמים אישית על פני מספר רב של שקופיות רקמה במחקר תרגומי.

מבחני אימונופלואורסצנציה אוטומטיים מרובים בתפוקה גבוהה למחקר תרגומי

הפרוטוקול הנוכחי מתאר זרימת עבודה ניסויית המאפשרת ניתוח ex vivo של גירוי תאי T אנושיים במערכת תרבית משותפת אלוגנית עם תאי גידול שטופלו מראש.

ניתוח פעילות תאי T אנושיים במסגרת תרבית משותפת אלוגנית של תאי גידול שטופלו מראש

מאמר זה מתאר שיטה צדדי כדי ליצור תאים שמקורם ברקמה טבעות על ידי הרכבה עצמית הסלולר. לתאי שריר חלק seeded לתוך בצורת טבעת המצרפי בארות agarose חוזה ליצירת חזקים תלת ממדי (3D) ברקמות בתוך 7 ימים. מילימטר בקנה מידה טבעות רקמה תורמת בדיקות מכניות לשמש כאבני בניין להרכבת רקמות.

בימוי נייד הרכבה עצמית לפברק Cell-נגזר טבעות רקמות לניתוח biomechanical הנדסת רקמות

פרוטוקול זה מדגים שיטות להקים סביבות 2 ד ו 3D ב אישית מעוצבת חדרי electrotactic, אשר יכולים לעקוב אחר...

שדה חשמלי מבוקר בימוי הגירה של ובתאים עצביות בסביבות 2 ד ו 3D

חקור מעגלים סינתטיים נשלטים בטטרacycline לטיפול בזיהום Leishmania major. הפרוטוקול מציג שיטה לשילוב מערכות ביולוגיה סינתטית באימונותרפיה מכוונת מארח.

מעגלים אימונומטבוליים בזיהום לקידום טיפולים מכווני מארח

גלה סרטונים נוספים