Name: הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:40:00.000+00:00
Duration: 6 min 24 s
Description: חקור מודל תרבית משותף של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה לחקר מחלות ניווניות בעין. השיטה מאפשרת הבנה מעמיקה של תפקידי המיקרוגליה בפתולוגיה הרטינלית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

מחקר זה נתמך על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82101145) והקרן למדעי הטבע של בייג'ינג (Z200014).

מחקר זה אושר על ידי ועדת האתיקה המוסדית של בית החולים טונגרן בבייג'ינג, האוניברסיטה הרפואית קפיטל. קו תאי HESCs H9 היה ממכון המחקר WiCell. חממו מראש את מדיום תרבית התאים בטמפרטורת החדר (RT) במשך 30 דקות לפני הניסוי.
1. דור של מיקרוגליה אנושית
<ol><li>תרבית את תאי גזע עוברי גזע עובריים בתווך תאי גזע עד שצפיפות התאים מגיעה ל-80%-90%. זרעו לפחות 1 x 106 תאים בכל באר.</li>
	<li>שאפו את מדיום תאי הגזע ושטפו את התאים עם 1x DPBS (1 מ"ל / באר של 6 צלחת באר). השלב הבא דורש 2 x 107-1 x 108 תאים. אם לא מספיק, לשלב תאים של 2-5 בארות לעשות את השלבים הבאים.</li>
	<li>נתק את מושבות תאי הגזע באמצעות תמיסת EDTA של 0.5 mM למשך כ -5 דקות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס (1 מ"ל / באר של צלחת 6 באר).</li>
	<li>בדוק מורפולוגיה של המושבה לאחר 5 דקות. כאשר קצוות המושבה מכורבלים מעט עם רווחים רופפים, התאים מוכנים להתמיין ולשאוף את ה- EDTA. אם לא, לדגור על תאים ב 37 ° C במשך 1-2 דקות נוספות. אין לדגור יותר מ-8 דקות.</li>
	<li>שטפו בעדינות את התאים בכל באר באמצעות 6 מ"ל של Medium A (טבלה 1) עם 6 μL של 10 mM ROCK inhibitor Y-27632 solution. טפחו בעדינות על תחתית הכלי כדי לסייע בשטיפת התאים. הגדר את היום כיום 0. הערה: אין לקשט את התאים. תאים ייצרו גופים עובריים (EBs) למחרת.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, התבוננו בתאים מתחת למיקרוסקופ כדי לאשר את היווצרות EB. אסוף את ה- EBs לתוך צינור צנטריפוגלי של 15 מ"ל עם צינור של 10 מ"ל והמתן עד שה- EBs ישקעו לתחתית תוך 5 דקות.</li>
	<li>שאפו בזהירות את הסופרנאטנט והשעו מחדש את ה-EBs עם 6 מ"ל של מדיום A טרי והעבירו אותם לבאר חדשה בעלת הדבקה נמוכה של צלחת 6 בארות. תרבות באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס. הערה: מטרת העברת הבאר ביום הראשון היא להפחית את ההשפעה של מספר רב של תאים מתים במהלך תהליך היווצרות EB, אשר עשוי להשפיע על מצב צמיחת התאים.</li>
	<li>רעננו את מדיום A הטרי מדי יום עד יום 4 (6 מ"ל/באר של צלחת 6 בארות).</li>
	<li>ביום 4, מצפים צלחת 10 ס"מ עם 3 מ"ל של 0.1% תמיסת ג'לטין דגים לפחות 1 שעה באינקובטור 5% CO2, 37 ° C. הערה: אם זמן הציפוי הוא פחות משעה אחת, קשה לבצע את השלבים הבאים.</li>
	<li>בזהירות לאסוף את EBs לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל עם צינור 10 מ"ל ולחכות EBs לשקוע לתחתית בתוך 5 דקות.</li>
	<li>הסר את תמיסת הג'לטין 0.1% ושטוף את הכלי בגודל 10 ס"מ פעם אחת עם 5-6 מ"ל של DPBS 1x. הסר את DPBS.</li>
	<li>השהה מחדש בעדינות את ה- EBs עם 15 מ"ל של Medium B (טבלה 1) בצינור הצנטריפוגלי של 15 מ"ל והעבר אותם לצלחת המצופה בקוטר 10 ס"מ. תרבות ב 37 °C, 5% CO2 אינקובטור במשך שבוע אחד. הערה: בשבעת הימים הראשונים, אל תזיזו את המנה.</li>
	<li>יש להתרענן עם מדיום B טרי פעם בשבוע עד ליום 49 (צלחת של 15 מ"ל/10 ס"מ), ולבחון את התאים תחת המיקרוסקופ פעם בשבוע. הערה: לאחר יום 49, ניתן למצוא מספר תאי הפרשה בסופרנאטנט בצלחת התרבית.</li>
	<li>צנטריפוגה את התאים supernatant ב 200 x גרם במשך 5 דקות ב RT.</li>
	<li>בזהירות לשאוף את supernatant ו resuspend את התאים עם 2 מ"ל של מדיום B טרי ולהעביר לתוך באר חדשה הדבקה נמוכה של צלחת 6 בארות. דגירה באינקובטור 5% CO2, 37 מעלות צלזיוס. הערה: במהלך 7 הימים הבאים, אל תזיז את הצלחת. תאי המיקרוגליה יכלו להיצמד לתחתית באר ההדבקה הנמוכה.</li>
	<li>ביום 56, יש להחליף במדיום C (טבלה 1) (2 מ"ל/באר של צלחת 6 בארות). תאי המיקרוגליה נצמדים לתחתית באר ההדבקה הנמוכה ונראים מסועפים מתחת למיקרוסקופ. הערה: על ידי החלפת Medium C כל 3 ימים (2 מ"ל / באר של צלחת 6 באר), מיקרוגליה יכול להיות מעובד בינוני C במשך כ 15 ימים.</li>
</ol>2. יצירת ROs אנושיים ותרבות משותפת של ROs עם מיקרוגליה
<ol><li>תרבית את תאי גזע עובריים עובריים בתווך תאי גזע עד שצפיפות התאים מגיעה ל-80%-90%. זרעו לפחות 1 x 106 תאים בכל באר.</li>
	<li>מוסיפים דיספז (1 מ"ל/באר מתוך 6 פלטות) לתא התרבית. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C למשך 5 דקות. שאפו את תמיסת הדיספאזה מהבאר.</li>
	<li>מוסיפים לבאר מדיום D (טבלה 1) (1 מ"ל/באר של 6 פלטות). חותכים את התא לחתיכות קטנות עם פיפטה 10 μL.</li>
	<li>לאסוף בעדינות את כל חלקי התא בינוני בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל.</li>
	<li>צנטריפוגה ב 200 x גרם במשך 5 דקות ולהסיר את supernatant.</li>
	<li>בעדינות להשעות מחדש את התאים ב 200 μL של מטריצה קרה. העבירו את צינור המיקרוצנטריפוגה 1.5 לתוך אינקובטור למשך 20 דקות. פעלו מהר מכיוון שהמטריצה תתמצק בטמפרטורת החדר (RT). לאחר 20 דקות באינקובטור, המטריצה תתמצק.</li>
	<li>מכינים צלחת בקוטר 10 ס"מ עם 15 מ"ל מדיום D. משעים מחדש את המטריצה עם Medium D ומנערים את צלחת הפטרי בעדינות.</li>
	<li>לאחר מכן, לשים את המנה באינקובטור במשך 5 ימים. אין להזיז את הצלחת. הגדר את היום כיום 0 (ROs). התאים ידבקו תוך 3 ימים.</li>
	<li>ביום 5 (ROs) וביום 10 (ROs), רענן את המדיום עם Medium D.</li>
	<li>ביום ה-12 (ROs), מוציאים את המדיום ומוסיפים 3 מ"ל דיספז לכל מנה למשך 5 דקות.</li>
	<li>שאפו את הדיספאזה והוסיפו 15 מ"ל של מדיום E (טבלה 1).</li>
	<li>קציר מיקרוגליה: ביום ה-56 (MGs), שאפו בעדינות את ה-Medium C, הוסיפו Accutase (1 מ"ל/באר של צלחת בעלת 6 בארות) ודגרו בטמפרטורה של 37°C למשך 3 דקות.</li>
	<li>לאסוף את תאי מיקרוגליה לתוך צינור צנטריפוגלי 15 מ"ל עם pipet 5 מ"ל. תאי צנטריפוגה ב 200 x גרם ב RT במשך 5 דקות.</li>
	<li>שאפו בעדינות את הסופרנאטנט והשהו את תאי המיקרוגליה עם 1 מ"ל של מדיום E. הוסיפו מיקרוגליה לתאי RO מעוכלים ביום ה-12. הערה: ביום ה-12 (ROs), התאים דביקים. ביום ה-13 (ROs), התאים נמצאים מרחפים במדיום E. אם המדיום משתנה בצהוב מהיום ה-12 (ROs) ליום ה-19 (ROs), רענן את המדיום עם Medium E.</li>
	<li>ביום ה-19 (ROs), צוברים את האורגנואידים למרכז המנה על ידי ערבול עדין של הצלחת. שאפו בעדינות את Medium E ורעננו את המדיום עם Medium F.</li>
	<li>מעבירים את האורגנואידים עם Medium F לצלחת תרחיף חדשה.</li>
	<li>שנה את המדיום פעם בשבוע ובחר אורגנואידים לניסויים.</li>
</ol>

אורגנואידים רשתית משולבי מיקרוגליה: מודל לחקר מחלות רשתית

<ol><li>Cowan, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+types+of+the+human+retina+and+its+organoids+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Cell types of the human retina and its organoids at single-cell resolution.</a> Cell. 182 (6), 1623-1640.e34 (2020).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Directed+induction+of+retinal+organoids+from+human+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Directed induction of retinal organoids from human pluripotent stem cells.</a> J Vis Exp. (170), e62298(2021).</li>
<li>Eiraku, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-organizing+optic-cup+morphogenesis+in+three-dimensional+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Self-organizing optic-cup morphogenesis in three-dimensional culture.</a> Nature. 472 (7341), 51-56 (2011).</li>
<li>Ginhoux, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fate+mapping+analysis+reveals+that+adult+microglia+derive+from+primitive+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages.</a> Science. 330 (6005), 841-845 (2010).</li>
<li>Kierdorf, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+emerge+from+erythromyeloid+precursors+via+pu.1-+and+irf8-dependent+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Microglia emerge from erythromyeloid precursors via pu.1- and irf8-dependent pathways.</a> Nat Neurosci. 16 (3), 273-280 (2013).</li>
<li>Schulz, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+lineage+of+myeloid+cells+independent+of+myb+and+hematopoietic+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A lineage of myeloid cells independent of myb and hematopoietic stem cells.</a> Science. 336 (6077), 86-90 (2012).</li>
<li>O'koren, E. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+function+is+distinct+in+different+anatomical+locations+during+retinal+homeostasis+and+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Microglial function is distinct in different anatomical locations during retinal homeostasis and degeneration.</a> Immunity. 50 (3), 723-737.e7 (2019).</li>
<li>Margeta, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Apolipoprotein+E4+impairs+the+response+of+neurodegenerative+retinal+microglia+and+prevents+neuronal+loss+in+glaucoma%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Apolipoprotein E4 impairs the response of neurodegenerative retinal microglia and prevents neuronal loss in glaucoma.</a> Immunity. 55 (9), 1627-1644.e7 (2022).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+innate+responses+in+microglia+derived+from+retinoblastoma+patient-specific+IPSCs%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Enhanced innate responses in microglia derived from retinoblastoma patient-specific IPSCs.</a> Glia. 72 (5), 872-884 (2024).</li>
<li>Gosselin, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+environment-dependent+transcriptional+network+specifies+human+microglia+identity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">An environment-dependent transcriptional network specifies human microglia identity.</a> Science. 356 (6344), eaal3222(2017).</li>
<li>Galatro, T. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+analysis+of+purified+human+cortical+microglia+reveals+age-associated+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic analysis of purified human cortical microglia reveals age-associated changes.</a> Nat Neurosci. 20 (8), 1162-1171 (2017).</li>
<li>Nakano, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-formation+of+optic+cups+and+storable+stratified+neural+retina+from+human+ESCs%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Stem+Cell%22%5BJournal%5D)">Self-formation of optic cups and storable stratified neural retina from human ESCs.</a> Cell Stem Cell. 10 (6), 771-785 (2012).</li>
<li>Kim, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((transcriptome+profiling%2C+and+functional+validation+of+cone-rich+human+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">transcriptome profiling, and functional validation of cone-rich human retinal organoids.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (22), 10824-10833 (2019).</li>
<li>Gao, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+microglia+derived+from+human+pluripotent+stem+cells+empower+retinal+organ%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+China+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Functional microglia derived from human pluripotent stem cells empower retinal organ.</a> Sci China Life Sci. 65 (6), 1057-1071 (2022).</li>
<li>Zhang, X., Jin, Z. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruct+human+retinoblastoma+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Reconstruct human retinoblastoma in vitro.</a> J Vis Exp. (188), e62629(2022).</li>
<li>Park, D. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IPS-cell-derived+microglia+promote+brain+organoid+maturation+via+cholesterol+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">IPS-cell-derived microglia promote brain organoid maturation via cholesterol transfer.</a> Nature. 623 (7986), 397-405 (2023).</li>
<li>Usui-Ouchi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrating+human+ipsc-derived+macrophage+progenitors+into+retinal+organoids+to+generate+a+mature+retinal+microglial+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Glia%22%5BJournal%5D)">Integrating human ipsc-derived macrophage progenitors into retinal organoids to generate a mature retinal microglial niche.</a> Glia. 71 (10), 2372-2382 (2023).</li>
<li>Chichagova, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+microglia-like+cells+in+human+induced+pluripotent+stem+cell-derived+retinal+organoids%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Incorporating microglia-like cells in human induced pluripotent stem cell-derived retinal organoids.</a> J Cell Mol Med. 27 (3), 435-445 (2023).</li>
</ol>

המחברים אינם מודעים לשום השתייכות, חברות, מענקים או החזקה כספית שעשויים להשפיע על האובייקטיביות של מחקר זה.

בשל הזמינות המוגבלת של הרשתית האנושית, ההבנה הנוכחית שלנו של תגובות דלקתיות ברשתית מגיעה כמעט ממודלים של בעלי חיים. כדי להתגבר על מגבלה זו, אורגנואידים ברשתית היו מובחנים. פיתוח מודלים של אורגנואידים ברשתית היה תחום מחקר פעיל, שמטרתו לשחזר את מורכבות הרשתית האנושית לצורך מידול מחלות ופיתוח טיפולי. מספר מחקרים דיווחו על ייצור מוצלח של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים 1,2,12,13. עם זאת, רוב המודלים הללו חסרים נוכחות של מיקרוגליה, אשר ידועים כממלאים תפקידים מכריעים בהתפתחות הרשתית ובפתוגנזה של מחלות. מחקרים אחרונים ניסו לשלב מיקרוגליה באורגנואידים ברשתית או במודלים של אורגנואידים במוח 16,17,18, אך השיטה המפורטת אינה ברורה. כאן, אנו מספקים פרוטוקול מפורט שלב אחר שלב לגידול משותף של תאי מיקרוגליה עם אורגנואידים ברשתית בשלב המוקדם, שניהם נגזרים מאותו קו תאי גזע עובריים. בעוד שמחקרים מסוימים בחנו את תפקידם של תאי מיקרוגליה במחלות רשתית באמצעות מודלים של בעלי חיים או מערכות תרבית תאים 7,8,9, מודל התרבית המשותפת המוצג כאן מציע מערכת מבוססת אדם רלוונטית יותר מבחינה פיזיולוגית לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-רשתית והשלכותיהן על פתוגנזה של מחלות.
השלבים הקריטיים הם מצב התא של תאי גזע אנושיים והתמיינות של מיקרוגליה ואורגנואידים ברשתית. יש להבדיל בין מיקרוגליה ל-ROs צעד אחר צעד, ולהשתמש בריאגנטים ובכלים נכונים (צלחת מטופלת בתרבית רקמות או צלחת תרחיף) בשלבים שונים. מודל זה יכול לעזור לנו להבין את התהליך שבו תאי מיקרוגליה תורמים להתרחשות של מחלות רשתית. יש לה השלכות משמעותיות על בדיקות סקר עתידיות של תרופות ועל חקירות של מנגנוני מחלה. עם זאת, לשיטות שאנו מפרסמים כעת עדיין יש כמה מגבלות. בשל תקופת ההתמיינות הממושכת של מיקרוגליה והיעדר שיטות הקפאה מתאימות, עלינו לתכנן את זמננו בתבונה עבור התמיינות מיקרוגליה ואורגנואידים ברשתית לתרבית משותפת.
בנוסף לאורגנואידים ברשתית, אנו מאמינים כי שילוב תאי מערכת החיסון במודלים אורגנואידים אחרים יכול גם לעודד התפתחות אורגנואידים. לכן, בדיקת מערכות אורגנואידים אחרות היא חיונית. השילוב של סוגי תאים ואורגנואידים שונים ליצירת איברים שלמים מהווה מודל מבטיח לעתיד.

כמקור המוגבל של הרשתית האנושית, התמיינות תאי גזע אנושיים לאורגנואידים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) ברשתית מייצגת מודל מבטיח במבחנה להדמיית הרשתית1. הוא מכיל סוגי תאים שונים ברשתית, כולל פוטורצפטורים, תאי גנגליון ברשתית, תאים דו-קוטביים, תאי מולר, תאים אופקיים ואסטרוציטים2. מודל זה מאפשר אמולציה ולימוד הן של מנגנוני התפתחות הרשתית והן של הפתוגנזה של מחלות רשתית. עם זאת, בשל שיטת ההתמיינות הכיוונית, אורגנואידים ברשתית נגזרו מהנוירואקטודרם3, חסרים סוגי תאים רבים אחרים שמקורם בשכבות נבט שונות, כגון מיקרוגליה משק החלמון ותאים פריווסקולריים מהמזודרם 4,5,6.
כיום, מחלות רשתית רבות, כגון רטיניטיס פיגמנטוזה7, גלאוקומה8 ורטינובלסטומה9, הוכחו כקשורות קשר הדוק למיקרוגליה בתוך הרשתית. עם זאת, בשל היעדר מודלים מחקריים מתאימים, מנגנונים ספציפיים הממחישים את הקשר בין מיקרוגליה למחלות אלה עדיין אינם ברורים. בעוד עכברים שימשו מודל חיובי לחקר מחלות רשתית, מחקרים אחרונים הדגישו הבדלים משמעותיים בין תאי מיקרוגליה בעכבר ובתאי מיקרוגליה אנושיים במונחים של תוחלת חיים, קצב התפשטות והיעדר גנים הומולוגיים אנושיים10,11. ממצאים אלה הצביעו על כך שמסקנות שהוסקו ממודלים של עכברים עשויות להיות לא אמינות לחלוטין, והדגישו את החשיבות של בניית אורגנואידים ברשתית אנושית המכילים מיקרוגליה.
במהלך העשורים האחרונים פותחו שיטות שונות להתמיינות תלת ממדית של אורגנואידים ברשתית12,13. כדי להקל על פעולת התרבית המשותפת של תאי מיקרוגליה בתוך אורגנואידים ברשתית, בחרנו שיטת בידול הכוללת מעבר מתרבית דבק לתרבית תרחיף. גישה זו מאפשרת לשלב תאי מיקרוגליה באורגנואידים ברשתית, ולשמור עליהם למשך 60 יום לפחות14.

<table><tbody><tr><td>Acctuase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07920</td><td></td></tr><tr><td>Advanced DMEM/F12</td><td>Thermo</td><td>12634-010</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CRX(M02)</td><td>abnova</td><td>H00001406-M02</td><td>נוגדן; דילול לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>Anti-IBA1</td><td>Abcam</td><td>ab5076</td><td>נוגדן; דילול לפי הוראות היצרן</td></tr><tr><td>B27</td><td>Life טכנולוגיות</td><td>17105-041</td><td></td></tr><tr><td>Dispase (1U/mL)</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07923</td><td></td></tr><tr><td>DMEM בסיסי</td><td>Gibco</td><td>10566-016</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>10565-042</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>C141905005BT</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Thermo</td><td>15575020</td><td></td></tr><tr><td>F12</td><td>Gibco</td><td>11765-054</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Biological Industry</td><td>04-002-1A</td><td></td></tr><tr><td>ג'לטין</td><td>סיגמא</td><td>G7041-100G</td><td>מוצק</td></tr><tr><td>גלוטמקס</td><td>Gibco</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>H9 קו</td><td></td><td></td>תאים <td>מכון המחקר WiCell</td></tr><tr><td>IL-3</td><td>RD Systems&nbsp;</td><td>203-IL-050</td><td></td></tr><tr><td>IL-34</td><td>PeproTech</td><td>200-34-50UG</td><td></td></tr><tr><td>KSR</td><td>Gibco</td><td>10828028</td><td></td></tr><tr><td>מטריקס</td><td>קורנינג</td><td>356231</td><td></td></tr><tr><td>M-CSF</td><td>RD SYSTEMS&NBSP;</td><td>216-MC-500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>MEM תמיסת חומצות אמינו לא חיוניות</td><td>Sigma</td><td>M7145</td><td></td></tr><tr><td>N2</td><td>Life Technologies</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>Gibco</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>עט/סטרפטוקוס</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>מדיום תאי גזע&nbsp;</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5990</td><td></td></tr><tr><td>טאורין</td><td>סיגמא</td><td>T-8691-25G</td><td></td></tr><tr><td>X-ViVO</td><td>LONZA</td><td>04-418Q</td><td></td></tr><tr><td>Y27632</td><td>Selleck</td><td>S1049</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoethanol</td><td>Life Technologies</td><td>21985-023</td><td></td></tr></tbody></table>

הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה

Assembling Retinal Organoids with Microglia

בשל הנגישות המוגבלת של הרשתית האנושית, אורגנואידים ברשתית (ROs) הם המודל הטוב ביותר לחקר מחלת רשתית אנושית, אשר יכול לחשוף את מנגנון התפתחות הרשתית ואת התרחשות מחלת הרשתית. מיקרוגליה (MG) הם מקרופאגים ייחודיים ברשתית ובמערכת העצבים המרכזית (CNS), המשרתים תפקודי חסינות חיוניים. עם זאת, אורגנואידים ברשתית חסרים מיקרוגליה מכיוון שמקור ההתמיינות שלהם הוא שק החלמון. הפתוגנזה הספציפית של תאי מיקרוגליה במחלות רשתית אלה נותרה לא ברורה; לכן, הקמת מודל אורגנואיד רשתית משולב מיקרוגליה מתברר כהכרחי. כאן, בנינו בהצלחה מודל בתרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה שמקורם בתאי גזע אנושיים. במאמר זה הבחנו בין תאי מיקרוגליה ולאחר מכן תרבית משותפת לאורגנואידים ברשתית בשלב המוקדם. כשילוב של תאים חיסוניים, מודל זה מספק פלטפורמה אופטימלית למידול מחלות רשתית וסינון תרופות כדי להקל על מחקר מעמיק על הפתוגנזה והטיפול במחלות הקשורות לרשתית ולמערכת העצבים המרכזית.

ההליך ליצירת אורגנואידים ברשתית מתואר במחקר הקודם שלנו15. כאן, אנו מראים את התוצאות המייצגות של מיקרוגליה ותאי מיקרוגליה ואורגנואידים ברשתית בתרבית משותפת.
כאן אנו מדגימים כל שלב של התמיינות מיקרוגליה (איור 1A). יום 0 מייצג את שלב תרבית תאי הגזע. לאחר מכן, תאי הגזע עוכלו וגודלו בתרבית לצורך היווצרות EB. בארבעת הימים הראשונים של התהליך, תאים יוצרים EBs (איור 1B). לאחר מכן, אנו מעבירים את ה- EBs התלויים לכלים דבקים של 10 ס"מ. לאחר כ-7 ימים, התאים דומים לאלה שמוצגים באיור 1C. ככל שהתרבית מתקדמת, תאים דבקים מפרישים אבות המטופויטיים לתוך הסופרנאטנט (איור 1D). תהליך זה אורך כ-45 יום. בשלב זה, ניתן לקצור תאים מן supernatant ולהעביר צלחות 6 בארות. במהלך 7 הימים הבאים, תאי מיקרוגליה יהיו בוגרים (איור 1E) ויהיו מוכנים לניסויים נוספים.
ביום ה-12 של התמיינות אורגנואידים ברשתית, תאים דבקים מתעכלים לתרבית תרחיף, ו-Medium E המכיל מיקרוגליה מתווסף לאורגנואידים ברשתית. מיקרוגליה תנדוד לאורגנואידים ברשתית. כדי לבחון את המורפולוגיה של תאי מיקרוגליה בבירור, הוספנו טרנספקציה של EGFP-lentivirus לתוך תאי גזע עובריים, מה שגרם לתאי המיקרוגליה המובחנים לבטא GFP להיות אוטופלואורסצנטיים (ירוק) (איור 2A-C). בחנו גם את מבנה הרקמה של אורגנואידים ברשתית שעברו תרבית משותפת עם מיקרוגליה באמצעות סמן תא קולט אור CRX וסמן תאי מיקרוגליאה IBA1 באמצעות בדיקת אימונופלואורסנציה באורגנואידים ברשתית בתרבית משותפת של מיקרוגליה לאחר התמיינות במשך 50 יום (איור 2D).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig01.jpg"> איור 1: דיאגרמה סכמטית וציר זמן של תאי מיקרוגליה הנגזרים מתאי גזע עובריים עובריים. (A) הפרוטוקול מתחיל בהפשרה והעברה של תאי גזע עובריים (תאי גזע עובריים) בלוח בעל 6 בארות. (B) EBs הומוגניים הנוצרים המכילים Medium A. (C) EBs מועברים לצלחת מצופה, ואבות hematopoietic נוצרים בימים 4-56. (ד,ה) ביום 56, הסופרנאטנט עם התאים נאסף (D) ומועבר לצלחת בעלת הדבקה נמוכה של 6 בארות כדי ליצור מיקרוגליה ביום 63 (E). סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67016/67016fig02.jpg"> איור 2: תמונות מייצגות לאורך ציר הזמן במהלך תרבית משותפת של מיקרוגליה ואורגנואידים ברשתית. (A) תמונות מייצגות של תאי מיקרוגליה שמקורם ב-EGFP-hESC. (B) תרבית משותפת של מיקרוגליה EGFP+ עם אורגנואידים ברשתית לאחר התמיינות במשך 18 יום. (C) תרבית משותפת של מיקרוגליה EGFP+ עם אורגנואידים ברשתית לאחר התמיינות במשך 30 יום. סרגל קנה מידה: 300 מיקרומטר. (D) CRX (סמן תא קולט אור; אדום) ו- IBA1 (סמן מיקרוגליה; ירוק) שימשו לזיהוי מבנה הרקמה של אורגנואידים ברשתית שגודלו בתרבית משותפת עם מיקרוגליה לאחר 50 יום של התמיינות. DAPI (כחול) מכתים את הגרעין. סרגל קנה מידה: 30 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/67016fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: הרכב המדיה ששימשה במחקר זה. הרכיבים הנדרשים להכנת נפח 500 מ"ל של כל מדיום מפורטים בטבלה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67016/Table%201-67016R1.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

תאי מיקרוגליה הם תאי חיסון ייחודיים השוכנים ברשתית, וממלאים תפקידים מכריעים במחלות ניווניות שונות ברשתית. יצירת מודל תרבית משותפת של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה יכולה להקל על הבנה טובה יותר של הפתוגנזה והתקדמות הפיתוח של מחלות רשתית.

Due to the limited accessibility of the human retina, retinal organoids (ROs) are the best model for studying human retinal disease, which could reveal ...

assembling-retinal-organoids-with-microglia

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

באמצעות שיטת התארגנות עצמית, אנו מפתחים פרוטוקול עם תוספת של COCO שיכול להגדיל באופן משמעותי את יצירת הפוטורצפטורים.

אינדוקציה מכוונת של אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

כאן אנו מתארים מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית ממוטבת, אשר מתאימה קווי תאי גזע פלוריפוטנטים אנושיים שונים כדי ליצור רקמות רשתית עם רבייה ויעילות גבוהה.

מערכת אינדוקציה אורגנויד רשתית להפקה של רקמות רשתית תלת-ממדיות מתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להבחנה של hiPSCs לצברי שדות עיניים ויצירת אורגנואידים נוירו-רשתית באמצעות תנאי תרבית פשוטים המערבים הן מערכות תרבית הדבקה והן מערכת תרבית תלייה. סוגים אחרים של תאי עין, כגון RPE ואפיתל הקרנית, יכולים גם הם להיות מבודדים משדות עיניים בוגרים בתרביות רשתית.

יצירת אורגנואידים ברשתית מתאי גזע פלוריפוטנטיים בריאים וספציפיים למחלות רשתית הנגרמים על ידי בני אדם

פרוטוקול זה מספק הליך הכנה אופטימלי ומשוכלל לדגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת. הוא מתאים ליישומים הכוללים ניתוח של סינפסות באורגנואידים רשתית בוגרים.

הכנת דגימות אורגנואידים ברשתית למיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת

אנו מציגים פרוטוקול ליצירת אורגנואיד מוח אנושי עם מיקרוגליה תושבת על ידי שילוב תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSC) בהתפתחות אורגנואידים.

גזירה של אורגנואיד מוח אנושי עם התפתחות מיקרוגליה

פרוטוקול זה משלב ניקוי אופטי ותיוג חיסוני להדמיה קונפוקלית בנפח מלא של אורגנואידים ברשתית שלמה. הוא משמר מבנה תלת מימדי, מאפשר הדמיה מפורטת של מסלולים עצביים מרכזיים, משפר את חקר הבשלת הרשתית, ארגון מרחבי ויישומיו הפוטנציאליים במודלים של מחלות ורפואה מותאמת אישית.

הדמיה אורגנואידית רשתית בהרכבה שלמה עם רזולוציה תאית

כאן, אנו מספקים מתודולוגיה מפורטת לבידוד הרשתית מעין העכבר לניסויים ממושכים ex vivo . פרוטוקול זה מדגיש את הנגשת הגישה התובענית מבחינה טכנית לחוקרים המעוניינים לנצל את דרכי המחקר הניתנות על ידי שמירה על גליה ברשתית באתרה ברקמה חיה.

מודל ex vivo explant לחקר אינטראקציות גליה ברשתית העכבר

מאמר זה מספק תיאור של איך לנתח ולתעד מן ההכנה רשתית מבודד העכבר. בפרט, אנו מתארים כיצד לרשום בתגובות אור אוכלוסייה שכותרתו fluorescently תא הגנגליון ובהמשך לזהות ולנתח את המורפולוגיה שלה.

הכנה רשתית מבודד להקליט תגובה האור תווית גנטית לתאי הגנגליון ברשתית

סרט זה מדגים שלושה סוגים של ניתוחים morphometric של הרשתית, אשר כוללים מדידת עובי השכבה הפנימית גרעינית, לכימות את מספר התאים הגנגליון ברשתית (RGCs) ומדידה של גדלים של RGCs. הטכניקה יכולה להציע פלטפורמה פשוטה אך מדעי ניתוחים morphometric.

ניתוח Morphometric סעיפים רשתית

מאמר זה וידאו מדגים את ההגדרה, את ההליכים לתיקון גופי תא וכיצד ליישם את הקלטות מהדק דינמיות מתאי הגנגליון בכל הר עכבר רשתיות. טכניקה זו מאפשרת החקירה של התרומה המדויקת של תשומות סינפטיים מעוררות ומעכבות, ואת העצמה היחסית והעיתוי שלהם לspiking העצבי.

יישום קלאמפ דינמי עם Conductances Synaptic ומלאכותי בתאי עכבר גנגליון רשתית

חקור מודל תרבית משותף של אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה לחקר מחלות ניווניות בעין. השיטה מאפשרת הבנה מעמיקה של תפקידי המיקרוגליה בפתולוגיה הרטינלית.

הרכבת אורגנואידים ברשתית עם מיקרוגליה

גלה סרטונים נוספים