מיניסקופ מקליט אותות סידן בהיפוקמפוס של עכברים המנווטים בפלומת ריח
20 בספטמבר 2024
פרוטוקול זה חוקר את הקשר בין המוח להתנהגות בהיפוקמפוס CA1 בעכברים המנווטים בפלומת ריח. אנו מספקים פרוטוקול שלב אחר שלב, כולל ניתוח לגישה להדמיה של ההיפוקמפוס, אימון התנהגותי, הקלטה ועיבוד של המוח במיניסקופ GCaMP6f, ונתונים התנהגותיים לפענוח מיקום העכבר מפעילות עצבית ROI.
מטרת המחקר שלי היא להבין כיצד המוח מעבד מידע מרחבי וחוש הריח. ואנחנו מנסים להבין את תפקידם של תאי העצב CA1 בהיפוקמפוס בניווט פלומת ריח. נכון לעכשיו, נעשה שימוש בטכנולוגיה של הקלטות חופשיות של נוירונים עם מיקרוסקופים זעירים לקידום המחקר בתחום.
מצאנו שאפשר לפענח את המסלול של העכבר המנווט את פלומת הריח על סמך תאי עצב ואותות סידן ב-CA1 הגב. טכניקה זו משלבת את היתרונות של טכנולוגיית מיני סקופ להקלטת אותות סידן GCaMP עם השורה המבוססת היטב של ניווט מרחבי בהיפוקמפוס CA1. כדי להבין טוב יותר כיצד מעגלים עצביים מניעים התנהגויות מורכבות, נחקור כיצד ניווט פלומת ריח נפגע במודל עכברי של מחלת אלצהיימר עם תפקוד לא תקין של היפוקמפוס CA1.
כדי להתחיל, בנה תא עם שני קירות אקריליים, ותקרה אקרילית, ורצפת פוליוויניל כלוריד מורחבת. שני הקירות הייחודיים האחרים מלפנים ומאחור חייבים להקל על זרימת האוויר. מקם ארבע קבוצות של מקורות ריח בשילוב עם פיות אספקת מים במרחק של 10 סנטימטרים זו מזו לאורך ציר ה-X.
התקינו מצלמה דיגיטלית מהירה מעל הזירה כדי לנטר את התנהגות בעלי החיים. השתמש בקוד פיתון מותאם אישית כדי לנהל את חומרת זירת הריח, והתוכנה משלבת את המצלמה ואת כל החומרה להגדרת הניסוי. הגדר את המצלמה הדיגיטלית לייצוא אות שעון בעת הקלטת מסגרות וידאו לסנכרון פוסט-הוק עם המיני סקופ.
מקם גלאי פוטוניזציה מיניאטורי עם תגובה מהירה, או PID, קרוב למקור הריח, ומקם גלאי פוטוניזציה זעיר אחר במרחק של 10 סנטימטרים. שנה את מתג הרווח בפאנל הקדמי של בקר ה-PID למצב X חמש. לאחר מכן החלף את מתג המשאבה בפאנל הקדמי של בקר ה-PID למצב גבוה.
בדוק את הדיודה פולטת האור או את נורית המצב LED בפאנל הקדמי של הבקר כדי לוודא שפלט החיישן מציג מתח אפס בהיעדר ריחות. העבר את הפוטנציומטר לקיזוז לאפס, את פלט המתח בהיעדר ריחות, והפעל את שסתום הריח בזירת הריח. מדוד את העיכוב בזיהוי פלומת הריח עם ה-PID בכל מיקום לאחר פתיחת השסתום.
כדי להתחיל, הגדר את החדר, המצלמה וגלאי הפוטוניזציה, או חיישני PID, לניסוי. לאימון העכבר, בקש ממנו לעבור לחלק האחורי של הזירה. לאחר שהעכבר מגיע לאחור, העבירו ידנית ריח ומים בנתיב אקראי, ותנו לעכבר לאתר את המקור ולשתות את המים.
לאחר שהעכבר לומד ליזום ניסויים, עבור לתוכנה אוטומטית להעברת ריחות. במשימת ניווט הריח הדו-נתיבי, בחר באופן אקראי אחת משתי יציאות ריח כדי לספק ריח. ותגמל את העכבר במים כשהוא מגיע לפיית המים הנכונה ראש תקן את העכבר והנח את המיני סקופ על גבי לוחית הבסיס באמצעות מיקרו מניפולטור.
הדק את בורג הסט כדי לאבטח את המיני סקופ. כוונן את עדשת ההרטבה החשמלית כדי למצוא את מישור המוקד האופטימלי, ולהבטיח את המספר הגדול ביותר של תאים עם עוצמת הקרינה הגבוהה ביותר. כדי להשיג טווח דינמי אופטימלי, השתמש ב-CA1 הגבי וקשר עכברי GCaMP 6-F אחד, והגדר את הספק המיני סקופ לסביבות 30% בקצב רכישה של 30 הרץ.
שחרר את העכבר בתוך זירת הריח כשהמיני סקופ מחובר ללוחית הבסיס. התחל רכישה עם לוח הממשק כדי להקליט את לוגיקת הטרנזיסטור-טרנזיסטור, או פלט TTL של המצלמה הדיגיטלית, ואת ההיקף המיני לסנכרון. התחל להקליט את המיני סקופ וסרטי התנהגות, והפעל את התוכנה האוטומטית למשימת ניווט הריח עם שתי פיות.
לאחר מכן סנכרן את המטא נתונים של זירת הריח, מסגרות מצלמה דיגיטליות מוקלטות ומסגרות מיני סקופ באמצעות קוד MATLAB synchronize_files_jove.m. באמצעות תיקון נורמה, בצע תיקון תנועה של מסגרות המיני סקופ המסונכרנות. זהה את אזורי העניין עם אותות אפס דלתא F על F המשתנים בזמן באמצעות תמצית.
השתמש באנסמבל התנהגות ובמצפה מסלול עצבי כדי לדמיין את ההתנהגות ואזורי העניין של כל ניסוי נפרד. תגובת ה-PID גדלה משמעותית עם שחרור פלומת הריח, מה שמעיד על עיתוי העברת הריח. מעברי סידן מרובים נצפו ב-CA1 הגבי של העכבר במהלך ניווט ריח, בקורלציה עם אירועי ריח ותגמול מים.
תגובות הסידן היו קשורות לשלבים שונים של משימת הניווט, כולל התחלת ניסוי, קבלת החלטות וחזרה. המסלול המרחבי של העכבר פוענח מאותות הסידן, וחשף את תפקידו של CA1 הגבי במיפוי ריח ומידע מרחבי.
סקירה
מחקר זה חוקר את הקשר בין המוח לבין ההתנהגות באזור ה-CA1 בהיפוקמפוס של עכברים בעת שהם נווטו בענן ריח. באמצעות שילוב של אימון התנהגותי והקלטות GCaMP6f באמצעות מיקרוסקופ, המחקר נועד לפענח כיצד נוירונים בהיפוקמפוס מעבדים מידע חוש הריח ומרחבי, במיוחד ביחס למחלת אלצהיימר.
מרכיבי מחקר מרכזיים
תחום המדע
- מדעי המוח
- מדעי המוח ההתנהגותיים
- טכניקות הדמיה
רקע
- הבנת האופן שבו מעגלים עצביים מאפשרים התנהגויות מורכבות.
- תפקידם של נוירונים ב-CA1 בהיפוקמפוס בניווט מרחבי ועיבוד חוש הריח.
- השפעת מחלת אלצהיימר על הפונקציונליות של ההיפוקמפוס.
- שימוש בטכנולוגיית מיקרוסקופ לצורך הקלטות עצביות in vivo.
מטרת המחקר
- לחקור כיצד נוירונים ב-CA1 בהיפוקמפוס תורמים להתנהגויות של ניווט בעקבות ריחות.
- לבחון כיצד התנהגויות אלו משתנות במודל עכברים של מחלת אלצהיימר.
- לנצל טכניקות הדמיה מתקדמות כדי לתאם פעילות עצבית עם התנהגות.
שיטות ששימשו
- הקלטות מיקרוסקופ של נוירונים ב-CA1 הגבי בזמן משימות ניווט בעקבות ריחות.
- מודל עכברים של מחלת אלצהיימר לצורך אימון התנהגותי ובדיקה.
- ההתקנה כללה תא שנועד לניווט בענן ריחות.
- תוכנה אוטומטית למסירת ריחות וניטור התנהגותי.
- סינכרון של וידאו והקלטות עצביות לניתוח נתונים.
תוצאות עיקריות
- פעילות עצבית שהתואמה עם אירועים התנהגותיים במהלך ניווט בעקבות ריחות.
- מעבר סידן שנצפה ב-CA1 הגבי היה קשור לשלבים שונים של משימת הניווט.
- היכולת לפענח את המסלול המרחבי של העכברים על סמך אותות הסידן ב-CA1.
- המחקר חשף תובנות חשובות על המנגנונים העצביים העומדים בבסיס עיבוד חוש הריח ועיבוד מרחבי.
מסקנות
- מחקר זה משפר את ההבנה של תפקודי ההיפוקמפוס בניווט ובעיבוד ריחות.
- התוצאות תורמות להבנה של פגיעה בתפקודים אלו במודלים של מחלת אלצהיימר.
- מדגיש את התועלת של טכנולוגיית המיקרוסקופ בחקירת תפקודים עצביים הקשורים להתנהגות מורכבת.
שאלות נפוצות
Executive Industry Relevance
Decoding hippocampal neural activity during complex odor-guided navigation provides a translational model for understanding spatial and sensory integration in neurodegenerative disease research. This workflow enables quantitative mapping of neural ensemble dynamics to behavioral outputs, supporting predictive confidence in target validation for CNS drug discovery. The approach strengthens early-stage portfolio decisions by linking circuit-level function to disease-relevant phenotypes.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of hippocampal circuit function in disease-relevant behavioral contexts.
- Supports mechanistic de-risking by correlating neural ensemble activity with navigation performance.
- Facilitates functional target validation for CNS pathways implicated in spatial and olfactory processing.
Screening & Assay Development
- Provides a validated behavioral and imaging platform for quantitative assessment of neural activity.
- Standardizes data acquisition and synchronization across behavioral and neural modalities.
- Enables reproducible measurement of calcium transients as quantitative assay outputs.
Translational & Preclinical Research
- Aligns neural activity patterns with disease-relevant behavioral phenotypes for translational biomarker development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation in neurodegeneration models.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on functional circuit readouts.
Pipeline & Workflow Integration
This miniscope-based workflow integrates from early discovery through preclinical model validation in CNS research pipelines.
- Discovery Biology: Quantifies neural circuit responses to behavioral challenges, supporting hypothesis testing and pathway clarification.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative calcium imaging outputs for assay development.
- Analytics: Provides synchronized behavioral and neural datasets for robust statistical comparison of experimental conditions.
- Translational Research: Links neural ensemble activity to disease-relevant navigation deficits, informing biomarker strategies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for evaluating neural circuit function across diverse CNS models.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in CNS target validation and mechanistic de-risking.
- Operational Value: Standardizes behavioral and imaging protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Informs go/no-go decisions by linking neural activity to functional outcomes.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of CNS targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in in vivo imaging, behavioral neuroscience, and data synchronization.
- Demands specialized instrumentation including miniscopes, GRIN lenses, and synchronized video acquisition systems.
- Necessitates cross-team standardization of behavioral protocols and data processing pipelines.
- Adaptation across disease models may require protocol optimization for specific neural circuits or behaviors.
- Motion correction and ROI identification steps are critical for reliable quantitative outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:11
Setting up the Odor Arena and Photoionization Detector Sensors for Mouse Odor Plume Navigation Studies
3:04
Behavioral Training and Epifluorescence Recording of a Freely Moving Mouse in the Odor Arena for Monitoring CA1 Neuronal Activity to Decode Spatial Navigation
