Name: אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T14:45:00.000+00:00
Duration: 5 min 27 s
Description: למדו אבלציה של תאים בלייזר בזחלי דרוזופילה שלמים לחקר תחרות סינפטית במעגלים עצביים. שיטה זו מאפשרת לחקור את המנגנונים המולקולריים המכוונים התפתחות עצבית.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ניסויים במיקרוסקופ בעל 2 פוטונים בוצעו בליבת דימות התא המתקדמת של מכון המוח FAU סטיילס-ניקולסון. ברצוננו להודות ליוזמת יופיטר למדעי החיים על התמיכה הכספית.

כל בעלי החיים ששימשו לפרוטוקול היו מהמין Drosophila melanogaster. אין בעיות אתיות סביב השימוש במין זה. לא היה צורך באישור אתי כדי לבצע עבודה זו. הפרטים של מיני הדרוזופילה , ריאגנטים וציוד ששימשו במחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. גידול דרוזופילה ובחירת שלב הזחל הנכון
<ol><li>בחר קו דרייבר Gal4 המניע ביטוי בתאים שיש לאבלט ושלב אותו מחדש עם או חצה אותו לקו כתב UAS-GFP. לגדל זבובים על מזון זבובים סטנדרטי ב 25 ° C. הערה: עבור אבלציה של סיבים ענקיים (GF), R91H05-Gal4 או A307-Gal4 שולבו מחדש עם UAS-GFP. ShakB(קטלני)-GAL4 בשילוב עם UAS-GFP שימש לאבלציות TTMn (ראה טבלת חומרים).</li>
	<li>זחלים נבחרים שהחלו לצאת מהמזון ולזחול במעלה הצד של בקבוקון המזון. זחלים אלה נמצאים בשלב הנדוד, שהוא השלב המועדף לביצוע אבלציה של תאי GF. הערה: אבלציה יכולה להתבצע בכל שלב הזחל. שלב הזחל האחרון היה חשוב למניפולציה של התפתחות ה-GFS מכיוון שניתן לזהות בקלות את גופי תאי ה-GF במוח, אך אקסוני ה-GF לא יצרו קשרים עם מטרותיהם בשלב זה.</li>
</ol>2. הכנת זחלהכוכבהשלישי
הערה: הזחלים הורדמו בשיטה דומה לזו של בורה ואחרים. כדי לשמור על זמני הליך קצרים, הכינו רק זחל אחד בכל פעם. חשיפה קצרה להרדמה תשפר את הישרדותם של חיות ניסוי10.
<ol><li>הכינו צלחת זכוכית עם מכסה הדוק. מניחים כדור צמר גפן בצלחת, ומתחת למכסה אדים, מוסיפים כ 3-5 מ"ל של אתיל אתר (מסוכן, נוזל דליק, מעיל מעבדה, כפפות, משקפי מגן). מכסים את המנה במכסה.</li>
	<li>אספו זחליאינסטאר בודדים מבקבוקוני זבובים. בשלב הזחלהשלישי , הזחלים עוזבים את מדיום המזון וזוחלים למעלה לאורך הצד של בקבוקון המזון11.<ol><li>ודאו שהזחלים עדיין נעים ולא התחילו בהיווצרות בובות. זחלים שהם נייחים ומראים קיצור של הגוף מתחילים בגור ואינם מתאימים לאבלציה. הרימו את הזחלים בעזרת מברשת צבע קטנה. הערה: שלב הזחלהשלישי מתחיל לאחר ההתכה השנייה ב 72 שעות של התפתחות (לאחר הטלת ביצים), ונמשך עד היווצרות puparium ב 120 שעות עבור זבובים גדל ב 25 ° C.</li>
	</ol></li>
	<li>מעבירים זחל אחד למיכל קטן ופתוח. מניחים את המיכל בצלחת הזכוכית עם אתר אתיל וסוגרים את המנה בחוזקה. בעת פתיחת צלחת הזכוכית, הניחו אותה מתחת לשנורקל או במכסה אדים כדי למנוע מהאדים לברוח.<ol><li>במרווחים של 30 שניות, הסירו את המכסה עם הזחל מהצלחת ובדקו את ניידות הזחל תחת מיקרוסקופ דיסקציה. הזחל בדרך כלל יהיה משותק בתוך דקה אחת. ברגע שהווים בפה מפסיקים להתעוות, הזחל מוכן להרכבה. יש להשליך את כל הזחלים שאינם משותקים לחלוטין לאחר 3 דקות. הערה: החלק העליון של מכסה הפוך של צינור מיקרוצנטריפוגה (מכסה שהוסר מהצינור) יכול לשמש כמיכל.</li>
	</ol></li>
</ol>3. הרכבת זחלים על שקופיות לאבלציה
<ol><li>הניחו את הזחל המורדם על מגלשת מיקרוסקופ זכוכית. לטבול את הזחל בטיפת מלח חרקים; זה ישטוף חלק משאריות המזון שעלולות להידבק לזחל.</li>
	<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, להסיר את רוב מלוחים עם רקמת נייר. מקם את הצד הגבי של הזחל כלפי מעלה עבור אבלציה GF או את הצד הגחוני כלפי מעלה עבור אבלציה TTMn. הורידו לאט לאט כיסוי זכוכית על הזחל. הוסיפו מי מלח לצד הכיסוי כדי למלא את החלל שבין מגלשת הזכוכית לחלקת הכיסוי.</li>
	<li>עבור אבלציה GF, בדוק את מיקום המוח תחת הגדלה גבוהה במיקרוסקופ דיסקציה. ודא כי המוח שוכב בגובה והוא גלוי דרך הקוטיקולה. לעתים קרובות, המוח יהיה מכוסה ברקמת שומן, מה שהופך הדמיה ואבלציה התא בלתי אפשרי.<ol><li>כדי לעקור כל רקמת שומן המכסה את המוח, הפעילו לחץ קל על הכיסוי עם מלקחיים והזיזו את הכיסוי מצד לצד. אם לא ניתן להזיז את רקמת השומן מהמוח בדרך זו, השתמשו בזחל אחר במקום.</li>
	</ol></li>
</ol>4. איתור תאי היעד
הערה: המערכת מרובת הפוטונים ששימשה למחקר זה הורכבה על מיקרוסקופ זקוף. תוכנה ספציפית למערכת שימשה לשליטה בהגדרות רכישה וגירוי לייזר. המערכת צוידה במקור אור אפיפלואורסצנטי לאיתור הדגימות. עדשת המטרה הייתה עדשת טבילה במים עם הגדלה של פי 25, מרחק עבודה ארוך של 2 מ"מ ו-NA של 1.10.
<ol><li>הניחו את הדגימה על במת המיקרוסקופ הרב-פוטוני והשתמשו במסנן GFP כדי לאתר את הדגימה במצב אפיפלואורסצנטי. עבור אבלציה של GF, ניתן לזהות את גופי התא במוח, כפי שניתן לראות באיור 1A,C,D. עבור אבלציה של TTMn, ניתן לזהות צביר של ארבעה תאים מהצד הגחוני בחוט העצב הגחוני (VNC), כפי שמוצג באיור 1A,B. בסיום המיקוד, מרכזו את התאים בשדה הראייה ועברו למצב של 2 פוטונים.</li>
</ol>5. הגדרת פרמטרי אבלציה
<ol><li>התאם את הגדרות הלייזר ואת רווח הגלאי כדי להציג את התאים המבטאים GFP באמצעות סורק Galvano. אורך גל של 870 ננומטר פועל בצורה הטובה ביותר להמחשת אות GFP. מרכז את התא בשדה הראייה.</li>
	<li>השתמש באזור עניין מעגלי (ROI) כדי להגדיר את האזור עבור אבלציה. ודא שהחזר ההשקעה מכסה את רוב פני השטח של התא (איור 1E,G).</li>
	<li>הגדר את פרוטוקול האבלציה בתוכנה. הגדר מסגרת רכישה אחת, לאחר מכן גירוי, ואחריה מסגרת רכישה נוספת.</li>
	<li>הפעל את הגדרת עוצמת לייזר הגירוי בערך נמוך יותר (10%-20%) והפעל את פרוטוקול הגירוי. אבלציה מוצלחת יכולה להיות מזוהה על-ידי עיגול ברור במרכז הסומה של התא במיקום החזר ההשקעה, ועלייה בפלואורסצנטיות סביב החזר ההשקעה (איור 1F).<ol><li>אם האבלציה לא הצליחה ורק הלבינה את התא (איור 1H), הגדילו את עוצמת הלייזר בהפרשים קבועים של 5% או את מספר הלולאות אחת בכל פעם והריצו את הפרוטוקול שוב. עוצמת הלייזר המופעלת הייתה בין 10% ל -40% עבור המערכת המשמשת בפרוטוקול. הערה: הגדרות עוצמת הלייזר עבור אבלציה תלויות מאוד בעומק התאים הממוקמים ברקמה ובגורמים אחרים כגון קיפול ציפורניים. אם התאים בהירים ונראים בבירור, עוצמת הלייזר תהיה בקצה התחתון של הטווח. עוצמת הלייזר תהיה שונה עבור כל מערכת בהתאם לדגם הלייזר ולגיל הלייזר.</li>
	</ol></li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67053/67053fig01.jpg"> איור 1: זיהוי תאי עצב לאבלציה בלייזר בזחלי דרוזופילה L3 שלמים. (A) סכמה של המיקום של סיב ענק (GF) סומא במוח וצביר של נוירונים מוטוריים המכילים את הנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי (TTMn) בחוט העצב הגחוני (VNC). (B) הקרנה בעוצמה מרבית של ביטוי מניע shakB(קטלני)-Gal4 של GFP בזחל VNC. קו האמצע מסומן על ידי הקו המקווקו. העיגול מציין את צביר תאי העצב המכילים את TTMn המיועדים לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (C) מבט הקרנה חלקי של מוח הזחל המבטא GFP תחת הבקרה של A307-Gal4. העיגול מציין את סומא GF המיועד לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (D) הקרנה בעוצמה מרבית של המוח עם R91H05-Gal4 המניע UAS-GFP. שני ה-GFs (מעגלים) ניתנים לזיהוי לפי מיקום, צורה וגודל. סרגל קנה מידה: 50 מיקרומטר. (E) GF סומא תצוגה מוגדלת לפני אבלציה בלייזר. מעגל המג'נטה מציין את אזור המטרה לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (F) GF סומא תצוגה מוגדלת לאחר מסירת כוח לייזר מקומי ואבלציה מוצלחת. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (G) GF סומא תצוגה מוגדלת לפני אבלציה בלייזר. מעגל המג'נטה מציין את אזור המטרה לאבלציה בלייזר. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. (H) GF סומא תצוגה מוגדלת לאחר מסירה של כוח לייזר מקומי ואבלציה (הלבנה) לא מוצלחת. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67053/67053fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
6. שחזור הזחלים
<ol><li>לאחר הצתת התא בהצלחה, הסירו את הכיסוי והרימו בעדינות את הזחלים מהמגלשה בעזרת מברשת. מניחים את הזחלים בבקבוקון מזון. הזחלים יתחילו לזחול שוב תוך 30 דקות. הערה: שמירה על זמן הליך קצר משפרת את שיעורי ההישרדות של בעלי חיים. עם ניסיון, ניתן לבצע את הניסוי תוך קצת פחות מ-10 דקות.</li>
	<li>המשיכו לגדל זחלים בתנאים סטנדרטיים עד שהם נסגרים ממעטפת הגולם.</li>
</ol>7. בדיקת הפונקציונליות של GFS בזבובים בוגרים
הערה: השלבים הבאים מוסברים בפירוט ב- Allan and Godenschwege12, and Augustin et al.13.
<ol><li>בדיקת זבובים בוגרים בגיל 2-5 ימים לאחר האקלוסיה. מרדימים זבובים עםCO2 ומרכיבים אותם על שעווה דנטלית על ידי דחיפת הרגליים לתוך השעווה. פרשו את הכנפיים בזווית של 90 מעלות וקיבעו אותן במקומן בעזרת השעווה. אבטחו את הראש על ידי דחיפת החוטם לתוך השעווה.</li>
	<li>הניחו חוטי גירוי בשתי העיניים, חוט הארקה לתוך הבטן, ואלקטרודות הקלטה מזכוכית לתוך שרירי הקפיצה (TTM) בכל צד.</li>
	<li>לעורר את מעגל GF עם גירויים בודדים כדי למדוד את חביון התגובה עבור שני השרירים. לעורר את המעגל עם 100 הרץ ו 200 הרץ רכבות של גירויים, בהתאמה, כדי למדוד את התדר הבא עבור שני השרירים.</li>
</ol>8. דיסקציה ותיוג של מערכת הסיבים הענקית להדמיה קונפוקלית
הערה: דיסקציה CNS זבוב והזרקת צבע מפורטים ב Boerner ו Godenschwege14.
<ol><li>הסירו בעדינות את הזבוב משעוות השיניים בעזרת מלקחיים והעבירו אותו לצלחת פטרי מרופדת באלסטומרים מסיליקון תחת טווח דיסקציה.</li>
	<li>הסירו את הרגליים, הכנפיים והחוטם בעזרת מספריים והשתמשו בסיכות חרקים כדי לאבטח את הצד הגבי של הזבוב כלפי מעלה בציפוי האלסטומר.</li>
	<li>בצע חתך רוחבי לאורך קו האמצע מהבטן האמצעית, דרך בית החזה כולו, ובמעלה הצוואר, המחבר את בית החזה לראש. פתח את הזבוב עם סיכות חרקים. הסר איברים ובלוטות מן הזבוב מבלי לפגוע במערכת העצבים. הערה: בשלב זה, ניתן להזריק לאקסונים של GF צבעים כדי לסמן את ה-GFs ואת תאי העצב המצמדים חשמלית13.</li>
	<li>הסר את קפסולת הראש מהראש כדי לחשוף את המוח.</li>
</ol>9. אימונוהיסטוכימיה של מערכת העצבים
<ol><li>לאחר דיסקציה CNS, לתקן את הזבוב ב 4% PFA ב PBS במשך 45 דקות בטמפרטורת החדר (RT). שטפו במשך 20 דקות ב-PBS ב-RT (3 פעמים).</li>
	<li>חסום את הדגימה למשך שעה אחת ב- RT ב- 3% BSA ב- PBS עם תמיסת חומרי ניקוי של 0.5%.</li>
	<li>יש לדגור במשך 2-3 לילות בטמפרטורה של 4°C ב-3% BSA ב-PBS עם 0.3% תמיסת דטרגנט וארנבת נגד GFP (1:500). שטפו במשך 20 דקות ב-PBS ב-RT (6 פעמים).</li>
	<li>לדגור לילה ב 4 °C ב PBS עם אנטי ארנב Alexa 488. שטפו במשך 20 דקות ב-PBS ב-RT (6 פעמים).</li>
	<li>יש לייבש דגימות עם סדרת אתנול עולה (50%, 70%, 90%, 100% אתנול) למשך 10 דקות בכל שלב. הסירו את הפינים וחתכו את שרירי הבטן והטיסה. העבירו את שאר בית החזה המכיל את מערכת העצבים למגלשה וכסו אותו באמצעי הרכבה כמו מתיל סליצילאט. הניחו מכסה על הדגימה ואטמו אותה בלק.</li>
	<li>דמיינו את מערכת העצבים במיקרוסקופ קונפוקלי כדי לנתח את האנטומיה של מסוף GF.</li>
</ol>

אבלציה של נוירון יחיד בדרוזופילה לחקר הסתגלות מערכת העצבים

<ol><li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A+Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Bower, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Airway+branching+has+conserved+needs+for+local+parasympathetic+innervation+but+not+neurotransmission%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biol%22%5BJournal%5D)">Airway branching has conserved needs for local parasympathetic innervation but not neurotransmission.</a> BMC Biol. 12, 92(2014).</li>
<li>Angelo, J. R., Tremblay, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser-mediated+cell+ablation+during+post-implantation+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Laser-mediated cell ablation during post-implantation mouse development.</a> Dev Dyn. 242 (10), 1202-1209 (2013).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A., Tanouye, M. A., Phelan, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Making+an+escape%3A+Development+and+function+of+the+Drosophila+giant+fibre+system%5BTitle%5D)+AND+%22Semin+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Making an escape: Development and function of the Drosophila giant fibre system.</a> Semin Cell Dev Biol. 17 (1), 31-41 (2006).</li>
<li>Hubel, D. H., Wiesel, T. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Binocular+interaction+in+striate+cortex+of+kittens+reared+with+artificial+squint%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Binocular interaction in striate cortex of kittens reared with artificial squint.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1041-1059 (1965).</li>
<li>Wiesel, T. N., Hubel, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+effects+of+unilateral+and+bilateral+eye+closure+on+cortical+unit+responses+in+kittens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurophysiol%22%5BJournal%5D)">Comparison of the effects of unilateral and bilateral eye closure on cortical unit responses in kittens.</a> J Neurophysiol. 28 (6), 1029-1040 (1965).</li>
<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li>
<li>Allen, M. J., Drummond, J. A., Moffat, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+the+giant+fiber+neuron+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Development of the giant fiber neuron of Drosophila melanogaster.</a> J Comp Neurol. 397 (4), 519-531 (1998).</li>
<li>Burra, S., Wang, Y., Brock, A. R., Galko, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+Drosophila+larvae+to+study+epidermal+wound+closure+and+inflammation%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Using Drosophila larvae to study epidermal wound closure and inflammation.</a> Methods Mol Biol. 1037, 449-461 (2013).</li>
<li>Kakanj, P., Eming, S. A., Partridge, L., Leptin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-term+in+vivo+imaging+of+Drosophila+larvae%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Long-term in vivo imaging of Drosophila larvae.</a> Nat Protoc. 15 (3), 1158-1187 (2020).</li>
<li>Bainbridge, S. P., Bownes, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Staging+the+metamorphosis+of+Drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Embryol+Exp+Morphol%22%5BJournal%5D)">Staging the metamorphosis of Drosophila melanogaster.</a> J Embryol Exp Morphol. 66, 57-80 (1981).</li>
<li>Allen, M. J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+Drosophila+giant+fiber+system+%28GFs%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the Drosophila giant fiber system (GFs).</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010 (7), 5453(2010).</li>
<li>Augustin, H., Allen, M. J., Partridge, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophysiological+recordings+from+the+giant+fiber+pathway+of+d.+Melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Electrophysiological recordings from the giant fiber pathway of d. Melanogaster.</a> J Vis Exp. (47), e2412(2011).</li>
<li>Boerner, J., Godenschwege, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Whole+mount+preparation+of+the+adult+Drosophila+ventral+nerve+cord+for+giant+fiber+dye+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Whole mount preparation of the adult Drosophila ventral nerve cord for giant fiber dye injection.</a> J Vis Exp. (52), e3080(2011).</li>
<li>Blagburn, J. M., Alexopoulos, H., Davies, J. A., Bacon, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Null+mutation+in+shaking-b+eliminates+electrical%2C+but+not+chemical%2C+synapses+in+the+Drosophila+giant+fiber+system%3A+A+structural+study%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Null mutation in shaking-b eliminates electrical, but not chemical, synapses in the Drosophila giant fiber system: A structural study.</a> J Comp Neurol. 404 (4), 449-458 (1999).</li>
<li>Kennedy, T., Broadie, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Newly+identified+electrically+coupled+neurons+support+development+of+the+Drosophila+giant+fiber+model+circuit%5BTitle%5D)+AND+%22eNeuro%22%5BJournal%5D)">Newly identified electrically coupled neurons support development of the Drosophila giant fiber model circuit.</a> eNeuro. 5 (6), 0346(2018).</li>
<li>Mcfarland, B. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Axon+arrival+times+and+physical+occupancy+establish+visual+projection+neuron+integration+on+developing+dendrites+in+the+Drosophila+optic+glomeruli%5BTitle%5D)+AND+%22bioRxiv%22%5BJournal%5D)">Axon arrival times and physical occupancy establish visual projection neuron integration on developing dendrites in the Drosophila optic glomeruli.</a> bioRxiv. , (2024).</li>
</ol>

למחברים אין מה לחשוף.

אבלציה של תאים במיקרוסקופ של 2 פוטונים הוכחה כשיטה מוצלחת ביותר למניפולציה של התפתחות מעגלים עצביים בדרוזופילה. מכיוון ששיטה זו אינה פולשנית, היא גורמת נזק מינימלי לחיה. הנתונים תומכים בתועלת של מניפולציה ספציפית לתא זה של מעגלים ידועים.
קריטי להצלחת האבלציה היה בחירת הנהג המתאים ביותר של Gal4. מכיוון שה- GFS נחקר היטב, קווי נהג ספציפיים רבים של Gal4 תוארו7. רוב הדרייברים של Gal4 מוגבלים מאוד, אך עדיין באים לידי ביטוי בתאי עצב רבים אחרים. אתגר אחד היה לזהות באו...

אבלציה בלייזר היא כלי מועדף לניתוח מעגלים עצביים במגוון רחב של אורגניזמים. הוא פותח במערכות גנטיות כמו תולעים וזבובים, והוא יושם ברחבי ממלכת החי כדי לחקור את המבנה, התפקוד וההתפתחות של מערכת העצבים 1,2,3. כאן, אבלציה של נוירון יחיד שימשה כדי לחקור כיצד נוירונים מתקשרים במהלך הרכבת מעגלים בדרוזופילה. מערכת המילוט של הזבוב היא מעגל מועדף לניתוח מכיוון שהיא מכילה את הנוירונים הגדולים ביותר ואת הסינפסות הגדולות ביותר בזבוב הבוגר, והמעגל אופיין היטב בעשורים האחרונים4. התפקיד שממלאות אינטראקציות נוירון-נוירון בהרכבת מעגל הסיבים הענק הוא מוקד המחקר הזה.
סוג אחד של אינטראקציה שהיה מוקד במדעי המוח מאז עבודתם של הובל וויזל בשנות השישים הוא "תחרות סינפטית"5,6. בפרוטוקול זה, אבלציה בלייזר שימשה כדי לבחון מחדש את תפקידה של התחרות באמצעות אבלציה חד-תאית במערכת הסיבים הענקית (GFS) של דרוזופילה, שם ניתן לגלות את היסודות המולקולריים של התופעות.
אבלציה של תאי עצב בזבוב המתפתח הייתה קשה ממגוון סיבות, כולל הדמיה של נוירוני המטרה, דיוק שיטת האבלציה והישרדות הדגימה. כדי להתגבר על בעיות אלה ב-GFS, מערכת UAS/Gal47 שימשה לסימון תאי עצב בעלי עניין, ומיקרוסקופ בעל שני פוטונים שימש להסרת הסיב הענק הפרה-סינפטי או נוירון מנוע הקפיצה הפוסט-סינפטי (TTMn).
במחקר זה, כדי לקבוע את התפקיד שתאי עצב דו-צדדיים שכנים ממלאים בהתאמת קישוריות סינפטית וחוזק סינפטי ב-GFS, אחד מזוגות תאי העצב הדו-צדדיים (GF קדם-סינפטי או נוירון מוטורי פוסט-סינפטי) נמחק ממש לפני התפתחות הגולם. בשלב התפתחותי זה, אקסונוגנזה GF לא הושלמה8. לאחר מכן נבדקו מבנה ה-GF ותפקודו של המעגל הסינפטי אצל הבוגר, תוך מתן תשומת לב מיוחדת לתפוקה של ה-GF הנותר.

<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jaxkson ImmunoResearch</td><td>111-545-003</td><td></td></tr><tr><td>חלבון פלואורסצנטי אנטי ירוק, ארנב</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>A11122</td><td>1:500 ריכוז</td></tr><tr><td>Apo LWD 25x/1.10W Objective</td><td>Nikon</td><td>MRD77220</td><td>טבילה במים למרחק עבודה ארוך</td></tr><tr><td>סרום בקר אלבומין (BSA)</td><td>Sigma</td><td>B4287-25G</td><td></td></tr><tr><td>זיקית Ti: Sapphire Vision II לייזר</td><td>קוהרנטי</td><td></td><td></td></tr><tr><td>כדור כותנה</td><td>Genesee Scientific</td><td>51-101</td><td></td></tr><tr><td>Dextra, Tetramethylrhodamine, 10,000 MW, ליזין ניתן לתיקון (fluoro-Ruby)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>D1817</td><td></td></tr><tr><td>מתכון מלח</td><td></td><td></td> Drosophila <td>מ- Gu and O'Dowd, 2006</td></tr><tr><td>Ethyl Ether</td><td>Fisher Scientific</td><td>E134-1</td><td>סכנה, נוזל דליק</td></tr><tr><td>מזון זבובים B (מתכון בלומינגטון)</td><td>LabExpress</td><td>7001-NV</td><td></td></tr><tr><td>מתיל סליצילאט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>O3695-500</td><td></td></tr><tr><td>צינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מ"ל</td><td>אפנדורף</td><td>22363204</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ החלקה 18x18 #1.5</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-541A</td><td></td></tr><tr>וקטור<td>מעקב נוירוביוטין</td><td> מעבדות</td><td>SP-1120</td><td></td></tr><tr><td>ניקון A1R מיקרוסקופ רב-פוטוני</td><td>ניקון</td><td></td><td>על מעמד מיקרוסופ FN1 זקוף</td></tr><tr><td>NIS Elements מחקר מתקדם</td><td>של Nikon</td><td></td><td>תוכנת רכישה וניתוח נתונים</td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>T353-500</td><td></td></tr><tr><td>PBS (Phosphate Buffered Salin)</td> <td>Fisher BioReagents</td><td>BP2944-100</td><td>טבליות</td></tr><tr><td>R91H05-Gal4</td><td>בלומינגטון מרכז מניות דרוזופילה</td><td>40594</td><td></td></tr><tr><td>shakB (קטלני)-GAl4</td><td>מרכז המניות בלומינגטון דרוזופילה</td><td>51633</td><td></td></tr><tr><td>שקופית זכוכית מיקרוסקופ סופרפרוסט</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-143</td><td></td></tr><tr><td>טריטון X-100</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>422355000</td><td>תמיסת דטרגנט</td></tr><tr><td>UAS-10xGFP</td><td>בלומינגטון מרכז המניות דרוזופילה</td><td>32185</td><td></td></tr></tbody></table>

אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית

Laser Cell Ablation in Intact Drosophila Larvae Reveals Synaptic Competition

הפרוטוקול מתאר אבלציה של נוירון יחיד עם מערכת לייזר של 2 פוטונים במערכת העצבים המרכזית (CNS) של זחלי Drosophila melanogaster שלמים. באמצעות שיטה לא פולשנית זו, ניתן לתפעל את מערכת העצבים המתפתחת באופן ספציפי לתא. שיבוש ההתפתחות של נוירונים בודדים ברשת יכול לשמש כדי לחקור כיצד מערכת העצבים יכולה לפצות על אובדן קלט סינפטי. תאי עצב בודדים הופעלו באופן ספציפי במערכת הסיבים הענקית של דרוזופילה, תוך התמקדות בשני נוירונים: סיב הענק הפרה-סינפטי (GF) והנוירון המוטורי הטרגוטרוצנטרלי הפוסט-סינפטי (TTMn). סינפסות ה-GF עם ה-TTMn האיפסילטרלי, שהוא חיוני לתגובת הבריחה. אבלציה של אחד ה-GFs במוח הכוכבהשלישי , מיד לאחר שה-GF מתחיל בצמיחה אקסונלית, מסירה לצמיתות את התא במהלך התפתחות מערכת העצבים המרכזית. ה-GF הנותר מגיב לשכן הנעדר ויוצר מסוף סינפטי חוץ רחמי ל-TTMn הנגדי. מסוף לא טיפוסי זה, סימטרי דו-צדדי, מעצבב את שני ה-TTMns, כפי שמודגם על-ידי צימוד צבעים, ומניע את שני תאי העצב המוטוריים, כפי שמודגם בבדיקות אלקטרופיזיולוגיות. לסיכום, אבלציה של נוירון יחיד מדגימה תחרות סינפטית בין זוג נוירונים דו-צדדיים שיכולים לפצות על אובדן של נוירון אחד ולהחזיר תגובות נורמליות למעגל המילוט.

שיטה זו יכולה לשמש כדי לתפעל את הפיתוח של רשתות עצביות ספציפיות במערכת העצבים של Drosophila. שאלת המחקר העיקרית כאן הייתה היווצרות קשרים סינפטיים. הסרת ה-GF הפרה-סינפטי או ה-TTMn הבתר-סינפטי אפשרה לחקור סינפטוגנזה תגובתית בסינפסה מרכזית זו ובמנגנונים המולקולריים החיוניים לתפקוד ולהתפתחות הסינפטיים. כמתואר בפרוטוקול, בוצעה אבלציה של תאי לייזר של אחד ה-GFs או של אחד ה-TTMns, ונותחו ההשפעות על הסינפסה לאחר התפתחות הגלמים בזבוב הבוגר.
כדי להבטיח שלהליך לא תהיה השפעה שלילית על הישרדות בעלי...

פרוטוקול זה מדגים אבלציה של תאי לייזר של נוירונים בודדים בזחלי דרוזופילה שלמים. השיטה מאפשרת לחקור את ההשפעה של הפחתת התחרות בין תאי עצב במערכת העצבים המתפתחת.

The protocol describes single-neuron ablation with a 2-photon laser system in the central nervous system (CNS) of intact Drosophila melanogaster larvae. ...

laser-cell-ablation-intact-drosophila-larvae-reveals-synaptic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

במאמר וידאו זה אנו מציגים שיטה לבידוד יחידים או...

לייזר Microdissection לכידה של תסיסנית נוירונים היקפיים

פרוטוקול זה מתאר שיטה אמינה הרדמה והדמיה של...

בתחום ההדמיה vivo של הזחלים תסיסנית אינטקט ברזולוציה משנה הסלולר

סרטון זה מתאר אבלציה של אקסונים בלייזר דו-פוטוני בזחל Drosophila melanogaster ופרוטוקול לדוגמה לגרימת פציעה ותמונה של אתר הפגיעה.

פגיעה עצבית הנגרמת על ידי לייזר בשני פוטונים: שיטה לצפייה בניוון והתחדשות אקסונים בזחלי דרוזופילה

סרטון זה מדגים שיטה לגרימת פגיעה עצבית ממוקדת בזחלי Drosophila באמצעות לייזר בעל עוצמה גבוהה. לאחר מיקום הזחל מתחת למיקרוסקופ, לייזר בעל הספק נמוך סורק אחר נוירונים פלואורסצנטיים, ואז עוצמת הלייזר מוגברת כדי לגרום לנזק מקומי. הפציעה מאושרת על ידי פלואורסצנטיות מוגברת ומכתש באתר הפציעה.

גרימת פגיעה עצבית ממוקדת באמצעות לייזר בעל עוצמה גבוהה בזחל דרוזופילה

כאן אנו מתארים פרוטוקול עבור המניפולציה optogenetic פעילות motoneuronal תוך מעקב אחר שינויים בתפוקת מנוע (התכווצות שרירים) בחצי ללא...

הפרעות optogenetic של פעילות עצבית עם תאורת לייזר בחצי ללא פגע<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים בתנועה

זחלי דרוזופילה הם מערכת מודל אטרקטיבית עבור הדמיה חיה בשל הציפורן השקופה שלהם וגנטיקה חזקה. פרוטוקול זה מתאר כיצד לנצל את מכשיר PDMS שכבה אחת, שנקרא 'שבב הזחל' עבור הדמיה חיה של תהליכים תאיים בתוך הנוירונים של 3 זחלי דרוזופילה instar rd.

באמצעות שבבי מיקרופלואידיקה עבור הדמית חיה וחקר תגובות פגיעה ב<em&gt; דרוזופילה</em&gt; זחלים

כאן, אנו מציגים פרוטוקול ablate של subpopulation שכותרתו גנטית של נוירונים על ידי לייזר שני הפוטונים מן דג זברה הזחלים.

אבלציה של אוכלוסיה עצביים באמצעות לייזר שני הפוטונים והערכה שלה באמצעות הדמיית סידן והקלטה התנהגותית הזחלים דג זברה

כאן אנו מציגים פרוטוקול שבו ניתן לדמיין את הסידן הטרום ו/או הפוסט-סינפטיות בהקשר של למידה וזיכרון של דרוזוהילה . בשנת הדמיה vivo סידן באמצעות synaptically חיישנים סידן מקומי משולב עם הפרדיגמה הקלאסית מיזוג ריח כגון הפלסטיות הסינפטית הבסיסית בבסיס סוג זה של למידה אסוציאטיבית עשוי להיקבע.

ב-Vivo סידן הדמיה אופטית של למידה הנגרמת הפלסטיות הסינפטית בדרוזופילה מלאנוסטר

פרוטוקול זה מתאר שיטה להרכבת הזחלים של דרוזוהילה כדי להשיג יותר מ-10 שעות של הדמיה של הפרעות זמן בבעלי חיים חיים שלמים. ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לדמות תהליכים ביולוגיים רבים קרוב לקיר הגוף הזחל.

LarvaSPA, שיטה להרכבה ממושכת על זחל לטווח ארוך הדמיה לזמן קצר

אבלציה בלייזר היא טכנולוגיה ישימה לחקר התחדשות במערכות ביולוגיות. הפרוטוקול המוצג מתאר שימוש במיקרוסקופ קונפוקלי סטנדרטי לסריקת לייזר לאבלציה בלייזר והדמיית זמן-לשגות של התחדשות תאים interneuromast בקו רוחבי של דגי הזברה.

מיקרוסקופ Confocal מבוסס לייזר אבלציה והתחדשות אדון בתאים Interneuromast דגי זברה

פרוטוקול זה מעריך פעילות סינפטית פונקציונלית בין שותפים נוירונליים מוגדרים במערכת העצבים המרכזית של זחלי דרוזופילה מלנגסטר באמצעות כלים מקודדים גנטית. גירוי אופטוגנטי בתיווך CsChrimson של נוירונים סנסוריים פרה-סינפטיים cIVda מעורר פוטוקונברנסציה תלויה בסידן של CaMPARI באינטרנוירונים פוסט-סינפטיים של Basin-4.

אפיון פונקציונלי של שותפים פרה-סינפטיים ופוסט-סינפטיים במערכת העצבים המרכזית של זחל הדרוזופילה באמצעות CaMPARI

למדו אבלציה של תאים בלייזר בזחלי דרוזופילה שלמים לחקר תחרות סינפטית במעגלים עצביים. שיטה זו מאפשרת לחקור את המנגנונים המולקולריים המכוונים התפתחות עצבית.

אבלציה של תאי לייזר בזחלי דרוזופילה שלמים חושפת תחרות סינפטית

גלה סרטונים נוספים