CIRCLE-Seq לחקירת עריכת גנים מחוץ למטרה

הצוות שלנו מוקדש לפיתוח טיפולי תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים, iPSC, למחלות עור חמורות וחשוכות מרפא כגון אפידרמוליזה בולוזה דיסטרופית רצסיבית. אנו שואפים לקבוע אם עריכה גנטית מדויקת בשילוב עם התמיינות iPSC לתאי עור יכולה לספק אפשרות טיפול בת קיימא למצבים אלה. עריכת גנים בתאים סומטיים ו-iPSCs באמצעות טכנולוגיית CRISPR-Cas9 משנה את הרפואה הרגנרטיבית על ידי מתן טיפולים מותאמים אישית למחלות שונות, כולל הפרעות עור גנטיות.

האתגרים הנוכחיים בהנדסה גנטית כוללים השפעות מחוץ למטרה של עורכי גנים. הטיפול דורש עורכי גנים שמתקנים במדויק את הגן המעניין מבלי לשנות מיקומים אחרים בגנום. האתגר שלנו הוא להוכיח שעורכי גנים אינם מכניסים עריכות לא מכוונות מעבר לגן המטרה.

פרוטוקול CIRCLE-seq מאפשר זיהוי של אתרים פוטנציאליים מחוץ למטרה שטכניקות דומות אחרות עלולות לפספס. ניתוח מקיף של אתרים אלה מחוץ למטרה מספק תובנה חשובה לגבי פעילותם של עורכי הגנום, ומשפר את הבטיחות של טיפולים גנטיים, כולל הטיפול מבוסס IPSC שלנו למחלות עור. לאחר גידול תאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במשך חמישה ימים, אספו את התאים על ידי צנטריפוגה והשעו אותם מחדש ב-10 מיליליטר של PBS.

מערבבים שישה מיקרוליטרים של תרחיף תאים בשישה מיקרוליטר טריפן כחול לספירת תאים. לאחר הספירה, יש למנות פעמיים כפול 10 בחזקת שבעה תאים לשפופרת. צנטריפוגה של התאים ב-300 גרם למשך שלוש דקות ב-25 מעלות צלזיוס והשליכו את הסופרנטנט.

הכן את האולטרה-סאונד הממוקד על ידי ביות זרוע הבקרה. מלאו את המאגר במים מטוהרים ונטולי יונים. במחשב הנייד של תחנת הבקרה, גש למפעלי מים ולחץ על מילוי כדי להתחיל למלא את המערכת.

התאם את הטמפרטורה ל -4.5 מעלות צלזיוס. להעביר 25 מיקרוגרם של DNA גנומי מבודד מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים למיקרו-צינור. מלאו את הצינור לנפח כולל של 130 מיקרוליטר עם מאגר TE.

הגדר את התנאים לגזירת ה-DNA לאורך ממוצע של 300 זוגות בסיסים, משך של 10 שניות, הספק שיא של 70, אחוז מקדם חובה ל-20 ומחזורים מתפרצים ל-50. חלקו את ה-DNA הגנומי הגזוז לשני חלקים של 65 מיקרוליטר כל אחד. טהר את הדגימות באמצעות פי 1.8 מנפח חרוזי XP, ולאחר מכן הפרדת מתלה מגנטי.

העבירו את הסופרנטנט ללוחית PCR חדשה ומדדו את כמות הדנ"א באמצעות ספקטרופוטומטר. לבסוף, הפעל מיקרוליטר אחד של ה-DNA הגנומי הנרמז על תחנת קלטת. כדי להתחיל, השעו מחדש את oSQT1288 ואת מתאם סיכת הראש לריכוז סופי של 100 מיקרומולר במאגר TE.

לחישול מתאם, מערבבים 40 מיקרוליטר oSQT1288, 10 מיקרוליטר של 10X STE ו-50 מיקרוליטר מים נטולי נוקלאז כדי להגיע לנפח כולל של 100 מיקרוליטר. לאחר חישול המתאם, מערבבים 10 מיקרוליטר של מאגר קשירה 5X, חמישה מיקרוליטר של DNA ליגאז וחמישה מיקרוליטר של מתאם סיכת ראש מחוסמת, פיפטה 20 מיקרוליטר של מאסטר קשירת המתאם מערבבים לכל דגימת DNA מסולסלת המכילה חרוזים. הניחו את הדגימות בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס למשך שעה, ולאחר מכן החזיקו בארבע מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.

לאחר מכן, העבירו 50 מיקרוליטר של תמיסת ריסוס PEG/NaCl ל-DNA הקשור במתאם. טהר את הדגימות באמצעות חרוזי XP והפרדת מתלה מגנטי. יש להוציא את הדגימות עם 30 מיקרוליטר של חוצץ TE pH שמונה ולשפוך את הסופרנטנטים לתוך לוחית PCR חדשה עם חצאית למחצה.

שלב את הדגימות וכימת את ה-DNA באמצעות בדיקת dsDNA BR. כדי להכין את תערובת המאסטר של המחזור, שלבו שמונה מיקרוליטרים של מים נטולי נוקלאז, 10 מיקרוליטר של מאגר ליגאז 10X TD4 DNA, ושני מיקרוליטרים של T4 DNA ליגאז לנפח כולל של 20 מיקרוליטר. פיפטה 20 מיקרוליטר של תערובת מאסטר המעגל ל-80 מיקרוליטר של 500 ננוגרם DNA שטופלו ב-PNK של המשתמש.

דגרו את הדגימה בתרמו-סייקלר בטמפרטורה של 16 מעלות צלזיוס למשך 16 שעות. למחרת, הוסיפו 100 מיקרוליטר של חרוזי XP ל-DNA המעגלי וטהרו את הדגימות, כפי שהודגם קודם לכן. יש להוציא את הדגימה עם 38 מיקרוליטר של מאגר TE ולשפוך את הסופרנטנט לתוך לוחית PCR חדשה עם חצאית למחצה.

כדי לבקע DNA גנומי מטוהר, הכינו תערובת מאסטר של מחשוף במבחנה על ידי שילוב של חמישה מיקרוליטרים של מאגר 10X Cas9, 4.5 מיקרוליטר של Streptococcus pyogenes Cas9 ו-1.5 מיקרוליטר של RNA גנומי לנפח כולל של 11 מיקרוליטר. דגרו את תערובת מאסטר המחשוף בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות. ליצירת קומפלקסי Cas9 gRNA RNP.

לדלל 125 ננוגרם של DNA גנומי שטופל ב-DNase בטוח לפלסמיד לנפח סופי של 39 מיקרוליטר במים נטולי נוקלאז. לאחר מכן, הוסף 11 מיקרוליטר מתערובת מאסטר המחשוף ל-39 מיקרוליטר של DNA לנפח כולל של 50 מיקרוליטר. דגרו את התערובת בתרמו-סייקלר למשך שעה בחום של 37 מעלות צלזיוס ושמרו אותה על ארבע מעלות צלזיוס ללא הגבלת זמן.

לאחר הדגירה, הוסף 50 מיקרוליטר של חרוזי XP ל-DNA השסוע במבחנה וטהר את ה-DNA על מתלה מגנטי. יש לסלק את ה-DNA המטוהר ב-42 מיקרוליטר של מאגר TE. לניתוח נתוני ריצוף מהדור הבא, התקן את Python גרסה 2.7, Burrows-Wheeler Aligner ו-SAMtools.

הורד את גנום הייחוס מהאתר הנתון. הגדר את קובץ ה-FASTA של גנום הייחוס, את ספריית הפלט לניתוח ואת הנתיבים לפקודות BWA ו-SAMtools. ציין את רצפי היעד ואת הנתיבים לקבצי ה-FASTQ המפורקים הן עבור דגימות ה-nuclease והן עבור דגימות הבקרה.

בצע את הניתוח הסטנדרטי המבוסס על הפניה באמצעות הפקודה הבאה. בעת ביצוע הצינור המלא, אתר את תוצאות הפלט של כל שלב בתיקיית פלט נפרדת המיועדת לשלב ספציפי זה.