Name: יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-26T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 47 s
Description: למדו ליצור מערכת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ונוירונים קורטיקליים מעכברים. שיטה זו מאפשרת מחקר ארוך טווח של אינטראקציות תאיות והגנה נוירונלית במחלות מערכת העצבים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

JP מודה במימון תמיכה ממועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה והמכללה לרפואה של אוניברסיטת ססקצ'ואן. YD מודה בתמיכת מימון מקרן הסטארט-אפ של מכללת ססקצ'ואן לרפואה, מענק התגליות של מועצת המחקר למדעי הטבע וההנדסה של קנדה (RGPIN-2023-03659), מענק MS Canada Catalyst (1019973), מענק הקמת קרן מחקר הבריאות של ססקצ'ואן (6368) ומענק מנהיגי העתיד של קרן Brain Canada בקנדה לחקר המוח. איור 1A, איור 2A ואיור 3A נוצרו עם BioRender.com.

כל בעלי החיים ששימשו במחקר זה שוכנו וטופלו באישור הוועדה האוניברסיטאית לטיפול בבעלי חיים (UACC) של אוניברסיטת ססקצ'ואן והמועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים (CCAC). ימים לאחר הלידה 0-2 CD1 עכברים ונקבות זכר ונקבה וימים עובריים 16-18 (E16-18) עוברים מעכברות CD1 בהריון שימשו למחקר זה. פרטי הריאגנטים והציוד בו נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.
1. תרבית מיקרוגליה ראשונית
הערה: חיוני לתזמן את תרביות הגליה והנוירונים המעורבים, כך שתאי מיקרוגליה יהיו בשלים ומוכנים לקציר תוך יומיים לאחר שתאי עצב נזרעים לתוך צלחת של 96 בארות.
<ol><li>הכנה<ol><li>מדיה טרום חמה מלאה של תרבית גליה, הכוללת את מדיום הנשר המעובד של דולבקו (DMEM) עם גלוקוז גבוה בתוספת סרום בקר עוברי 10% מומת בחום, 50 U/מ"ל פניצילין/סטרפטומיצין עם 2.92 מ"ג/מ"ל L-גלוטמין, 1mM נתרן פירובט, 1x חומצות אמינו לא חיוניות, ו-20 mM של HEPES באמבט מים של 37°C.</li>
		<li>הוסף 5 מ"ל של 10 מיקרוגרם/מ"ל פולי-L-אורניתין (PO) הידרוברומיד לכל בקבוק T-75. סובבו בעדינות את הבקבוק כדי להבטיח שנקודת המכירה תכסה לחלוטין את תחתית הצלוחית. יש לדגור בטמפרטורה של 37°C באינקובטור של 5% CO2 למשך שעה אחת לפחות. הערה: שלב ציפוי זה נדרש כדי להקל על הידבקות התאים לצלוחיות T-75.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד מוחות מעכברי יילודים P0-P2 הערה: לעקר את כל כלי הדיסקציה ולשמור על סטריליות של ריאגנטים. הקפידו על טכניקות אספטיות לאורך כל הדרך.<ol><li>לפני תחילת הנתיחה, רססו את משטח העבודה באתנול 70% או תרסיס חיטוי שבו תתבצע הנתיחה. הגדירו את מיקרוסקופ הדיסקציה והניחו את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. יוצקים 20 מ"ל של מדיה L-15 של לייבוביץ' לתוך צלחת פטרי. יש להשאיר את מכסה צלחת הפטרי דולק בזמן שהמיקרוסקופ אינו בשימוש כדי להפחית את הזיהום.</li>
		<li>הניחו כמה שכבות של מגבת נייר ורססו היטב את מגבות הנייר באתנול 70%. הכינו את כלי הדיסקציה (מספריים לנתיחה, זוג מיקרו-מלקחיים ומלקחיים רקמות) על ידי ריסוס יסודי שלהם באתנול 70% והנחת הכלים על מגבות הנייר.</li>
		<li>העבירו את העכבר בימים שלאחר הלידה 0-2 עכברים על מגבות הנייר ורססו היטב את העכבר באתנול 70%. ערפו את ראשו של העכבר באמצעות מספריים לדיסקציה (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו באופן מוסדי).</li>
		<li>תוך כדי אחיזה עדינה של הראש, צרו חתך בקו האמצע בגולגולת החל מהצוואר ועד האף. לקלף את הגולגולת בחזרה עם מלקחיים רקמות כדי לחשוף את המוח.</li>
		<li>באמצעות מלקחיים רקמתיים, גרפו בעדינות את המוח החוצה על ידי החדרת המלקחיים מתחת למוח והרימו את המוח החוצה מהראש. הכניסו מיד את המוח לצלחת פטרי המכילה 20 מ"ל של מדיית L-15 של לייבוביץ'.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, להסיר בזהירות את גזע המוח ואת קרומי המוח באמצעות זוג מיקרו-מלקחיים. אספו את המוחות בצינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 5 מ"ל של מדיית L-15 של לייבוביץ'.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסוציאציה מוחית, זריעה ושמירה על תרבית גליה מעורבת הערה: בצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית.<ol><li>טוחנים את המוח לכ-1 מ"מ2 חתיכות בעזרת להב אזמל חד פעמי סטרילי. בזהירות להעביר את המוח טחון לתוך צינור סטרילי חדש 50 מ"ל.</li>
		<li>למוח הטחון, הוסף ריכוז סופי של 0.25% טריפסין ודגור על הרקמה באמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. כל 2-3 דקות, מערבבים את התמיסה על ידי היפוך עדין של הצינור כדי לסייע לדיסוציאציה של הרקמות.</li>
		<li>מאינקובטור 5% CO2 , העבירו את צלוחיות T-75 המכילות 5 מ"ל PO לארון הבטיחות הביולוגית. יש להשליך את ה-PO ולשטוף את הצלוחיות 3 פעמים בתמיסת חיץ פוספט סטרילית 1x (PBS). הקפידו לשטוף היטב את הצלוחיות מכיוון שעודף PO רעיל לתאים.</li>
		<li>העבירו את הרקמה המעוכלת מאמבט המים בטמפרטורה של 37 מעלות צלזיוס לארון הבטיחות הביולוגית. הוסף 5 מ"ל של מדיה מלאה של תרבית גליה כדי לנטרל את הטריפסין. מערבבים בעדינות את מתלה הרקמה באמצעות פיפטה 10 מ"ל.</li>
		<li>מניחים מסננת סטרילית של תאי רשת ניילון 70 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל והרטיבו את הרשת על ידי שפיכה של כ-5 מ"ל L-15. מרוקנים בזהירות את תרחיף התא דרך מסננת התא. הסר את הבוכנה מזרק סטרילי 1 מ"ל, לטחון את הרקמה לתוך הרשת באמצעות הבוכנה כדי להיפטר גושי רקמות, וליצור השעיה תא הומוגני.</li>
		<li>מעת לעת, יוצקים כ 5 מ"ל של מדיה L-15 של לייבוביץ לתוך רשת ניילון 70 מיקרומטר ולהמשיך לטחון את הרקמה על הרשת עם בוכנה מזרק 1 מ"ל. כאשר נשארת מעט רקמה נראית לעין על הרשת, השליכו את הרשת והניחו את מתלה התא בצד.</li>
		<li>ערבבו את מתלה התא על ידי פיטום עדין למעלה ולמטה. לכל צלוחיות יש להוסיף נפחים שווים של תרחיף תאים המכיל 1-2 מוחות עם תרבית גליה לנפח סופי של 15 מ"ל.</li>
		<li>לדגור על התאים בטמפרטורה של 37°C באינקובטורCO2 של 5% למשך הלילה. למחרת, שטפו את הצלוחיות פעמיים עם PBS סטרילי 1x כדי להסיר תאים לא מחוברים ולכלוך.</li>
		<li>הוסף 15 מ"ל של מדיה תרבית גליה מלאה טרייה לתרבית ודגרה ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 . לאחר 3 ימים, יש להחליף מחצית מהמדיה ב-10 מ"ל של תרבית גליה טרייה בתוספת 40 ננוגרם/מ"ל של גורם מגרה מושבת מקרופאגים (MCSF). הערה: לאחר מכן, מחצית המדיה מוחלפת ב-10 מ"ל של תרבית גליה טרייה בתוספת 40 ננוגרם/מ"ל של MCSF כל 3 ימים. התרבית נשמרת במשך 8-10 ימים לפני קציר מיקרוגליה.</li>
	</ol></li>
</ol>2. תרבית נוירונים ראשונית
<ol><li>הכנה<ol><li>להפשיר B-27 בתוספת תוספת מ B-27 בתוספת מערכת התרבית העצבית. טרום חום נוירובזאלי פלוס בינוני מ B-27 בתוספת מערכת התרבית העצבית, 1x תמיסת מלח מאוזנת של האנק (HBSS), וסרום בקר עוברי מומת בחום (FBS) ב 37 ° C באמבט מים.</li>
		<li>מעיל T-25 צלוחיות עם 5 מ"ל של 10 מיקרוגרם / מ"ל PO לדגור את הצלוחיות לפחות 1 שעה ב 37 ° C. הכינו מכשירים וציוד לנתיחה. הערה: שלב ציפוי זה מקל על הידבקות התאים לצלוחיות T-25.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד מוחי מעוברי עכברים E16-E18 הערה: לעקר את כל כלי הדיסקציה ולשמור על סטריליות של ריאגנטים. הקפידו על טכניקות אספטיות לאורך כל הדרך.<ol><li>לפני תחילת הנתיחה, רססו את משטח העבודה באתנול 70% או תרסיס חיטוי שבו תתבצע הנתיחה. הגדירו את מיקרוסקופ הדיסקציה והניחו את צלחת הפטרי מתחת למיקרוסקופ. יוצקים 20 מ"ל של 1x HBSS לתוך צלחת פטרי. יש להשאיר את מכסה צלחת הפטרי דולק בזמן שהמיקרוסקופ אינו בשימוש כדי להפחית את הזיהום.</li>
		<li>הניחו כמה שכבות של מגבת נייר ורססו היטב את מגבות הנייר באתנול 70%. הכינו את כלי הדיסקציה (מספריים קפיציים, זוג מיקרו-מלקחיים ומלקחיים רקמות) על ידי ריסוס יסודי שלהם באתנול 70% והנחת הכלים על מגבות הנייר.</li>
		<li>יש להרדים עכברה בהריון בין ימי ההיריון 16-18 באמצעות איזופלורן ולהרדים את העכבר על ידי פריקת צוואר הרחם (בהתאם לפרוטוקולים שאושרו במוסד).</li>
		<li>הניחו את העכבר על גבו על פיסת מגבת נייר ספוגה באתנול 70%. יש לחטא את אזור הבטן באתנול 70%. הרימו את עור הבטן התחתונה בעזרת מלקחיים רקמתיים ובצעו חתך בצורת V מנקודה זו לכלוב הצלעות התחתונות עם מספריים לדיסקציה.</li>
		<li>לתפוס את קרני הרחם המכילות את העוברים עם מלקחיים רקמות בעדינות להסיר את העוברים מחלל הבטן. לחטא בקצרה את קרני הרחם המכילות עוברים עם 70% אתנול.</li>
		<li>יש לנתח עובר אחד מהשק הבודד שלו בכל פעם. בעזרת מספריים קפיציים, יוצרים חתך בקו האמצע בחלק העליון של הגולגולת, החל מהחלק האחורי של הצוואר ועד האף. לאחר מכן, הרימו את הגולגולת מאתר החתך כדי לחשוף את המוח. גרפו בעדינות את המוח בעזרת מלקחיים והעבירו את המוח לצלחת פטרי בקוטר 10 ס"מ המכילה 15 מ"ל של HBSS אחד.</li>
		<li>תחת מיקרוסקופ דיסקציה, הסר בזהירות את גזע המוח ואת קרומי המוח משני צידי קליפת המוח עם זוג מיקרו-מלקחיים. מעבירים את קליפת המוח לתוך צינור חרוטי של 50 מ"ל המכיל 10 מ"ל של HBSS 1x ומניחים על קרח.</li>
	</ol></li>
	<li>דיסוציאציה מוחית וזריעה של נוירונים בקליפת המוח בתרבית תאים הערה: בצע את כל השלבים הבאים בארון בטיחות ביולוגית.<ol><li>טחנו את המוח לכ-1 מ"מ2 חתיכות בצינור החרוטי 50 מ"ל עם להב אזמל חד פעמי סטרילי. העבר את המוח הטחון לתוך צינור חרוטי סטרילי חדש של 50 מ"ל.</li>
		<li>הוסף טריפסין לצינור עם ריכוז סופי של 0.25%. לטבול את הצינור באמבט מים חמים 35-38 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות ולערבב בעדינות את הצינור כדי הומוגניזציה של הרקמה כל 2-3 דקות.</li>
		<li>הוציאו את הצינור מאמבט המים החמים. החזירו בעדינות את תרחיף הרקמה מעלה ומטה כדי לנתק תאים נוספים, ולאחר מכן הוסיפו 0.5 מ"ל של FBS מומת בחום לתרחיף ההומוגני כדי לנטרל את פעילות הטריפסין. הימנעו מבועות אוויר כדי למזער רעילות לתאי עצב.</li>
		<li>הניחו מסננת סטרילית של תאי רשת ניילון בגודל 70 מיקרומטר על צינור חרוטי סטרילי של 50 מ"ל והרטיבו את הרשת על ידי הוספת כ-5 מ"ל של מדיה נוירובזלית. סנן את מתלה התא דרך מסננת תאי רשת ניילון בגודל 70 מיקרומטר. באמצעות בוכנה מזרק 1 מ"ל, לטחון בעדינות את הרקמה לתוך מסננת התא. מעת לעת לשפוך כ 5 מ"ל של 1x HBSS תוך המשך טחינה לשטוף את מסננת התא.</li>
		<li>צנטריפוגה את הצינור החרוטי ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. במהלך תקופה זו, לדלל B-27 בתוספת תוספת במדיה neurobasal plus לריכוז סופי 1x לשימוש כמדיה נוירובזאלית מלאה.</li>
		<li>השליכו את נקודת המכירה בצלוחיות T-25 ושטפו את הצלוחיות שלוש פעמים עם 5 מ"ל של PBS 1x.</li>
		<li>בזהירות decant כדי להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת התא על ידי pipeting בעדינות למעלה ולמטה 2-3 מ"ל של מדיה neurobasal שלם. קבע את ריכוז התאים ואת מספר התאים הכולל עם hemocytometer ו trypan כחול. צפו לעד 1.0 x 107 תאים לכל עובר.</li>
		<li>צלחת את התאים בצלוחיות T-25 מצופות PO עם כ 2.0 x 107 תאים לכל בקבוק ב 5 מ"ל של מדיה נוירובזלית מלאה. לדגור על תרבית התאים ב 37 ° C באינקובטור 5% CO2 .</li>
		<li>בצע החלפת חצי מדיה כל 2-3 ימים על ידי החלפת 2.5 מ"ל של מדיה מבקבוק התרבית עם מדיה נוירובזלית מלאה טרייה.</li>
	</ol></li>
</ol>3. תרבות משותפת של נוירונים ראשוניים מיקרוגליה
הערה: כל השלבים הבאים יבוצעו בארון בטיחות ביולוגית סטרילי.
<ol><li>זריעת נוירונים בצלחות 96 בארות<ol><li>הוסף 100 μL של 10 מיקרוגרם / מ"ל PO לכל באר ודגר על הצלוחיות לפחות 1 שעה ב 37 ° C כדי לצפות את הבארות עם PO. שטפו את הצלחת עם 1x PBS 3 פעמים לפני זריעת התאים ושאפו את כל הנוזלים שנותרו לאחר השטיפה האחרונה.</li>
		<li>תאי עצב הגדלים בצלוחיות T-25 נקצרים לתרבית משותפת לאחר 2-5 ימים בתרבית. החלף את המדיה עם 5 מ"ל של תמיסת Versene 1x עם 0.25% טריפסין ו- 1 מ"ג / מ"ל DNase I כדי לנתק נוירונים מהבקבוק. מניחים את הצלוחיות בתוך האינקובטור למשך 5-6 דקות לעיכול ומערבלים בעדינות את הבקבוק כל 2-3 דקות כדי לסייע בניתוק התא.</li>
		<li>מוציאים את הבקבוק מהאינקובטור ובודקים אם התאים מנותקים תחת מיקרוסקופ. הוסף 0.5 מ"ל של FBS מומת חום כדי לנטרל את הטריפסין וה- DNase I. העבר תאים לצינור חרוטי של 15 מ"ל. לשטוף את הבקבוק עם 5 מ"ל של מדיה neurobasal מלאה פעם אחת כדי למקסם נוירונים שנאספו. לאסוף את כל התאים באותו צינור חרוטי 15 מ"ל.</li>
		<li>צנטריפוגה את תרחיף התא ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. השליכו את הסופרנאטנט והשהו מחדש בעדינות את גלולת התא ב 2-3 מ"ל של מדיה נוירובזאלית מלאה.</li>
		<li>לספור תאים עם hemocytometer ולהוסיף מדיה neurobasal מלאה כדי להשיג ריכוז סופי של 7.5 x 105 נוירונים / מ"ל. זרע 100 μL של תרחיף התא לכל באר בצלחת 96 באר מצופה PO כדי לקבל 7.5 x 104 נוירונים / באר. צפויה תפוקה של 5-6 מיליון נוירונים לכל בקבוק.</li>
		<li>לדגור על תאי העצב בצלחת של 96 בארות למשך הלילה. הוסף 100 μL של מדיה נוירובזאלית מלאה לכל באר למחרת. הערה: ברגע שתאי עצב מציגים צמיחה מתאימה של תהליך עצבי (בסביבות יום 3-4 לאחר הזריעה בצלחות של 96 באר), הם מוכנים לתרבית משותפת עם מיקרוגליה.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד ותרבות משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים<ol><li>בין 8-10 ימים של גידול גליה מעורבת, לאסוף מיקרוגליה על ידי שטיפה עדינה של צלוחיות T-75 עם מדיה תרבית גליה בכל בקבוק עם פיפטה 10 מ"ל, ולהעביר את התאים ואת המדיה לתוך צינור חרוטי סטרילי 50 מ"ל. שטפו שוב את הצלוחיות עם תרבית גליה טרייה בנפח 10 מ"ל כדי לנתק תאי מיקרוגליה נוספים מהצלוחיות ולאסוף את המדיה. צפויה תפוקה של 7.5 x 105 מיקרוגליה לבקבוק.</li>
		<li>הוסף 20 מ"ל של מצעי תרבית גליה טריים בתוספת MCSF של 20 ננוגרם/מ"ל לכל בקבוק. ניתן לקצור מיקרוגליה פעם או פעמיים נוספות אם תרבות הגליה המעורבת נשמרת.</li>
		<li>צנטריפוגה את אוסף התאים ב 300 x גרם במשך 5 דקות ב 4 ° C. בזהירות להסיר את supernatant בעדינות להשעות את הגלולה ב 2 מ"ל של מדיה neurobasal מלא.</li>
		<li>לספור את התאים עם hemocytometer ו trypan כחול. הוסף מדיה נוירובזאלית מלאה לריכוז סופי של 2.5 x 105 תאים / מ"ל.</li>
		<li>מצלחת התרבית העצבית של 96 בארות, הסר 100 μL של מדיה נוירובזאלית והוסף 100 μL של 2.5 x 105 תאים / mL תרחיף תאים לזרע 2.5 x 104 מיקרוגליה לכל באר של 7.5 x 104 נוירונים. לדגור על התרבית במשך הלילה ב 37 ° C בחממה 5% CO2 כדי לאפשר מיקרוגליה לשקוע. התרבות המשותפת עשויה לשמש כעת לניסויים במורד הזרם.</li>
	</ol></li>
</ol>

 פרוטוקול ראשוני של תאי מיקרוגליה ותאי עצב למחקרי אינטראקציה של מערכת העצבים המרכזית

המחברים מצהירים כי אין ניגודי עניינים.

מאמר זה מתאר פרוטוקול לבידוד וטיפוח תאי עצב ראשוניים בעכברים ותאי מיקרוגליה ראשוניים, אשר משמשים לאחר מכן ליצירת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים שניתן להשתמש בהם כדי לחקור כיצד אינטראקציות מיקרוגליה ונוירונים מווסתות את בריאותם ותפקודם בתאים. גישה פשוטה ונגישה יחסית זו יכולה לספק תובנות קריטיות לגבי המנגנונים והתוצאות התפקודיות של אינטראקציות נוירוני מיקרוגליה במערכת העצבים המרכזית.
כדי להשיג תרבות משותפת אופטימלית, מספר היבטים קריטיים בפרוטוקול זה דורשים טיפול נוסף. במהלך בידוד מוחי (שלבים 1.2.6 ו-2.2.7), יש להסיר לחלוטין את קרומי המוח המחוברים לפני השטח של המוח העוברי והמוח שלאחר הלידה לפני איסוף הרקמות. כמו פרוטוקולים אחרים של נוירוגליה, הסרה חלקית של קרומי המוח עלולה לגרום לתרבית תאים להיות מזוהמים בתאי אנדותל או תאים שמקורם בדם 40,41,42. נוסף על כך, בעת גידול תאי עצב ראשוניים (שלבים 2.3.7 ו-3.1.4), חיוני ליצור תרחיף חד-תאי ולהימנע מגושי תאים לפני זריעת תאי עצב לצלוחיות או לצלחות של 96 בארות. אגרגטים עצביים לא ייצמדו כראוי בתרבית ויובילו ללחץ עצבי מוגזם ולמוות תאי. בנוסף, טיפול ממושך בנוירונים עם טריפסין כאשר מנסים לנתק אותם מצלוחיות T-25 עלול לגרום למוות תאי לא רצוי (שלב 3.1.2). כדי למתן זאת, ניתן לזרוע תאי עצב ישירות בצלחות של 96 בארות בצפיפות התא הרצויה לאחר דיסוציאציה ממוחות עובריים (שלב 2.3.7). יתר על כן, בפרוטוקול זה, נבחר יחס נוירון: מיקרוגליה של 3:1 כדי לייצג חלקית כמות מוגברת של מיקרוגליה שעשויה להימצא במיקרו-סביבה של מערכת העצבים המרכזית במהלך דלקת עצבית. לחלופין, ניתן להתאים את יחס התאים בתרבית המשותפת בהתאם לצורך הניסויי. בנוסף, נקודת הזמן שנבחרה עבור תאי עצב בתרבית משותפת עשויה להיות מורחבת אם שואפים להעריך מצבים עצביים בוגרים יותר.
יש לציין כי כאשר מנתקים תאי עצב מצלוחיות T-25 ללוחות של 96 בארות, שימוש בטריפסין לבדו עלול לגרום לדיסוציאציה חלקית ולהיווצרות של גושי תאים במקום תרבית חד-שכבתית בלוחות של 96 בארות (איור 2D). כדי לטפל בבעיה זו, ניתן לנתק תאי עצב מבקבוק T-25 באמצעות תמיסת 1x Versene המכילה 1 מ"ג/מ"ל DNase I. גורמים אחרים התורמים לצבירה עצבית ולירידה בכדאיות כוללים טריטורציה חלקית של השעיית התא, נטרול לא מספק של טריפסין עם FBS מומת בחום, צנטריפוגה מוגזמת או היווצרות כדורי תאים ממושכת. לכן, הבטחת דיסוציאציה תקינה של רקמות ויצירת תרחיף חד-תאי הם קריטיים לביסוס תרבית משותפת בריאה של תאי מיקרוגליה ונוירונים.
פרוטוקול זה נועד לשחזר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים במבחנה כדי להבין טוב יותר את החשיבות התפקודית של האינטראקציות שלהם במערכת העצבים המרכזית. בעוד סוגים אחרים של מערכות תרבית משותפת פותחו, כגון גידול אוכלוסיות תאים בודדים על משטחים שונים כדי לאפשר טיפול עצמאי בשתי אוכלוסיות תאים43,44, מערכת תרבית מעורבת זו מאפשרת מגע ישיר וקרוב של מיקרוגליה ונוירונים. נוסף על כך, כאשר היא נשמרת כראוי באמצעות החלפת חצי מדיה כל 3 ימים, מערכת התרביות המעורבות הזו יכולה להישאר בריאה מ-12 ימים (איור 3F) עד 3 שבועות פוטנציאליים, מה שמאפשר מחקרים ארוכי טווח של אינטראקציות נוירונים-מיקרוגליה45.
בעוד הפשטות היחסית של מערכת התרבית המשותפת מועילה לנגישות, מגבלה מרכזית של גישה זו היא שתרבית התאים הדו-ממדית אינה מייצגת באופן מלא את סביבת הרקמה של מערכת העצבים המרכזית. ואכן, הוכח כי תלת-תרבית של מיקרוגליה, נוירונים ואסטרוציטים מחקה תגובה נוירו-דלקתית in vivo בצורה אמינה יותר מאשר מיקרוגליה או תרבית משותפת אסטרוציטים-נוירונים46,47. יתר על כן, התפתחויות אחרונות במערכות אורגנואידים במוח עם מיקרוגליה ותאי גלייה אחרים, כולל אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים, מתאימים יותר לחקר ארכיטקטורת רקמות תלת-ממדית (תלת-ממדית) ואינטראקציות של מערכת העצבים המרכזית48. באופן דומה, מערכת תלת-ממדית אנושית הכוללת נוירונים, מיקרוגליה ואסטרוציטים הוכחה כיעילה במידול מצב מחלת אלצהיימר49. תרביות אחרות של תאי מיקרוגליה-נוירון אנושיים עשויות להיות רלוונטיות יותר מבחינה פיזיולוגית למחקרים על מחלות נוירודגנרטיביות. לדוגמה, תרבית משותפת של מיקרוגליה ונוירונים מוטוריים שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם50 עשויה להיות שימושית לחקר מחלות כגון טרשת אמיוטרופית צידית51. אף על פי כן, בהתחשב בשפע היחסי ובעלות הנמוכה של יצירת תאי עצב ראשוניים ותאי מיקרוגליה מעכברים, הערכת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים בלוחות של 96 בארות יכולה להיות גישה בעלת תפוקה גבוהה לחקר המנגנונים וההשלכות התפקודיות של אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים. בדיקות במורד הזרם עשויות לכלול שימוש בדימות תאים חיים כדי לקבוע שינויים תפקודיים תאיים בזמן אמת, ריצוף RNA כדי לקבוע שינויים בשעתוק תאי, מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי כדי לקבוע שינויים פנוטיפיים תאיים, ספקטרומטריית מסות כדי לקבוע שינויים תאיים ופרוטאומיים, או בדיקת אימונוסורבנט מקושרת אנזימים וכתם מערבי למדידת חלבון המופרש לסופרנאטנט של תרבית משותפת.
מכיוון שתאי מיקרוגליה הם מתווכים חשובים של בריאות מערכת העצבים המרכזית ומחלות, ניתן להשתמש בתרבות משותפת זו גם כדי לחקור את ההשפעה של מולקולות ותרכובות הקשורות למחלות על תקשורת דו-כיוונית מיקרוגליה-נוירונים. בהקשר של טרשת נפוצה, מיקרוגליה פעילה עלולה לקחת על עצמה תפקיד הרסני, ולתרום להחמרת הפתולוגיה52,53. לדוגמה, הם עשויים להפריש ציטוקינים מעודדי דלקת ומיני חמצן תגובתי, כמו גם לקדם הפעלת אסטרוציטים45. פרוטוקול זה עשוי לעזור לחקור עוד יותר את התפקיד המזיק של מיקרוגליה על-ידי טיפול בתאי מיקרוגליה בתרבית משותפת עם ציטוקינים דלקתיים שנמצאו גבוהים בטרשת נפוצה והערכת התוצאות של בריאות תאי עצב. לחלופין, תרבית מיקרו-נוירונים זו שימשה כדי להראות את ההשפעה המגנה של תאי מיקרוגליה על תאי עצב בתגובה לפוספטידילכולין מחומצן, תוצר חמצוני שהתגלה בטרשת נפוצה54. יתר על כן, אפופטוזיס עצבי מעצב מחדש את ביטוי הגן מיקרוגליה במהלך ההתפתחות על ידי קידום הישרדות מיקרוגליה ופאגוציטוזה55. לכן, פרוטוקול זה עשוי גם לעזור לקבוע את ההשפעה של מוות עצבי על פנוטיפ מיקרוגליה ותפקוד.
לסיכום, פרוטוקול זה מתאר את היצירה והטיפוח המשותף של נוירונים ראשוניים שמקורם בעכבר ותאי מיקרוגליה במבחנה. התרבית המשותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים הבנויה בצלחות של 96 בארות יכולה להיות גישה בעלת תפוקה גבוהה לחקירת המנגנונים והתפקוד של אינטראקציות מיקרוגליה עם נוירונים בהקשר של בריאות ומחלות במערכת העצבים המרכזית, כולל טרשת נפוצה.

מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכני רקמות המאפשרים מעקב חיסוני והומאוסטזיס במערכת העצבים המרכזית (CNS)1,2,3. מקורם בתאי אב אריתרומיאלואידים של שק החלמון המאכלסים את המוח במהלך ההתפתחות העוברית 4,5,6 ונשמרים לאורך כל חיי האורגניזם באמצעות התחדשות עצמית, הכוללת התרבות ואפופטוזיס7. במצב יציב, תאי מיקרוגליה במנוחה הם בעלי מורפולוגיה מוגברת ועוסקים במעקב רקמות 8,9,10.
מיקרוגליה מבטאת קולטנים רבים לפני השטח של התא, מה שמאפשר להם להגיב במהירות לשינויים במערכת העצבים המרכזית11,12 ולקדם תגובות דלקתיות במקרה של זיהומים או פגיעה ברקמות 12,13,14, כמו גם במהלך מחלות נוירודגנרטיביות 9,15, כגון טרשת נפוצה (MS)16,17. מיקרוגליה גם מבטאת קולטנים למוליכים עצביים שונים ולנוירופפטידים 18,19,20, מה שמרמז שהם עשויים גם להגיב ולווסת את הפעילות העצבית 21,22. ואכן, מיקרוגליה ונוירונים מתקשרים בצורות שונות של תקשורת דו-כיוונית 8,23 כגון אינטראקציות ישירות בתיווך חלבוני ממברנה או אינטראקציות עקיפות באמצעות גורמים מסיסים או תאי ביניים23,24.
לדוגמה, מוליכים עצביים שונים המופרשים על ידי נוירונים יכולים לווסת את הפעילות הנוירופרוטקטיבית או הדלקתית של מיקרוגליה 25,26,27. בנוסף, אינטראקציות ישירות בין נוירונים למיקרוגליה עוזרות לשמור על תאי מיקרוגליה במצב הומיאוסטטי28. לעומת זאת, אינטראקציות ישירות של מיקרוגליה עם נוירונים יכולות לעצב מעגלים עצביים29 ולהשפיע על איתות עצבי 30,31,32. מכיוון שהפרעות באינטראקציות אלה גורמות להתרגשות יתר של נוירונים30 ותגובתיות מיקרוגליה 33,34, אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מווסתות מעורבות כגורם תורם למחלות נוירולוגיות33,35. ואכן, מחלות פסיכוטיות23,26 ומחלות נוירודגנרטיביות תוארו כמציגות אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים לא מתפקדות33. בעוד שתצפיות אלה מדגישות את החשיבות של תקשורת מיקרוגליה-עצבית במערכת העצבים המרכזית, מנגנונים ספציפיים של האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות תפקודים מיקרוגליאליים ועצביים בבריאות ובמחלות אינם ידועים יחסית.
בסביבה מורכבת כמו מערכת העצבים המרכזית, גורמים סביבתיים מרובים יכולים להשפיע על אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים, מה שמגביל את היכולת לחקור אינטראקציות תאיות חולפות in vivo. במאמר זה אנו מציגים מערכת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה שניתן להשתמש בה כדי לחקור אינטראקציות תאיות ישירות בין תאי מיקרוגליה לתאי עצב. פרוטוקול זה מתאר את היצירה של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מקליפת המוח של עכברים ילודים בין ימים 0-2 לאחר הלידה לבין ימים 16-18 של עכברים עובריים, בהתאמה. תאי עצב ותאי מיקרוגליה מתורבתים במשותף בלוחות של 96 בארות לצורך ניסויים במורד הזרם, בעלי תפוקה גבוהה. בעבר השתמשנו בגישה זו כדי להדגים כי פגוציטוזה של מיקרוגליה מגנה על תאי עצב מפני מוות תאי מתווך של פוספטידילכולין מחומצן37, מה שמרמז על כך ששיטה זו יכולה לסייע בהבנת תפקידי תאי מיקרוגליה בהקשר של ניוון עצבי וטרשת נפוצה. באופן דומה, תרביות מיקרו-נוירונים עשויות להיות שימושיות גם לחקר ההשפעה של דיבור צולב מיקרוגליה-עצבי בהקשרים אחרים כגון זיהומים ויראליים38 או פגיעה עצבית ותיקון39. בסך הכל, מערכות תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים במבחנה מאפשרות לחוקרים לחקור אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים בסביבה מניפולטיבית ומבוקרת, אשר משלימה מודלים in vivo.

<table><tbody><tr><td>צלחת פטרי 10 ס"מ&nbsp;</td><td>פישר&nbsp;</td><td>07-202-011</td><td>סטרילי</td></tr><tr><td>1x Versene</td><td>Gibco</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>B-27 Plus מערכת תרבית עצבית&nbsp;</td><td>גיבקו&nbsp;</td><td></td><td></td>A3653401</tr><tr><td>דיסקציה מיקרוסקופ</td><td>VWR</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DNase I</td><td>Roche</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11960-044</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי&nbsp;</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>12483-020</td><td></td></tr><tr><td>HBSS (10x)</td><td>Gibco</td><td>14065-056</td><td></td></tr><tr><td>Hemacytometer</td><td>Hausser Scientific</td><td>1475</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>תרמו-פישר מדע</td><td>15630080</td><td></td></tr><tr><td>לייבוביץ' s L-15 בינוני (1x)</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td></td><td></td>21083027</tr><tr><td>גורם מגרה מושבת מקרופאגים&nbsp;</td><td>Peprotech</td><td>315-02</td><td></td></tr><tr><td>מיקרו-מלקחיים</td><td>RWD</td><td>F11020-11</td> חומצות אמינו לא חיוניות <td>אוטוקלאב/סטריליות</td></tr><tr><td></td><td>Cytiva</td><td>SH3023801</td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>ThermoFisher Sci</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>פניצילין סטרפטומיצין גלוטמין (100x)</td><td>Gibco</td><td>103780-16</td><td></td></tr><tr><td>פולי-L-אורניתין הידרוברומיד&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P3655-100MG</td><td></td></tr><tr><td>נתרן פירובט (100 מ"מ)</td><td>Gibco</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>מספריים קפיציים</td><td>RWD</td><td>S11008-42</td><td></td></tr><tr><td>להב כירורגי</td> אוטומטי/סטרילי <td>נוצה</td><td>08-916-5D</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות T-25 סטריליות</td><td>פישר</td><td>10-126-9</td><td></td></tr><tr><td>צלוחיות T-75&nbsp;</td><td>פישר</td><td>13-680-65</td><td></td></tr><tr><td>מלקחיים רקמות</td><td>קודמן</td><td>30-4218</td> מספריים <td>רקמות חיטוי/סטריליות</td></tr><tr><td></td><td>RWD</td><td>S12052-10</td><td>טריפן כחול אוטוקלאב/סטרילי</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>תרמופישר מדע&nbsp;</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>טריפסין (2.5%)</td> <td>ThermoFisher Sci</td><td>15090046</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי בשדה רחב</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

Generating and Co-culturing Murine Primary Microglia and Cortical Neurons

מיקרוגליה הם מקרופאגים שוכנים ברקמה של מערכת העצבים המרכזית (CNS), המבצעים פונקציות רבות התומכות בבריאות העצבית והומאוסטזיס CNS. הם אוכלוסייה עיקרית של תאי חיסון הקשורים לפעילות מחלת CNS, ומאמצים פנוטיפים תגובתיים שעלולים לתרום לפגיעה עצבית במהלך מחלות נוירודגנרטיביות כרוניות כגון טרשת נפוצה (MS). המנגנונים הייחודיים שבאמצעותם תאי מיקרוגליה מווסתים את התפקוד העצבי ואת הישרדותו במהלך בריאות ומחלות נותרו מוגבלים עקב אתגרים בפתרון האינטראקציות המורכבות in vivo בין מיקרוגליה, נוירונים וגורמים סביבתיים אחרים במערכת העצבים המרכזית. לפיכך, גישת ה-in vitro של תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ונוירונים נותרה כלי רב ערך לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירונים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול ליצירה ולתרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ראשוניים ותאי עצב מעכברים. באופן ספציפי, תאי מיקרוגליה בודדו לאחר 9-10 ימים במבחנה מתרבית גליה מעורבת שהוקמה מהומוגנטים במוח שמקורם בעכברים ילודים בין הימים שלאחר הלידה 0-2. תאי עצב בודדו מקליפות המוח של עוברי עכברים בין הימים 16-18. לאחר 4-5 ימים במבחנה, תאי עצב נזרעו בצלחות 96 באר, ולאחר מכן תוספת של מיקרוגליה כדי ליצור את התרבות המשותפת. תזמון זהיר הוא קריטי עבור פרוטוקול זה מכיוון ששני סוגי התאים צריכים להגיע לבשלות ניסויית כדי לבסס את התרבית המשותפת. בסך הכל, תרבית משותפת זו יכולה להיות שימושית לחקר אינטראקציות מיקרוגליה-נוירון ויכולה לספק קריאות מרובות, כולל מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי, הדמיה חיה, כמו גם בדיקות RNA וחלבונים.

תרשים זרימה שמראה את השלבים העיקריים של תרבית גליה מעורבת עבור מיקרוגליה מוצג באיור 1A. באופן כללי, תאים דלילים ופסולת תאית מוגזמת צפויים ביום הראשון (איור 1B). ביום ה-4 יש לראות עלייה במספר התאים, במיוחד עם יצירת אסטרוציטים דבקים, כפי שמצוין על-ידי המורפולוגיה המוארכת שלהם (איור 1C). ניתן לצפות בכמה תאי מיקרוגליה על גבי האסטרוציטים או כתאים עגולים קטנים הצפים במדיה. ביום ה-8, שכבה של אסטרוציטים תיצור את שכבות התאים הנצמדות, בעוד שתאי מיקרוגליה יופיעו כתאים עגולים ובהירים שמחוברים למחצה לאסטרוציטים או צפים במדיה (איור 1D). אם צפיפות המיקרוגליאה נמוכה עד יום 8, ניתן לדגור על התרבית ימים נוספים לפני הקציר.
תרשים זרימה שמראה את השלבים העיקריים של התרבית העצבית מוצג באיור 2A. בתרבית בריאה, תאי עצב נצמדים ויוצרים תהליכים עצביים לאחר 1-3 ימים במבחנה (איור 2B). באופן דומה, כאשר זורעים תאי עצב לתוך צלחת של 96 בארות, הם יופיעו עגולים בהתחלה, אולם ביום ה-3 תאי עצב צריכים להיצמד וליצור תהליכים עצביים שמתחברים עם תאי עצב שכנים (איור 2C). לעומת זאת, תרביות תאי עצב לא בריאות יכילו גושי תאים ופסולת תאים, אשר יכולים לנבוע מדיסוציאציה לקויה של תאים או מטיפול לקוי בתאי עצב (איור 2D).
תרשים זרימה שמראה את שלבי המפתח של פרוטוקול התרבות המשותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים מוצג באיור 3A. לאחר הוספת 2.5 x 104 מיקרוגליה ל-7.5 x 104 תאי עצב, תאי מיקרוגליה עגולים וגדולים אמורים להופיע על גבי או בין תאי העצב ותהליכי הנוירונים (איור 3B). כדי להמחיש עוד יותר את התרבות המשותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים, מיקרוגליה ותאי עצב לבדם או בתרבית משותפת סומנו בנוגדנים 1 (IBA-1, אדום) וטובולין βIII (TUJ1, ירוק)37 עבור מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי (איור 3C-F).
<img alt="תהליך תרבית תאים: תרחיף תאים בודדים מקליפת המוח של עכברים; השלבים המוצגים בתרשים; תמונות מיקרוסקופ." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> איור 1: סקירה כללית של תרבית מיקרוגליה ראשונית. (A) תרשים זרימה של השלבים העיקריים ביצירת תרבית גליה מעורבת. (ב-ד) תמונות מייצגות של מיקרוסקופ שדה בהיר 10x של תרבית גליה מעורבת ביום 1 (B), יום 4 (C) ויום 8 (D). פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig01large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="דיאגרמת תהליך תרבית עצבית; הכנה והדמיה של תאים עובריים של עכבר ב-T25, צלחות 96 בארות." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: סקירה כללית של תרבית תאי עצב ראשונית. (A) תרשים זרימה של שלבי המפתח ביצירת תאי עצב. (B) תמונות מייצגות של מיקרוסקופ שדה בהיר פי 10 המראות תאי עצב בתרבית בצלוחיות T-25. (C) מיקרוסקופ שדה בהיר מייצג פי 10 של תאי עצב בתרבית בלוח של 96 בארות. (D) מיקרוסקופ שדה בהיר מייצג פי 10 של צביר עצבי לא בריא בלוח של 96 בארות. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="זרימת עבודה של בידוד מיקרוגליה וניתוח מיקרוסקופיה; תמונות אימונופלואורסצנטיות מציגות סמנים תאיים." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67078/67078fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: סקירה כללית של תרבית משותפת של תאי עצב במיקרוגליה. (A) תרשים זרימה של שלבי המפתח לתרבית משותפת של תאי מיקרוגליה-נוירונים. (B) תמונות מייצגות של מיקרוסקופ בעל שדה בהיר פי 10 של תרבית מיקרוגליה-נוירונים בלוחות בעלי 96 בארות. פסי קנה מידה: 100 מיקרומטר. (C,D) תמונות מייצגות של מיקרוסקופ אימונופלואורסצנטי של נוירונים בלבד (C), מיקרוגליה בלבד (D), יום 2 של תרבית משותפת של נוירונים ומיקרוגליה (E), או תרבית משותפת של נוירון ומיקרוגליה (F) של 12 יום בצלחת של 96 בארות. מיקרוגליה ותאי עצב מסומנים ב-IBA-1 (אדום) ובטובולין βIII (ירוק), בהתאמה. גרעינים מוכתמים ב-DAPI (כחול). תמונות אימונופלואורסצנטיות נרכשו באמצעות יעד טבילה במים של 25x, 0.8 NA עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67078/67078fig03large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

פרוטוקול זה מתאר תרבית מיקרוגליה-נוירונים שנוצרה מתאים עצביים ראשוניים שבודדו מעוברי עכברים בימים עובריים 15-16 ומתאי מיקרוגליה ראשוניים שנוצרו ממוחם של עכברים ילודים בימים 1-2 שלאחר הלידה.

Microglia are tissue-resident macrophages of the central nervous system (CNS), performing numerous functions that support neuronal health and CNS ...

generating-co-culturing-murine-primary-microglia-cortical

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

בידוד microglia העיקרית מן ההטרוגניות הסלולר של המוח חיוני לחקור את תפקידם של שני תנאים פיסיולוגיים ופתולוגיים. פרוטוקול זה מתאר בידוד מכני תאים משולבים בתרבות הטכניקה המספק תשואה גבוהה טוהר גבוהה, תאים קיימא microglial...

בידוד ראשי microglia מ מעורבים בתרביות תאים גליה של רקמת מוח החולדה ילודים

הסרטון מדגים טכניקה לתרבית אסטרוציטים ראשוניים מקליפת המוח של החולדה. קליפת המוח מנותקת מכנית כדי לקבל תרחיף תאי גליה הומוגני, אשר לאחר מכן מצופה על לוחות מצופים פוליפפטיד כדי לקדם התרבות סלקטיבית של אסטרוציטים. לאחר מכן, האסטרוציטים מנותקים אנזימטית מהלוחות ומועברים למדיה חדשה, המאפשרת תרבית של אסטרוציטים טהורים.

יצירת תרבית ראשונית של אסטרוציטים ממוחו של גור חולדה

הסרטון הדגים את השיטה של בידוד וטיפוח תאים ממוחו של עכבר בילוד. היא כללה דיסוציאציה אנזימטית ומכנית של המוח, ואחריה תרבית במצע גדילה חסר גורם גדילה עצבי כדי להשיג אוכלוסיית גלייה מעורבת.

השגת תרבית תאי גליה מעורבת ממוח עכבר יילוד

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

אנו מתארים נהלים לתיוג וgenotyping עכברי יילוד ויצירת תרבויות עצביות עיקריות מהם. Genotyping הוא מהיר, יעיל ואמין, ומאפשר למיצוי גרעין חומצה אוטומטי. זה שימושי במיוחד עבור עכברי neonatally קטלניים והתרבויות שלהם שדורשות השלמה מוקדמת של genotyping.

המהיר Genotyping של בעלי חיים ואחרי הקמת תרבויות עיקריות של נוירונים במוח

תרביות ראשוניות של Müller glia המתקבלות מרשתיות עכברים מייצגות כלי חזק ואמין מאוד לחקר המרת גליה לתאי אב רשתית לאחר טיפול במיקרו-רנ"א. ניתן לבדוק מולקולות בודדות או שילובים לפני היישום הבא של גישות in vivo .

תרביות תאים ראשוניות לחקר פוטנציאל ההתחדשות של מורין מולר גליה לאחר טיפול במיקרו-רנ"א

פרוטוקול זה מציג דרך ייחודית ליצירת תרביות תאים של מערכת העצבים המרכזית ממוחות עכברים עובריים ביום ה-17 לצורך מחקר נוירו(אימונו)לוגי. ניתן לנתח מודל זה באמצעות טכניקות ניסיוניות שונות, כולל RT-qPCR, מיקרוסקופיה, ELISA וציטומטריית זרימה.

ביסוס תרביות תאי עצב וגליה מעורבים ממוחות עכברים עובריים לחקר זיהומים וחסינות מולדת

לתאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן (AdMSCs) יש תכונות אימונומודולטוריות חזקות השימושיות לטיפול במחלות הקשורות לדלקת. אנו מדגימים כיצד לבודד ולגדל בתרבית של AdMSCs ותאי גליה מעורבים ראשוניים, לעורר AdMSCs כדי לווסת גנים אנטי דלקתיים וגורמי גדילה, להעריך הגירה של AdMSCs, ותרבית משותפת של AdMSCs עם גליה מעורבת ראשונית נגועה בפריון.

תאי סטרומה מזנכימליים שמקורם בשומן מתורבתים יחד עם גליה מעורבת ראשונית כדי להפחית דלקת הנגרמת על ידי פריונים

ב electroporation ברחם היא שיטה ערך עבור transfecting ובתאים עצביים in vivo. בהתאם למיקום של אלקטרודות ואת timepoint ההתפתחותי של electroporation, תת מסוימים של תאים בקליפת המוח יכול להיות ממוקד. התאים הממוקדים אז יכול להיות מנותח in vivo או במבחנה על ההשפעות של שינוי גנטי.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

למדו ליצור מערכת תרבית משותפת של תאי מיקרוגליה ונוירונים קורטיקליים מעכברים. שיטה זו מאפשרת מחקר ארוך טווח של אינטראקציות תאיות והגנה נוירונלית במחלות מערכת העצבים.

יצירה וטיפוח משותף של תאי מיקרוגליה ראשוניים של מורין ונוירונים קורטיקליים

גלה סרטונים נוספים