Name: NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T13:50:00.000+00:00
Duration: 9 min 25 s
Description: חקור דינמיקה מבנית של חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR. שיטה זו מאפשרת ניתוח ספציפי של שיירים בטווח זמן פיקו-שנייה עד ננו-שנייה, ומסייעת להבנת תפקוד מולקולרי של חלבונים לא ממוסדרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>פרוטוקול עבור NMR 15N הרפיה וניסויי hetNOE במחקר דינמיקה של חלבונים

פרוטוקול זה תיאר את ההתקנה של ניסויי הרפיה NMR 15N על ידי Lakomek et al.69 ו- Stief et al.70. התמקדנו ברצפי פולסי NMR באמצעות סכימת זיהוי HSQC משופרת רגישות. ניסויי 15N R1 ו- R1ρ מיושמים כמתואר בפירוט על ידי Stief et al.70, וניסוי hetNOE מתואר על ידי Lakomek et al.69.
בעת הגדרת ניסויי הרפיה NMR, 15N R1ρ הוא הקריטי ביותר, שכן בחירת תקופת הרפיה מקסימלית ארוכה מדי או משרעת RF גבוהה מדי של נעילת הספין עלולה לפגוע בבדיקה. עבור תקופת ההרפיה, דגימה של עקומת הדעיכה המלאה באופן שווה מעוצמה של 100% לעוצמה של 25% (בהשוואה לניסוי הייחוס) רצויה. עבור חלבונים המרגיעים לאט, כגון עקורים, עם 15N T ארוך2 פעמים, זה לעתים קרובות לא יהיה זול לדגום את עקומת הדעיכה במלואה כי שקיעת הכוח לתוך הבדיקה צריך להיות מוגבל.
עבור משרעת תדר רדיו 15N (RF), באופן תיאורטי, ככל שמשרעת RF, νspin-lock גבוהה יותר, כן ייטב, שכן ניתן למקד מחדש יותר תהליכי חליפין. ככלל אצבע, תהליכי חליפין איטיים יותר מ 1 / (2π νspin-lock ) ניתן להתמקד מחדש. עם זאת, חלות מגבלות הספק RF. לדוגמה, ביד שלנו, לא נחרוג מתקופת נעילת סיבוב מקסימלית של 65 אלפיות השנייה כאשר משרעת RF של 2 קילוהרץ מוחלת כדי להישאר בצד הבטוח. יחד עם זאת, משרעת RF של נעילת ספין בספקטרומטר של 600 מגה-הרץ צריכה להיות גבוהה מ-1 קילו-הרץ, למשל, 1.4 קילו-הרץ ב-600 מגה-הרץ, מה שהוכח כמספיק עבור החלבון הכדורי הקטן gb369. כדי לכסות את הרוחב הספקטרלי ולהימנע מהשפעות מחוץ לתהודה בעוצמות שדה גבוהות יותר, משרעת ה- RF המתאימה צריכה להתאים לשדה המגנטי, למשל, גבוהה פי 1.5 ב- 900 MHz (νspin-lock <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67088/67088eq03.jpg" style="margin: auto;"> 2 kHz). עם זאת, הוא חייב להישאר במגבלות הבדיקה. (עיין ברשימה המקומית של מגבלות הספק ספקטרומטר ופנה למנהל מתקן NMR לקבלת ייעוץ.)
לבחירת המרווח של עיכובי הרפיה בין ניסוי הייחוס (עיכוב מקוצר) לבין תקופת ההשהיה הארוכה ביותר (שנקבעה על ידי הגורמים שנדונו לעיל), אנו מעדיפים ריווח שווה של נקודות נתוני השהיית ההרפיה ובוחרים מספר של 8 (אם זמן המדידה המוקצה והאות לרעש מאפשרים). התוספת הראשונה (והבאה אחריה) תישלט על ידי השאריות האינטנסיביות ביותר (ולעתים קרובות המרגיעות האיטיות ביותר). לכן, בהתאם לטווח הדינמי של החלבון, אותות ה-NMR של מספר שאריות ברצף החלבונים עשויים כבר לדעוך לאחר תקופת ההרפיה המקסימלית שנבחרה. על ידי ריווח שווה של נקודות השהיה, אנו מבטיחים שעקומות ההרפיה של השאריות המרגיעות המהירות יכוסו גם על ידי מספר מספיק של נקודות נתונים הדוגמות את עקומת ההרפיה.
כמו כן, בחירה טובה של עיכוב התאוששות היא חיונית כדי לקבל נתוני הרפיה מדויקים ולמנוע נזק לטווח ארוך לבדיקה. אנו בוחרים עיכוב התאוששות של לפחות D1 = 2 שניות כדי למנוע נזק לבדיקה. לקבלת תוצאות מדויקות, יש לתת לחלבון 1H ו-15N קיטוב אורכי מספיק זמן כדי לחזור לשיווי משקל או לפחות למצב יציב ויציב. 1H T1 משתנה בדרך כלל בין 1 s ו 4 s ב 600 MHz עבור חלבון קטן או בינוני (עד 20 kDa); עבור חלבונים גדולים יותר ושדות גבוהים יותר, 1H T1 יגדל עוד יותר. עבור חלבון כדורי קטן gb3, מצאנו D1 = 3.5 s מספיק עבור 15N R1 ו R1ρ ניסויים. עבור IDP Syb-2 הקטן שהוצג בפרוטוקול זה, הראינו לאחרונה כי D1 = 2 s היה מספיק70.
15N hetNOE יש את הרגישות הנמוכה ביותר, כמו עירור מתחיל על 15N, ולא 1 H-15N INEPT בתחילת רצף הדופק מוחל. יתר על כן, תקופת הרוויה של 1H ועיכוב התאוששות של 15N צריכה להיות 5 פעמים 15N T1 כדי לקבל נתונים מדויקים. בעוד שעבור IDP Syb-2 שהוצג כאן, עיכוב רוויה / התאוששות של 5 שניות בתוספת עיכוב התאוששות D1 נוסף של 2 שניות (סה"כ 7 שניות) הספיק, עבור חלבונים גדולים יותר ו / או חלבונים מפורקים, הפעם יכול להיות ארוך משמעותית, למשל, 10 שניות או יותר. עם זאת, אם הנתונים האיכותיים טובים מספיק, ניתן לקבל קיזוז שיטתי קל. במקרה זה, תוצאות סבירות ניתן להשיג כבר ב 3 פעמים 15N T1, כמו 95% של הרוויה יושג. במקרה זה, ערכי hetNOE המתקבלים יציגו היסט שיטתי לערכים גבוהים יותר.
בפרוטוקול זה, עבדנו עם 15N Syb-2 בעל פרוטונציה מלאה, שהוא החסכוני ביותר. דיוורציה של שרשרת צידית מומלצת כדי להפחית את מספר מסלולי ההרפיה ולעבוד עם זוגות הספין המבודדים ביותר של 1 H-15N עמוד השדרה. עם זאת, בהשוואה בין 15N2H Syb-2 ו- 15N syb-2, אנו מבחינים רק בהבדלים מעטים מאוד בין דגימות deuterated ו protonated מלא70. למטרות מעשיות, נתוני הרפיה של NMR נרשמים לעתים קרובות על דגימות בעלות תווית כפולה או משולשת (15N13C או 2H15N13C). רצפי פולסי ה-NMR הנדונים מסוגלים למקד מחדש את התפתחות צימוד J בין 13C לגרעיני 1H או 15N. כמובן, גם מסלולי הרפיה יגדלו כאשר תיוג 13C הוא הציג. עם זאת, בידינו, למטרות מעשיות, השגיאה המוצגת, אם בכלל, היא פחות מ -5% ועשויה להיות מקובלת כאשר יש צורך בנתונים איכותיים בלבד.
כאשר עובדים עם חלבונים בגדלים שונים לצורך זיהוי, עולה לעתים קרובות השאלה האם לבחור בניסויים70 המזוהים עם HSQC משופר רגישות או בניסויים69 שזוהו על ידי TROSY. עבור חלבונים קטנים, ניסויי NMR משופרי HSQC המשופרים מציעים רווח כפול באות לרעש (בתנאי שניתן להשיג דיכוי מים טוב). עבור חלבונים גדולים יותר, הניסויים שזוהו על ידי TROSY ינצחו. האיזון הוא בערך 20 kDa עבור חלבונים מקופלים. עבור עקורים, שעבורם ניתן לקבל קבועי קצב R2 נמוכים שגדלים בערך באופן ליניארי עם הגדלת אורכי השרשרת, הפריצה עשויה לעבור למשקלים מולקולריים גבוהים יותר. למטרות מעשיות, אנו ממליצים ליישם הן את הניסויים המשופרים בזיהוי HSQC והן את הניסויים שזוהו באמצעות TROSY כאשר יש ספק. לאחר מכן, בחר את זה שנותן את האות לרעש הטוב ביותר בהפרש הקבוע הראשון.
הדיון בשאלה האם לבחור בניסויים המשופרים בזיהוי HSQC או בניסויי TROSY-detected תקף רק כאשר אות לרעש הוא הקריטריון העיקרי. כאשר נדרשים רוחב הקו הקטן ביותר והרזולוציה הגבוהה ביותר, TROSY תמיד ינצח. TROSY גם תמיד מציע את דיכוי המים הטוב ביותר, מכיוון שנדרשים פחות פולסי פרוטונים וללא ניתוק פרוטון. אנו מתייחסים לסעיף69 שפורסם קודם לכן לדיון מורחב יותר.
עוד הערה בנושא דיכוי המים. בעוד שהגדרת רווח המקלט (rg) ל-16 עשויה להספיק בקונסולות Bruker Avance NEO, רווח מקלט בטווח של 128-256 רצוי בדרך כלל עבור קונסולות Bruker Avance (ישנות יותר). ה-rg הניתן להשגה (נקבע על ידי פיקוד Bruker rga) מתקבל לעתים קרובות מעוצמת אות המים השיורי לרמת הרעש. דיכוי מים גרוע תמיד יכניס רעש נוסף לספקטרה. לכן, גם אם ניתן להשיג rg = 16 בקונסולת Bruker Avance NEO, אות המים הנותר יכול לתרום באופן משמעותי לרמת הרעש. לכן, יחס האות לרעש יופחת. כתוצאה מכך, אנו ממליצים לכוון לרמת RG של 128-256. רצפי הפולסיםהמוצגים 70 נבדקו ב- 600 MHz ו- 1200 MHz. שתי עוצמות השדה פועלות עם אותו מערך שיפוע, כפי שנכתב ברצף הדופק. אנו ממליצים עליהם לפחות כנקודת התחלה טובה לאופטימיזציה נוספת.
כפי שהוזכר במבוא, ניסויי ההרפיה של NMR שנדונו מכסים רק את טווח הזמן של פיקו-שנייה עד ננו-שנייה. לקבלת תובנות לגבי הדינמיקה של מיקרו-שנייה עד אלפית השנייה, אנו מתייחסים לניסויי פיזור הרפיה, ניסויי CPMG והרחבה של ניסויי R1ρ עם שינוי אמפליטודות נעילת ספין (או תדרי נשא) משמשים 44,46,58,59,60,61,85,86. דינמיקה איטית יותר ממיקרו-שניות ניתנת ללכידה 15N CEST (העברת רוויה של חילופי כימיקלים) NMR62, ספקטרוסקופיית חליפין (EXSY, אלפיות שנייה לשניות), או RT (זמן אמת) NMR (שניות לשעות)63,64. ניתן להשתמש באפקט PRE (שיפור הרפיה פאראמגנטי) של בדיקות פאראמגנטיות, כמו גם צימודים דיפולריים שיוריים (RDC), כדי להעריך את כל הטווח של דינמיקת ps עד ms 65,66,67,68.
כל הניסויים האלה מכסים רק דינמיקה של עמוד השדרה. כדי לחקור דינמיקה של שרשרת צדית, קיי ועמיתיו הציגו שפע נוסף של ניסויי NMR, המספקים מידע על דינמיקת שרשרת צדדית עבור חלבונים עד 1 MDa 2,87.
כדי לקבל תובנות כמותיות יותר על דינמיקת עמוד השדרה של החלבון, יש צורך בניתוח משולב של כל שלושת פרמטרי ה-NMR, 15N R1, R2 ו-hetNOE - לעתים מעורבים פרמטרים נוספים אף יותר, כגון קבועי קצב הרפיה מתואמים צולבים. פותחו שיטות ניתוח מתוחכמות שונות. הגישה המכונה ללא מודלים יושמה באופן נרחב ב- NMR ביומולקולרי 43,88,89,90,91. כמו כן, מיפוי צפיפות ספקטרלית יכול לספק תובנות יקרות ערך 55,92,93. בעוד שאלו שיטות ניתוח רבות עוצמה עבור חלבונים כדוריים עם זמן מתאם סיבובי מוגדר היטב, תחולתם מוגבלת עבור עקורים. תחום מקופל נחוץ כדי להגדיר זמן מתאם סיבובי39. ניתן לעקוף זאת חלקית כאשר ניתן למדל את פונקציית המתאם C(t) על ידי סכום הפונקציות המתפוררות באופן מעריכי במקרה שניתן להפריד היטב בין טווחי הזמן השונים המעורבים 23,31,84. בהיעדר זמן מתאם סיבובי מוגדר היטב, גישות חלופיות הכוללות התפלגות של זמני מתאם, למשל, ניתוח IMPACT94 או ניתוח DETECTOR95,96, הן חלופה. יתר על כן, ניתוח משולב של נתוני הרפיה של NMR והדמיות MD מבטיח גם עבור עקורים97; נכון לעכשיו, אנו עדיין מתמודדים עם מגבלות דגימה ושדה כוח עבור סימולציות אטום מלא של עקורים גדולים יותר31,98.

<table><tbody><tr><td>ספקטרומטר Bruker 600 מגה-הרץ AVANCE III HD&NBSP;</td><td></td><td></td><td>ברוקר https://www.bruker.com/en/products-and-solutions/mr/nmr/avance-nmr-spectrometer.html ניסויי תמ"ג שנערכו&nbsp;</td></tr></tbody></table>

nmr 15n ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

NMR 15N Relaxation Experiments for the Investigation of Picosecond to Nanoseconds Structural Dynamics of Proteins

NMR 15N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy allows studying proteins in solution and under physiological temperatures. Frequently, either the amide ...

nmr-15n-relaxation-experiments-for-investigation-picosecond-to

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

כאן, תיאור מפורט של הפרוטוקול מיושם במעבדה לרכישה וניתוח של 15N פרופילי פיזור הרפיה על ידי פתרון ספקטרוסקופיה NMR מסופק.

15 (15) N פיזור הרפיה CPMG לחקירת דינמיקה קונפורמטיבית חלבון על ציר הזמן μs-ms

אנו מציגים את הליך ההתקנה והניסוי להשגת נתוני smFRET מרשתות תורמים-מקבלות גדולות עם מיקרוסקופ TIRF. הניתוח שלב אחר שלב של מדידות אלו עם תוכנת ההסקה הבייסיאנית Fast-NPS מניב מידע מבני ברזולוציה גבוהה באמצעות יישום מודלים מותאמים של צבע.

מידע מבני מ-מולקולה בודדת סריג ניסויים באמצעות מערכת ננו-המיצוב המהירה

אנו מתארים מסגרת המשלבת ניתוח ביוכימי וחישובי פשוט כדי להנחות את האפיון וההתגבשות של תחומי סליל מפותלים גדולים. ניתן להתאים מסגרת זו לחלבונים כדוריים או להרחיב אותה כדי לשלב מגוון טכניקות בעלות תפוקה גבוהה.

שילוב רטוב טכניקות מעבדה יבשות כדי להנחות את ההתגבשות של חלבונים מפותל, סליל גדולים המכיל

כאן, אנו מציגים את הפרוטוקולים עבור ניצול של חרקים תא baculovirus חלבון ביטוי ומערכת לייצר כמויות גדולות של חלבונים צמח מופרש על התגבשות חלבון. וקטור ביטוי baculovirus השתנה עם GP67 או hemolin חרקים פפטיד אות לביטוי הפרשת חלבון צמחי בתאי חרקים.

שינוי Baculovirus וקטורים ביטוי לייצר מופרש צמח חלבונים בתאי חרקים

פרוטוקול להכנת 13ג,15דוגמאות פטרייתי וצמח התווית על-ידי N רב-ממדי ספקטרוסקופיה NMR של מצב מוצק וחקירות קיטוב גרעיני דינמי (DNP) מוצג.

הכנת פטרייתי, צמח חומרי הבהרה מבניים באמצעות NMR של מצב מוצק קיטוב גרעיני דינמי

פרוטוקול זה מתאר את השילוב של כרומטוגרפיה של החרגת מהגודל עם פיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל) לאפיון מוחלט של חלבונים ומכלולי מערכות בתמיסה. SEC-דוליטל קובע את המשקל המולקולרי והגודל של חלבונים טהורים, מקומיים מקוריים, הטרוקומנים וחלבונים משתנים כגון גליקורופטינס.

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

מטרת הפרוטוקול היא להשתמש בסימולציות דינמיקה מולקולרית כדי לבחון את השינויים המבניים הדינמיים המתרחשים עקב הפעלת מוטציות של חלבון קינאז EGFR.

פענוח ההשפעות המבניות של הפעלת מוטציות סומטיות EGFR עם סימולציה דינמיקה מולקולרית

פרוטוקול זה מאפשר הכנת קטעים רוחביים של זרעי דגנים (למשל, אורז) לניתוח של מורפולוגיה של אנדוספרם וגרגר עמילן באמצעות מיקרוסקופיית אלקטרונים סורקת.

חתך רוחבי של אורז בוגר (Oryza sativa L.) גרעינים לסריקת הדמיית מיקרוסקופיה אלקטרונית באמצעות טיפים פיפטה כתמיכה ללא תנועה

gP2S הוא יישום אינטרנט למעקב אחר ניסויי cryoEM. התכונות העיקריות שלו מתוארות, כמו גם השלבים הדרושים להתקנה וקביעת התצורה של היישום. לאחר קביעת התצורה, היישום מאפשר לרשום במדויק מטה-נתונים הקשורים לניסויי כתם והקפאה שליליים.

gP2S, מערכת ניהול מידע לניסויי CryoEM

אנו מציגים פרוטוקול למדידת דינמיקה מיקרו-אלפית השנייה על ספקטרוסקופיית RNA עם תווית N של 13C/15עם תווית N עם ספקטרוסקופיית פיזור הרפיה של 1H R1ρ.  המוקד של פרוטוקול זה טמון הכנה מדגם טוהר גבוהה והגדרת ניסויי NMR.

היבטים מעשיים של הכנת מדגם והגדרת 1H R1ρ הרפיה ניסויים של RNA

חקור דינמיקה מבנית של חלבונים באמצעות ספקטרוסקופיית NMR. שיטה זו מאפשרת ניתוח ספציפי של שיירים בטווח זמן פיקו-שנייה עד ננו-שנייה, ומסייעת להבנת תפקוד מולקולרי של חלבונים לא ממוסדרים.

NMR ¹⁵N ניסויי הרפיה לחקר דינמיקה מבנית של פיקו-שנייה עד ננו-שניות של חלבונים

גלה סרטונים נוספים