Name: בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:10:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: למדו שיטה לבידוד מיטוכונדריאלי איכותי מרקמת לב מכרסם לחקר מחלות לב. הפרוטוקול משתמש ברספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת איכות המיטוכונדריה ופונקצייתה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>בידוד מיטוכונדריאלי ממכרסמים למחקרים ביואנרגטיים איכותיים

<ol><li>Hogeboom, G. H., Schneider, W. C., Pallade, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochemical+studies+of+mammalian+tissues%3B+isolation+of+intact+mitochondria+from+rat+liver%3B+some+biochemical+properties+of+mitochondria+and+submicroscopic+particulate+material%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cytochemical studies of mammalian tissues; isolation of intact mitochondria from rat liver; some biochemical properties of mitochondria and submicroscopic particulate material.</a> J Biol Chem. 172 (2), 619-635 (1948).</li>
<li>Claude, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionation+of+mammalian+liver+cells+by+differential+centrifugation%3A+Ii.+Experimental+procedures+and+results%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">Fractionation of mammalian liver cells by differential centrifugation: Ii. Experimental procedures and results.</a> J Exp Med. 84 (1), 61-89 (1946).</li>
<li>Ernster, L., Schatz, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%3A+A+historical+review%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mitochondria: A historical review.</a> J Cell Biol. 91 (3 Pt 2), 227s-255s (1981).</li>
<li>Martinez-Reyes, I., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+tca+cycle+metabolites+control+physiology+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial tca cycle metabolites control physiology and disease.</a> Nat Commun. 11 (1), 102(2020).</li>
<li>Vercellino, I., Sazanov, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+assembly%2C+regulation%2C+and+function+of+the+mitochondrial+respiratory+chain%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The assembly, regulation, and function of the mitochondrial respiratory chain.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 23 (2), 141-161 (2022).</li>
<li>Fernie, A. R., Carrari, F., Sweetlove, L. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+metabolism%3A+Glycolysis%2C+the+TCA+cycle+and+mitochondrial+electron+transport%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Respiratory metabolism: Glycolysis, the TCA cycle and mitochondrial electron transport.</a> Curr Opin Plant Biol. 7 (3), 254-261 (2004).</li>
<li>Kalpage, H. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytochrome+C+phosphorylation%3A+Control+of+mitochondrial+electron+transport+chain+flux+and+apoptosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biochem+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytochrome C phosphorylation: Control of mitochondrial electron transport chain flux and apoptosis.</a> Int J Biochem Cell Biol. 121, 105704(2020).</li>
<li>Sousa, J. S., D'imprima, E., Vonck, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Subcell+Biochem%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Subcell Biochem. 87, 167-227 (2018).</li>
<li>Mitchell, P., Moyle, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemiosmotic+hypothesis+of+oxidative+phosphorylation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Chemiosmotic hypothesis of oxidative phosphorylation.</a> Nature. 213 (5072), 137-139 (1967).</li>
<li>Chance, B., Williams, G. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+enzymes+in+oxidative+phosphorylation.+I.+Kinetics+of+oxygen+utilization%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Respiratory enzymes in oxidative phosphorylation. I. Kinetics of oxygen utilization.</a> J Biol Chem. 217 (1), 383-393 (1955).</li>
<li>Li, Z., Graham, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+mitochondrial+oxygen+consumption+using+a+Clark+electrode%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of mitochondrial oxygen consumption using a Clark electrode.</a> Methods Mol Biol. 837, 63-72 (2012).</li>
<li>Rogers, G. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+microplate+respiratory+measurements+using+minimal+quantities+of+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">High throughput microplate respiratory measurements using minimal quantities of isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (7), e21746(2011).</li>
<li>Bisaccia, G., Ricci, F., Gallina, S., Di Baldassarre, A., Ghinassi, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+and+heart+disease%3A+Critical+appraisal+of+an+overlooked+association%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction and heart disease: Critical appraisal of an overlooked association.</a> Int J Mol Sci. 22 (2), 614(2021).</li>
<li>Zhou, B., Tian, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+pathophysiology+of+heart+failure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in pathophysiology of heart failure.</a> J Clin Invest. 128 (9), 3716-3726 (2018).</li>
<li>Holzem, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+structure+and+function+are+not+different+between+nonfailing+donor+and+end-stage+failing+human+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial structure and function are not different between nonfailing donor and end-stage failing human hearts.</a> FASEB J. 30 (8), 2698-2707 (2016).</li>
<li>Cordero-Reyes, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Freshly+isolated+mitochondria+from+failing+human+hearts+exhibit+preserved+respiratory+function%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Cell+Cardiol%22%5BJournal%5D)">Freshly isolated mitochondria from failing human hearts exhibit preserved respiratory function.</a> J Mol Cell Cardiol. 68, 98-105 (2014).</li>
<li>Norat, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+dysfunction+in+neurological+disorders%3A+Exploring+mitochondrial+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial dysfunction in neurological disorders: Exploring mitochondrial transplantation.</a> NPJ Regen Med. 5 (1), 22(2020).</li>
<li>Diaz-Vegas, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Is+mitochondrial+dysfunction+a+common+root+of+noncommunicable+chronic+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Is mitochondrial dysfunction a common root of noncommunicable chronic diseases.</a> Endocr Rev. 41 (3), bnaa005(2020).</li>
<li>Lai, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondrial+subpopulations+from+skeletal+muscle%3A+Optimizing+recovery+and+preserving+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Physiol+%28Oxf%29%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondrial subpopulations from skeletal muscle: Optimizing recovery and preserving integrity.</a> Acta Physiol (Oxf). 225 (2), e13182(2019).</li>
<li>Holmuhamedov, E. L., Oberlin, A., Short, K., Terzic, A., Jahangir, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cardiac+subsarcolemmal+and+interfibrillar+mitochondria+display+distinct+responsiveness+to+protection+by+diazoxide%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cardiac subsarcolemmal and interfibrillar mitochondria display distinct responsiveness to protection by diazoxide.</a> PLoS One. 7 (9), e44667(2012).</li>
<li>Frezza, C., Cipolat, S., Scorrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+isolation%3A+Functional+mitochondria+from+mouse+liver%2C+muscle+and+cultured+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Organelle isolation: Functional mitochondria from mouse liver, muscle and cultured fibroblasts.</a> Nat Protoc. 2 (2), 287-295 (2007).</li>
<li>Micakovic, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+pure+mitochondria+from+rat+kidneys+and+western+blot+of+mitochondrial+respiratory+chain+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">Isolation of pure mitochondria from rat kidneys and western blot of mitochondrial respiratory chain complexes.</a> Bio Protoc. 9 (19), e3379(2019).</li>
<li>Liao, P. C., Bergamini, C., Fato, R., Pon, L. A., Pallotti, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+cells+and+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from cells and tissues.</a> Methods Cell Biol. 155, 3-31 (2020).</li>
<li>Hubbard, W. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fractionated+mitochondrial+magnetic+separation+for+isolation+of+synaptic+mitochondria+from+brain+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Fractionated mitochondrial magnetic separation for isolation of synaptic mitochondria from brain tissue.</a> Sci Rep. 9 (1), 9656(2019).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+mitochondrial+isolation+and+sub-cellular+localization+assay+for+mitochondrial+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for mitochondrial isolation and sub-cellular localization assay for mitochondrial proteins.</a> STAR Protoc. 4 (1), 102088(2023).</li>
<li>Hernandez-Camacho, J. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+mitochondria+from+mouse+skeletal+muscle+for+respirometric+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation of mitochondria from mouse skeletal muscle for respirometric assays.</a> J Vis Exp. (180), e63336(2022).</li>
<li>Farrugia, G. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rapid+and+parallel+isolation+of+myocytes+and+non-myocytes+from+multiple+mouse+hearts%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">A protocol for rapid and parallel isolation of myocytes and non-myocytes from multiple mouse hearts.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100866(2021).</li>
<li>Wollenman, L. C., Vander Ploeg, M. R., Miller, M. L., Zhang, Y., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+respiration+buffer+composition+on+mitochondrial+metabolism+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">The effect of respiration buffer composition on mitochondrial metabolism and function.</a> PLoS One. 12 (11), e0187523(2017).</li>
<li>Vinnakota, K. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Open-loop+control+of+oxidative+phosphorylation+in+skeletal+and+cardiac+muscle+mitochondria+by+ca%282%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Open-loop control of oxidative phosphorylation in skeletal and cardiac muscle mitochondria by ca(2).</a> Biophys J. 110 (4), 954-961 (2016).</li>
<li>Vinnakota, K. C., Bazil, J. N., Van Den Bergh, F., Wiseman, R. W., Beard, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Feedback+regulation+and+time+hierarchy+of+oxidative+phosphorylation+in+cardiac+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Feedback regulation and time hierarchy of oxidative phosphorylation in cardiac mitochondria.</a> Biophys J. 110 (4), 972-980 (2016).</li>
<li>Warnock, L. B., Huang, D. Heparin. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWarnock%2C+LB+%22Statpearls%22">Statpearls</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island (FL). (2024).</li>
<li>Sercel, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+stable+isolated+mitochondrial+recipient+clones+in+mammalian+cells+using+mitopunch+mitochondrial+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating stable isolated mitochondrial recipient clones in mammalian cells using mitopunch mitochondrial transfer.</a> STAR Protoc. 2 (4), 100850(2021).</li>
<li>Lampl, T., Crum, J. A., Davis, T. A., Milligan, C., Del Gaizo Moore, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+functional+analysis+of+mitochondria+from+cultured+cells+and+mouse+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and functional analysis of mitochondria from cultured cells and mouse tissue.</a> J Vis Exp. (97), e52076(2015).</li>
<li>Sobolewski, P., Kandel, J., Eckmann, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Air+bubble+contact+with+endothelial+cells+causes+a+calcium-independent+loss+in+mitochondrial+membrane+potential%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Air bubble contact with endothelial cells causes a calcium-independent loss in mitochondrial membrane potential.</a> PLoS One. 7 (10), e47254(2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Wei, P., Liu, Q., Xue, W., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+assay+of+citrate+synthase+activity+in+drosophila+melanogaster%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A colorimetric assay of citrate synthase activity in drosophila melanogaster.</a> J Vis Exp. (155), e59454(2020).</li>
<li>Tomar, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Substrate-dependent+differential+regulation+of+mitochondrial+bioenergetics+in+the+heart+and+kidney+cortex+and+outer+medulla%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Bioenerg%22%5BJournal%5D)">Substrate-dependent differential regulation of mitochondrial bioenergetics in the heart and kidney cortex and outer medulla.</a> Biochim Biophys Acta Bioenerg. 1863 (2), 148518(2022).</li>
<li>Ter Veld, F., Jeneson, J. A., Nicolay, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+affinity+for+ADP+is+twofold+lower+in+creatine+kinase+knock-out+muscles.+Possible+role+in+rescuing+cellular+energy+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+J%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial affinity for ADP is twofold lower in creatine kinase knock-out muscles. Possible role in rescuing cellular energy homeostasis.</a> FEBS J. 272 (4), 956-965 (2005).</li>
<li>Gouspillou, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+determination+of+the+oxidative+phosphorylation+affinity+for+ADP+in+isolated+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accurate determination of the oxidative phosphorylation affinity for ADP in isolated mitochondria.</a> PLoS One. 6 (6), e20709(2011).</li>
<li>Strubbe-Rivera, J. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mitochondrial+permeability+transition+phenomenon+elucidated+by+cryo-em+reveals+the+genuine+impact+of+calcium+overload+on+mitochondrial+structure+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">The mitochondrial permeability transition phenomenon elucidated by cryo-em reveals the genuine impact of calcium overload on mitochondrial structure and function.</a> Sci Rep. 11 (1), 1037(2021).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+functions+of+cytochrome+C+in+cell+death+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Death+Differ%22%5BJournal%5D)">Diverse functions of cytochrome C in cell death and disease.</a> Cell Death Differ. 31 (4), 387-404 (2024).</li>
<li>Certo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria+primed+by+death+signals+determine+cellular+addiction+to+antiapoptotic+bcl-2+family+members%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Cell%22%5BJournal%5D)">Mitochondria primed by death signals determine cellular addiction to antiapoptotic bcl-2 family members.</a> Cancer Cell. 9 (5), 351-365 (2006).</li>
<li>Bose, S., French, S., Evans, F. J., Joubert, F., Balaban, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+network+control+of+oxidative+phosphorylation%3A+Multiple+roles+of+inorganic+phosphate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Metabolic network control of oxidative phosphorylation: Multiple roles of inorganic phosphate.</a> J Biol Chem. 278 (40), 39155-39165 (2003).</li>
<li>Motawe, Z. Y., Abdelmaboud, S. S., Breslin, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+glycolysis+and+mitochondrial+function+in+endothelial+cells+using+the+seahorse+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Evaluation of glycolysis and mitochondrial function in endothelial cells using the seahorse analyzer.</a> Methods Mol Biol. 2711, 241-256 (2024).</li>
<li>Will, Y., Hynes, J., Ogurtsov, V. I., Papkovsky, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+mitochondrial+function+using+phosphorescent+oxygen-sensitive+probes%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Analysis of mitochondrial function using phosphorescent oxygen-sensitive probes.</a> Nat Protoc. 1 (6), 2563-2572 (2006).</li>
<li>Huerta, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sea+lamprey+cardiac+mitochondrial+bioenergetics+after+exposure+to+TFM+and+its+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Aquat+Toxicol%22%5BJournal%5D)">Sea lamprey cardiac mitochondrial bioenergetics after exposure to TFM and its metabolites.</a> Aquat Toxicol. 219, 105380(2020).</li>
<li>Malyala, S., Zhang, Y., Strubbe, J. O., Bazil, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+phosphate+precipitation+inhibits+mitochondrial+energy+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium phosphate precipitation inhibits mitochondrial energy metabolism.</a> PLoS Comput Biol. 15 (1), e1006719(2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1.7 מ"ל צינורות מיקרוצנטריפוגה</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>10 מ"ל</td><td></td><td></td> זכוכית <td>לחיתוך איברים וטחינת 50</td></tr><tr><td>מ"ל צינורות</td><td></td><td></td> צנטריפוגה <td>צנטריפוגה</td></tr><tr><td>אדנוזין 5'-דיפוספט מונופוטסיום מלח דיהידרט</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>A5285</td><td>מבחני רספירומטריה</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת חלבון BSA תרמו</td><td>ריחני</td><td>PI23225</td><td>כימות חלבון מיטוכונדריאלי</td></tr><tr><td>דקסטרוז</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>DX0145</td><td>עבור חוצץ (CB)</td></tr> <tr><td>אתילן גליקול-ביס(2-אמינו-אתילאתר)-N,N,N',N'-חומצה טטראצטית&nbsp;</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>E4378</td><td>למאגרים (CB ו-IB) ובדיקות רספירומטריה</td></tr><tr><td>צינורית זכוכית</td><td>Radnoti</td><td></td><td>חזיר ניסיונות וחולדה לב פרפוזיה</td></tr><tr><td>הפרין נתרן חזיר רירית</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>SRE0027-250KU</td><td>הזרקת IP של בעלי חיים</td></tr><tr>מד<td>נשימה</td><td></td><td></td> ברזולוציה גבוהה <td>אלקטרודה מסוג קלארק; אוקסיגרף עם תאים של 2 מ"ל</td></tr><tr><td>תא</td><td></td><td></td><td></td>אינדוקציה</tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>792632</td><td>הרדמה&nbsp;</td></tr><tr><td>חומצה L-מאלית</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>02288-50G</td><td>מבחני רספירומטריה</td></tr><tr><td>מגנזיום כלוריד הקסהידרט</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>M9272</td><td>למאגר (RB)</td></tr> <tr><td>מניטול</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>MX0214</td><td>למזרקי</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>מיקרוליטר</td> חוצץ (IB) <td>גדלים הנעים בין 5&ndash; 50 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>קורא</td><td></td><td></td> מיקרופלייט <td>חייב להיות מסוגל לדגור ב-37 מעלות; C&nbsp;</td></tr><tr><td>MOPS</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>475898</td><td>לכל המאגרים</td></tr><tr><td>O2 מיכל</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>OMNI THQ Homogenizer</td><td>OMNI International&nbsp;</td><td>12-500</td><td>הומוגנייזרים דומים של סטטור רוטור יעבדו</td></tr><tr><td>פיפטות</td><td></td><td></td><td>נפחים של&nbsp; 2&ndash; 20 ומיקרו; L; 20&ndash; 200 ומיקרו; L; 200&ndash; 1000 ומיקרו; L</td></tr><tr><td>אשלגן כלורי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>P3911</td><td>למאגרים (RB ו-CB)</td></tr> <tr><td>אשלגן פוספט דו-בסיסי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>795496</td><td>עבור חוצצים (IB ו-RB)</td></tr><tr><td>פרוטאז מ-Bacillus licheniformis</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>P5459</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא&nbsp;</td><td>S9888</td><td>עבור מאגר (CB)</td></tr> <tr><td>נתרן פירובט</td><td>פישר ביו-ריאגנטים</td><td>BP356-100</td><td>בדיקות רספירומטריה</td></tr><tr><td>סוכרוז</td><td>סיגמה&nbsp;</td><td>8510-OP</td><td>עבור חיץ (IB)</td></tr> <tr>ערכת <td></td><td></td><td>דיסקציה כירורגית</td><td>תלוי במקור בעלי חיים ורקמות</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td></td><td></td> שולחנית <td>חייבת להתקרר ל-4 מעלות; C&nbsp;</td></tr></tbody></table>

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם 

Robust Mitochondrial Isolation from Rodent Cardiac Tissue

עם השלמת בידוד המיטוכונדריה, יש לבדוק את האיכות והפונקציונליות של המבודדים באמצעות כימות קצב צריכת החמצן (JO2) באמצעות ספירומטריה ברזולוציה גבוהה. כדי לעשות זאת, מלאי המיטוכונדריה דולל ל -40 מ"ג / מ"ל כדי לאפשר ריכוזי עבודה של 0.1 מ"ג / מ"ל ב -2 מ"ל RB עבור כל בדיקות הספירומטריה באמצעות מיטוכונדריה לב מבודדת. הנשימה תודלקה על ידי 5 mM נתרן פירובט ו 1 mM L-malate בנוכחות 1 mM EGTA, כלטור סידן, והורשה לאזן במשך 5 דקות כדי לבסס נשימה מצב 2. במצב זה, קצב צריכת החמצן צריך להיות בממוצע 45-55 pmol/mL/s או 27-33 nmol/mg/min. היו מודעים לקצב צריכת החמצן התלוי באלקטרודה ובצעו את תיקוני הרקע המתאימים בעת הצורך. זרחן חמצוני (מצב 3) מתחיל בסימן 5 דקות על ידי בולוס של 500 מיקרומטר ADP. תוספות מצע ומעקב מייצג מפורטים באיור 1. למיטוכונדריה פונקציונליים תהיה עלייה מיידית ב-JO2 לאחר הוספת ADP, אשר משתנה בהתאם למקור הרקמה, כפי שמוצג באיור 2. ללא שימוש ב-EGTA, לשאריות הסידן יש השפעות משתנות על השיעורים המרביים של JO2 במהלך OXPHOS, בהתאם לריכוז המיטוכונדריה, זמינות המצע וגורמים סביבתיים אחרים. הרכב החיץ חשוב לשמירה על שלמות ותפקוד הממברנה המיטוכונדריאלית. כל מתכוני החיץ המוזכרים לאורך הפרוטוקול מפורטים עוד יותר בטבלה 1 וניתן להשתמש בהם עבור כל התכשירים המיטוכונדריאליים המתוארים כאן.
בידוד מוצלח של מיטוכונדריה מסומן על-ידי קבלת ערכי RCR הנמצאים בטווח הנתון עבור כל מין ומקור רקמה, כפי שמוצג בטבלה 2. בהתבסס על הנתונים שנאספו באמצעות פרוטוקול זה, אם מבודדים מיטוכונדריה לבבית משרקנים, חולדות או עכברים, RCR צריך להיות ≥16, ≥8 ו- ≥5, בהתאמה. אם מבודדים מכבד או כליה של חולדה, RCR צריך להיות ≥6, בעוד RCR מתאים נחשב מקובל אם מעל 3.8. אם ערכי RCR נופלים מתחת לטווחים אלה או אם יש הבדלים איכותיים במעקב אחר הספירומטריה, מומלץ לבצע בדיקה נוספת עם RB ומצעים חדשים כדי לשלול בעיות מזיהום. למרות שהתמרת 1-1/RCR מגבילה ערכים בין 0 ל- 1, מדד זה אינו מומלץ כאשר משווים את איכות המיטוכונדריה בין מינים או מינים כאשר ערך RCR גדול מ- 10. מסיבה זו, ערכי RCR סטנדרטיים (מצב 3/מצב 2 או OXPHOS/LEAK) כומתו במהלך כל הניסויים. מידע לגבי אפנון שניתן לבצע בפרוטוקול זה כדי לבודד טוב יותר מיטוכונדריה מלבבות, כבד, כליות ותאים של עכברים מפורט בטבלה 3.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig01.jpg"> איור 1: אזורים בעלי עניין לבדיקות בקרת איכות באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. תאי הנשימה היו עמוסים ב -2 מ"ל של RB והורשו להתאזן ב -37 מעלות צלזיוס עד שקצב צריכת החמצן היה קרוב ל -0. לאחר האיזון, 1 mM EGTA, כלטור סידן, נוסף יחד עם 5 mM פירובט נתרן ו 1 mM L-malate. לאחר הוספת מצעים אלה, המיטוכונדריה נוספו בריכוז העבודה הרצוי (0.1 מ"ג/מ"ל) והורשו לנשום במשך 5 דקות כדי להגיע לנשימה במצב 2 (צהוב). בסימן 5 דקות, 500 מיקרומטר ADP נוסף כדי להתחיל נשימה מצב 3 (אדום). RCR נקבעו על ידי ממוצע הזמן של שיעורי צריכת החמצן המסומנים בתיבות האדומות והצהובות כדי להשוות את מצב 3 למצב 2. מצב 4 מסומן בקופסה הירוקה ומייצג את התקופה של הידרוליזה אקסטרה-מיטוכונדריאלית ATPase של ATP וניתן להשתמש בו כדי להעריך את שלמות הממברנה החיצונית בבדיקות ציטוכרום C. הנתונים המוצגים נאספו באמצעות מיטוכונדריה לבבית של חולדות SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67093/67093fig02.jpg"> איור 2: מעקבים מייצגים של JO2 ויחסי בקרה נשימתית בין מקורות של בעלי חיים ורקמות. איכות המיטוכונדריה המבודדים נבדקה על ידי כימות שיעורי צריכת החמצן באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה. הנשימה תודלקה על ידי 5 mM נתרן פירובט ו 1 mM L-malate בנוכחות 1 mM EGTA. מיטוכונדריה ומצעים הורשו לנשום במשך 5 דקות כדי שנשימת מצב 2 תתייצב. שיעורים מרביים של צריכת חמצן לאחר הוספת ADP הושוו למצב 2 של צריכת חמצן לפני ADP כדי לחשב את יחסי בקרת הנשימה (RCR) עבור כל רקמה. איכות המיטוכונדריה הוערכה עוד יותר על ידי חישוב ערכי 1-1/RCR המאופיינים בתקני יעילות בקרת P-L. תרשימי עמודות מימין לכל עקיבה מציינים ערכי RCR ממוצעים של זכר (כחול) ונקבה (ירוק) וערכי RCR של 1-1/RCR ± SD עבור רקמה נתונה. (A), (B) ו-(C) מתייחסים לנתונים שנאספו באמצעות שרקנים, חולדות Sprague Dawley (SD) ולבבות עכברים מסוג Friend leukemia virus B (FVB), בהתאמה. (D) ו-(E) תוצאות מפורטות של כבד וכליות של חולדות SD, בעוד ש-(F) מתייחס לתאי HEK293. שלוש אונות הכבד הגדולות יותר נאספו, בעוד שתי הכליות שימשו לבידוד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: מתכוני חיץ. יש להכין מראש חיץ קרדיופלגיה (CB), חיץ בידוד (IB) וחיץ נשימה (RB) המשמשים בתהליך הבידוד בהתאם להוראות המפורטות. CB יכול להיות מאוחסן עד חודש ב 4 ° C, בעוד IB ו RB ניתן לשמור במשך 4 חודשים ב -80 ° C. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 2: ניתוח יחס בקרת נשימה. בידוד מיטוכונדריאלי לצורך ניתוחים פונקציונליים נערך במגוון רחב של מינים ומקורות רקמות במכרסמים זכרים ונקבות כאחד, כמו גם בתאי HEK293. גודל הדגימה של כל מין, מקור רקמה ומינים מפורט יחד עם ערכי RCR ממוצעים וערכי 1-1/RCR ± SD. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%202.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 3: מודולציות מומלצות לפרוטוקול בידוד מיטוכונדריאלי עבור רקמות שונות כדי להגדיל את תפוקת החלבון. שינויים בכמויות של פרוטאז וצנטריפוגות מוצגים בהתאם למקור הרקמה. כמויות ממוצעות של חלבון כולל (מ"ג) חושבו מתוצאות בדיקת חלבון BSA ומנפח התרחיף של הגלולה המיטוכונדריאלית הסופית. הערכים מדווחים כממוצע ± SD. הוראות מודגשות הכלולות בעמודת הצנטריפוגה מייעצות אם להשליך, לשמור או לאגד את הסופרנאטנט. השלכה מתייחסת לסילוק הסופרנאטנט במיכל פסולת ביולוגית, בעוד ששמירה ואיגום מתייחסים להעברת הסופרנאטנט לצינור הצנטריפוגה הבא או איסופו לסחרור הסופי, בהתאמה. פרטים נוספים על שינויים בפרוטוקול ניתן למצוא בחלק הדיון. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67093/67093_Table%203.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>

Mitochondrial isolation has been practiced for decades, following procedures established by pioneers in the fields of molecular biology and biochemistry ...

robust-mitochondrial-isolation-from-rodent-cardiac-tissue

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

אנו מתארים פרוטוקול а עבור בידוד של לב טהור בשילוב עכברוש מאוד המיטוכונדריה ללימודי פונקציונליים או מבניים של bioenergetics הסלולר, מדידות biophysical, proteomics או הדנ"א המיטוכונדרי וניתוח שומנים.

הכנה של הלב עכברוש מצמידים מאוד המיטוכונדריה

פרוטוקול זה מתאר הליך ללמוד את הנשמה של המיטוכונדריה מבודד שרירי השלד. שיטה זו הותאמה מ...

בידוד מיטוכונדריאלי של שריר השלד

פרוטוקול spectrofluorometric למדידת פתיחת מעבר המיטוכונדריה חדירות הנקבובית בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה מוצג כאן. הבדיקה כרוכה במדידה בו הזמנית של Ca...

מדידת פרמטר-Multi של הפתיחה הנקבובית מעבר החדירות בלב עכבר מבודד המיטוכונדריה

שיטה לבידוד מהיר של המיטוכונדריה מביופסיות רקמות יונקים מתוארת. כבד חולדה או תכשירי שרירי שלד היה הומוגני עם Dissociator רקמה מסחרי ומיטוכונדריה היו מבודדת על ידי סינון ההפרש דרך מסנני רשת ניילון. זמן בידוד מיטוכונדריאלי הוא &lt;30 דקות בהשוואה ל60-100 דקות תוך שימוש בשיטות אלטרנטיביות.

בידוד מהיר וטיהור של מיטוכונדריה להשתלה על ידי דיסוציאציה רקמות ודיפרנציאל סינון

השוואה של פוטנציאל הממברנה המיטוכונדריאלית בין דגימות מניבה מידע רב ערך על מצב התא. מתוארים שלבים מפורטים לבידוד מיטוכונדריה והערכת תגובה למעכבים ומנתקים באמצעות פלואורסצנטיות. השיטה והתועלת של פרוטוקול זה מומחשות על ידי שימוש בתרבית תאים ומודל בעלי חיים של מתח תאי.

בידוד וניתוח פונקציונלי של המיטוכונדריה מתאים בתרבית ורקמות עכבר

כאן, אנו מציגים שינוי של שיטה שדווחה בעבר המאפשרת בידוד של מיטוכונדריה איכותית ומטוהרת מכמויות קטנות יותר של שרירי שלד עכבר. הליך זה מביא למיטוכונדריה בצימוד גבוה שנושמים בתפקוד גבוה במהלך מבחני רספירומטירק מבוססי מיקרופלייט.

בידוד של המיטוכונדריה מכמויות מינימליות של שרירי שלד עכבר למדידות תפוקה גבוהה microplate נשימה

כאן, דגימת שריר ארבע ראשי נלקחת מחזיר מורדם והמיטוכונדריה מבודדת על ידי צנטריפוגה דיפרנציאלית. לאחר מכן, קצב הנשימה של מתחמי שרשרת הנשימה המיטוכונדריאלית I, II ו-IV נקבעים באמצעות רספירומטריה ברזולוציה גבוהה.

בידוד של המיטוכונדריה ללא פגע מן שרירי השלד על ידי דיפרנציאל צנטריפוגה מדידות Respirometry ברזולוציה גבוהה

כאן, אנו מציגים שני פרוטוקולים עבור המידה של Ca2 + זרם מיטוכונדריאלי המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית. עבור המיטוכונדריה מבודד, אנחנו פירוט של צלחת המבוסס על הקורא Ca2 + ייבוא assay באמצעות של Ca2 + רגיש לצבוע סידן ירוק-5N. עבור תאים בתרבית, אנו מתארים שיטה מיקרוסקופיה קונפוקלית באמצעות Ca2 + לצבוע רוד-2/AM.

ניתוחים של סידן מיטוכונדריאלי זרם המיטוכונדריה מבודד, תאים בתרבית

כאן, אנו מתארים שיטה מפורטת לבידוד המיטוכונדריה משריר השלד של העכבר ואת הניתוח הבא של נשימה על ידי שיעור צריכת חמצן (OCR) באמצעות בדיקות respirometric מבוססות מיקרופלט. צינור זה יכול להיות מיושם כדי לחקור את ההשפעות של התערבויות סביבתיות או גנטיות מרובות על חילוף החומרים המיטוכונדריאלי.

בידוד המיטוכונדריה משריר שלד העכבר לבדיקות ספירומטריות

פרוטוקול זה מתאר טכניקה לניתוח של סופרקומפלקסים נשימתיים כאשר רק כמויות קטנות של דגימות זמינות.

בידוד מיטוכונדריה לניתוח סופר-קומפלקס מיטוכונדריאלי מדגימות רקמה קטנה ותרביות תאים 

למדו שיטה לבידוד מיטוכונדריאלי איכותי מרקמת לב מכרסם לחקר מחלות לב. הפרוטוקול משתמש ברספירומטריה ברזולוציה גבוהה להערכת איכות המיטוכונדריה ופונקצייתה.

בידוד מיטוכונדריאלי חזק מרקמת לב מכרסם

גלה סרטונים נוספים