נהלי הפעלה והכלה ביולוגית של מתקן לעכברי מעבדה עם מיקרוביום טבעי: נוהל אימונופנוטיפ
13 בדצמבר 2024
כאן, אנו מתארים את המבנה ונהלי ההפעלה, כולל אמצעי בלימה מיקרוביאליים של מתקן ל"עכברי פרא" באמצעות דגימת דם לאימונופנוטיפ כדוגמה.
אנו חוקרים את השפעות התזונה על מערכת החיסון. ואנו מתעניינים במיוחד בהשפעות האנטי אייג'ינג והאנטי דלקתיות של הגבלת קלוריות ומשטרי צום ותפקיד המיקרוביוטה בתהליכים אלה. עכברים פראיים משלבים את הרקע הגנטי המאופיין היטב של זני עכברי מעבדה ואת המיקרוביום הטבעי של עכברים משוטטים חופשיים.
אולם המיקרוביום הטבעי של עכברי הפרא האלה מכיל וירוסים, חיידקים וגם טפילים, ולכן מהווה אתגר למתקני גידול בעלי חיים. תרומתו של מרכז QUEST למחקר אחראי הייתה פיתוח מסגרת ששת ה-R, המשפרת את שלושת ה-Rs המוכרים לנו מראסל וברץ', החלפה, עידון והפחתה, על ידי שילוב שלושה חוסן, רישום ודיווח נוספים. מסגרת זו נועדה לשפר את יכולת השחזור והשקיפות של מחקר פרה-קליני.
והרעיון הוא שממצאים ניסיוניים הם אמינים יותר, אמינים יותר, ובסופו של דבר ניתנים לתרגום להקשרים קליניים. במהלך ארבע השנים האחרונות, פיתחנו את הקונספט של מתקן לעכברים פראיים עם הליכי הכלה ביולוגית מובחנים. ברצוננו לחלוק את המומחיות שלנו עם חוקרים כדי לאפשר להם לכלול עכברים עם מיקרוביום טבעי בעבודתם.
שבץ מוחי שכיח ביותר בקרב אנשים מזדקנים. למערכת החיסון יש תאי זיכרון שנלחמים בחלקיקים זיהומיים וחיים עם מיקרוביוטה הטרוגנית. לפיכך, מידול שבץ בעכברים פראיים הוא מודל מעודן במכרסמים המשקף טוב יותר את מצבם של המטופלים.
לאחר החלפת מכנסי אזורים, קוזאקים וכיסויי נעליים חד פעמיים, הסר נעליים וגרביים בחדר הכניסה של מקלחת האוויר. לבשו גרבי שטח וציוד מגן אישי לכל הגוף, כולל סרבל Tyvek, רשת שיער, כפפות כותנה, כפפות ניטריל ומסכות פנים. היכנס לאזור הלבישה של אזור מקלחת האוויר דרך כיסוי הרצפה הדביק.
בזמן מקלחת אוויר, הרם את הידיים ובצע סיבוב של 360 מעלות. צא ממקלחת האוויר ונעל נעלי אזור בצד השני. העבירו את העכבר מחדרם בכלוב סגור ומאוורר בנפרד לחדר ההליכים.
מקם את העכבר המורדם שוכב על השולחן המחוטא ואחוז בשרוול צווארו כדי לדחוס את ורידי הצוואר. בעזרת יד אחת, אבטח את ראש העכבר עם האגודל והאצבע. הכנס נימים טריים לקנתוס המדיאלי של העין מתחת לקרום המנקר בזווית של 45 מעלות.
סובב את הנימים דרך קרום הסינוס בחלק האחורי של המסלול עד שהדם מתחיל לזרום. אסוף לפחות 15 מיקרוליטר דם בצינור איסוף דם המכיל טיפה של EDTA. שחרר את האחיזה בשרוול הצוואר לפני הסרת הנימים כדי למזער את הדימום לתוך הרקמה.
השתמש בפד גזה נקי או ספוגית כדי לעצור את הדימום ולהבטיח המוסטזיס. סובב מעט את הצינור כדי לערבב את הדם וה-EDTA מבלי לנער אותו ולאחסן את דגימת הדם על קרח. לאחר השלמת דגימת הדם, יש להחליף כפפות ולחטא את כל החומרים והמשטחים.
לבשו ביגוד מגן חדש בזרם האוויר הלמינרי של הגישה, או LAF, הממוקם מול תא הנוסעים של ה-LAF. חטאו את מיכלי הדגימה והוציאו אותם דרך דלת ההזזה בקיר הזכוכית של תא ה-LAF. לאחר העברת מיכלי הדגימה לאדם השני, יש לחטא את כל המשטחים.
קבל מיכלי דגימות מחוטאים מאזור הטבע ללא מגע ישיר דרך דלת ההזזה בקיר הזכוכית של תא ה-LAF. לאחר מכן, השאירו סרבל חד פעמי ונעלי שטח בתוך האזור המיועד. השלך את רשת השיער, כפפות הגומי ומסכת הפנים.
היכנס מיד למקלחת האוויר בגרבי האזור. הרם את הידיים ובצע סיבוב של 360 מעלות בזמן מקלחת אוויר. צאו ממקלחת האוויר והניחו גרבי אזור בקולט הכביסה.
לבשו גרביים אישיות, נעליים וכיסויי נעליים חד פעמיים. הפקידו את הבגדים בחדר ההלבשה, אספן הכביסה והחליפו לבגדים רגילים.
סקירה כללית
מאמר זה בוחן את השפעות התזונה על מערכת החיסון, תוך התמקדות בהשפעות נוגדות הזדקנות ונוגדות דלקת של הגבלה קלורית וצום. הוא מדגיש את האתגרים המוצבים על ידי המיקרוביום הטבעי של 'Wilding mice' במסגרות מחקריות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מדעי המוח
- אימונולוגיה
- גידול בעלי חיים
רקע
- עכברי Wilding משלבים גנטיקה של עכברי מעבדה עם המיקרוביום הטבעי של עכברים השוטטים בטבע.
- המיקרוביום הטבעי כולל וירוסים, חיידקים וטפילים, דבר המסבך את הטיפול בבעלי החיים.
- מרכז QUEST למחקר אחראי פיתח מסגרת של שש R כדי לשפר את השחזוריות של המחקר.
- מסגרת זו מתבססת על שלושת ה-Rs המסורתיים: replacement (החלפה), refinement (שיפור) ו-reduction (צמצום).
מטרת המחקר
- לבחון את השפעת התזונה על תגובות חיסוניות.
- להעריך את תפקידם של הגבלת קלוריות וצום בתהליכי הזדקנות ודלקת.
- לבחון את השפעות המיקרוביוטה על תהליכים אלו.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- דגימת דם לצורך אימונופנוטיפיקציה.
- אמצעים להכלה מיקרוביאלית במתקני מחקר.
- יישום מסגרת six R לשקיפות מחקרית.
- ניתוח הרכב המיקרוביום בעכברי Wilding.
תוצאות עיקריות
- זיהוי האתגרים בשימוש בעכברי Wilding במחקר בשל המיקרוביום שלהם.
- הדגמת הפוטנציאל של הגבלה קלורית וצום על בריאות המערכת החיסונית.
- הדגשת החשיבות של מסגרת ששת ה-R בשיפור פרקטיקות מחקר.
- מתן תובנות לגבי הקשר בין תזונה, מיקרוביוטה ותפקוד חיסוני.
מסקנות
- לתזונה יש השפעה משמעותית על מערכת החיסון ועל תהליכי הזדקנות.
- עכברים בטבע (Wilding mice) מציבים אתגרים ייחודיים הדורשים ניהול קפדני.
- מסגרת ה-six R יכולה לשפר את האיכות ואת היכולת לשחזר תוצאות במחקר פרה-קליני.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית ניהולית
שילוב של עכברי מעבדה בעלי מיקרוביום טבעי, כגון עכברי Wildling, בתהליכי עבודה של אימונופנוטיפינג (immunophenotyping), נותן מענה לפער קריטי ברלוונטיות התרגומית של מודלים פרה-קליניים. תשתית זו ומסגרת פרוצדורלית זו מאפשרות פרופיל חיסוני בעל כושר ניבוי גבוה יותר על ידי שיקוף מדויק של מורכבות מערכת החיסון האנושית, ובכך תומכות ברמת ביטחון גבוהה יותר בשלבי הגילוי המוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים. גישה זו משפרת את קבלת ההחלטות בנוגע לתיקי הפיתוח על ידי אספקת נתונים חסונים וניתנים לשחזור, המאפשרים קבלת החלטות מושכלת יותר לגבי קידום הפיתוח בהתאם לסיכון.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביו-פרמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר חקירה של מסלולי חיסון במערכת בעלת מורכבות מיקרוביום רלוונטית לבני אדם.
- תומך בהפחתת סיכונים ביולוגיים על ידי חשיפת פנוטיפים חיסוניים שאינם נלכדים במודלים מסוג SPF.
- משפר את הביטחון החזוי עבור תיקוף מטרה באמצעות תוצרי אימונו-פנוטיפינג רובסטיים.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מקל על הכנת אוכלוסיות של תאי מערכת החיסון שעברו ולידציה עבור בדיקות המשך.
- מייצב את פרוטוקולי דגימות הדם וההכלה כדי להבטיח הדירות בין מחקרים.
- מאפשר פרופיילינג חיסוני כמותי, התומך בהערכה מהימנה של תרכובות בתהליכי סריקה.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה מודלים חיסוניים פרה-קליניים למערכות הרלוונטיות למחלות בבני אדם באמצעות שמירה על מיקרוביום טבעי.
- מספקת רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני על ידי תמיכה בקריאות (readouts) של מערכת חיסונית בוגרת.
- מפחיתה סיכונים בקידום טרנסלציונלי באמצעות הפקת נתונים בעלי יכולת יישום קלינית גבוהה יותר.
שילוב תהליכי עבודה ומסלולי עיבוד
מתקן זה והליך האימונופנוטיפינג מגשרים בין שלבי הגילוי המוקדמים למחקר הפרה-קליני, ומאפשרים בדיקה חסונה של השערות והבהרה של מסלולים חיסוניים במודלים בעלי ערך תרגומי מוגבר.
- ביולוגיה של גילוי: תומך בבדיקת היפותזות על מודולציה חיסונית בהקשר של מיקרוביום טבעי.
- סריקה: מספק מדידות כמותיות וניתנות לשחזור של תאי מערכת החיסון לצורך פיתוח בדיקות (assays).
- אנליטיקה: מספק פלטי אימונופנוטיפינג סטנדרטיים להשוואה בין תנאים שונים.
- מחקר טרנסלציונלי: מתאים את תוצרי מערכת החיסון לסמנים ביולוגיים רלוונטיים לבני אדם ולמודלים של מחלות.
- שימוש חוזר ארגוני: מבסס מתקן ותהליך עבודה הניתנים לשימוש חוזר עבור תוכניות מו"פ מתמשכות הממוקדות במערכת החיסון.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתהליכי תיקוף של מטרות חיסוניות.
- ערך תפעולי: מספק נהלי אימונופנוטיפיקה סטנדרטיים, ניתנים להרחבה ולשחזור.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות משופרת לגבי המשך התקדמות (go/no-go) ומפחית סיכון ביולוגי בשלבים מאוחרים באמצעות שיפור הרלוונטיות של המודל.
- השפעה על הפורטפוליו: תומך בתעדוף מותאם סיכונים ובקידום של נכסים למודולציה חיסונית.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בגידול בעלי חיים, אימונולוגיה ופרוטוקולים של ביטחון ביולוגי (biocontontainment).
- דורש תשתית מתקנים ייעודית לבידוד מיקרוביום והפרדה של תהליכי העבודה.
- מחייב סטנדרטיזציה קפדנית בין צוותים בנושאי דגימה ונהלי חיטוי.
- עשוי לדרוש התאמה עבור זני עכברים שונים או מודלים של מחלות.
- המורכבות התפעולית עולה עם הצורך בביטחון ביולוגי קפדני והדרכת כוח אדם.
