Name: ייצור ואפיון מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה של אקסוזומים (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T14:55:00.000+00:00
Duration: 7 min 41 s
Description: למדו לייצר ולאפיין מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה יעילה של אקסוזומים. שיטה זו משפרת את היציבות והשימושיות הקלינית של הטיפולים המבוססים על אקסוזומים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

פ.ל.ק. מעריכה את התמיכה הנתמכת על ידי תוכנית המחקר והפיתוח החלוצית של ג'ג'יאנג (2022C03031), תוכנית המחקר והפיתוח הלאומית של סין (2021YFA0910103), הקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (22274141, 22074080), הקרן למדעי הטבע של מחוז שאנדונג (ZR2022ZD28) ותוכנית המלגות טאישאן של מחוז שאנדונג (tsqn201909106). H.C. מכירה בתמיכה הכספית מהקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (82202329). המחברים מודים על השימוש במכשירים במתקן הליבה של המכשור המשותף במכון האנגג'ואו לרפואה (HIM), האקדמיה הסינית למדעים.

מדבקות מיקרו-מחטים לאספקה מתמשכת של אקסוזומים ביישומים ביו-רפואיים

<ol><li>Barile, L., Vassalli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+Therapy+delivery+tools+and+biomarkers+of+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmacol+Ther%22%5BJournal%5D)">Exosomes: Therapy delivery tools and biomarkers of diseases.</a> Pharmacol Ther. 174, 63-78 (2017).</li>
<li>Kalluri, R., Lebleu, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+biology%2C+function%2C+and+biomedical+applications+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">The biology, function, and biomedical applications of exosomes.</a> Science. 367 (640), 6977(2020).</li>
<li>Mathieu, M., Martin-Jaular, L., Lavieu, G., Thery, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificities+of+secretion+and+uptake+of+exosomes+and+other+extracellular+vesicles+for+cell-to-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Specificities of secretion and uptake of exosomes and other extracellular vesicles for cell-to-cell communication.</a> Nat Cell Biol. 21 (1), 9-17 (2019).</li>
<li>Nair, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybrid+nanoparticle+system+integrating+tumor-derived+exosomes+and+poly%28amidoamine%29+dendrimers%3A+Implications+for+an+effective+gene+delivery+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Mater%22%5BJournal%5D)">Hybrid nanoparticle system integrating tumor-derived exosomes and poly(amidoamine) dendrimers: Implications for an effective gene delivery platform.</a> Chem Mater. 35 (8), 3138-3150 (2023).</li>
<li>Lu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dendritic+cell-derived+exosomes+elicit+tumor+regression+in+autochthonous+hepatocellular+carcinoma+mouse+models%5BTitle%5D)+AND+%22J+Hepatol%22%5BJournal%5D)">Dendritic cell-derived exosomes elicit tumor regression in autochthonous hepatocellular carcinoma mouse models.</a> J Hepatol. 67 (4), 739-748 (2017).</li>
<li>Oskouie, M. N., Aghili Moghaddam, N. S., Butler, A. E., Zamani, P., Sahebkar, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Therapeutic+use+of+curcumin-encapsulated+and+curcumin-primed+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Therapeutic use of curcumin-encapsulated and curcumin-primed exosomes.</a> J Cell Physiol. 234 (6), 8182-8191 (2019).</li>
<li>Yuan, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Macrophage+exosomes+as+natural+nanocarriers+for+protein+delivery+to+inflamed+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Macrophage exosomes as natural nanocarriers for protein delivery to inflamed brain.</a> Biomaterials. 142, 1-12 (2017).</li>
<li>Liao, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes%3A+The+next+generation+of+endogenous+nanomaterials+for+advanced+drug+delivery+and+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biomater%22%5BJournal%5D)">Exosomes: The next generation of endogenous nanomaterials for advanced drug delivery and therapy.</a> Acta Biomater. 86, 1-14 (2019).</li>
<li>Zhu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comprehensive+toxicity+and+immunogenicity+studies+reveal+minimal+effects+in+mice+following+sustained+dosing+of+extracellular+vesicles+derived+from+hek293t+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Comprehensive toxicity and immunogenicity studies reveal minimal effects in mice following sustained dosing of extracellular vesicles derived from hek293t cells.</a> J Extracell Vesicles. 6 (1), 1324730(2017).</li>
<li>Wen, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+mesenchymal+stem+cell-derived+extracellular+vesicles+in+a+radiation+injury+bone+marrow+murine+model%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of mesenchymal stem cell-derived extracellular vesicles in a radiation injury bone marrow murine model.</a> Int J Mol Sci. 20 (21), 5468-5482 (2019).</li>
<li>Cheng, Y., Zeng, Q., Han, Q., Xia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+pH%2C+temperature+and+freezing-thawing+on+quantity+changes+and+cellular+uptake+of+exosomes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">Effect of pH, temperature and freezing-thawing on quantity changes and cellular uptake of exosomes.</a> Protein Cell. 10 (4), 295-299 (2019).</li>
<li>Jana, B. A., Shivhare, P., Srivastava, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gelatin-PVP+dissolving+microneedle-mediated+therapy+for+controlled+delivery+of+nifedipine+for+rapid+antihypertension+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Hypertens+Res%22%5BJournal%5D)">Gelatin-PVP dissolving microneedle-mediated therapy for controlled delivery of nifedipine for rapid antihypertension treatment.</a> Hypertens Res. 47 (2), 427-434 (2024).</li>
<li>Zheng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapidly+dissolvable+microneedle+patch+with+tip-accumulated+antigens+for+efficient+transdermal+vaccination%5BTitle%5D)+AND+%22Macromol+Biosci%22%5BJournal%5D)">A rapidly dissolvable microneedle patch with tip-accumulated antigens for efficient transdermal vaccination.</a> Macromol Biosci. 23 (12), e2300253(2023).</li>
<li>Huang, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+delivery+of+nucleic+acid+molecules+into+skin+by+combined+use+of+microneedle+roller+and+flexible+interdigitated+electroporation+array%5BTitle%5D)+AND+%22Theranostics%22%5BJournal%5D)">Efficient delivery of nucleic acid molecules into skin by combined use of microneedle roller and flexible interdigitated electroporation array.</a> Theranostics. 8 (9), 2361-2376 (2018).</li>
<li>Zhou, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reverse+immune+suppressive+microenvironment+in+tumor+draining+lymph+nodes+to+enhance+anti-pd1+immunotherapy+via+nanovaccine+complexed+microneedle%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Res%22%5BJournal%5D)">Reverse immune suppressive microenvironment in tumor draining lymph nodes to enhance anti-pd1 immunotherapy via nanovaccine complexed microneedle.</a> Nano Res. 13 (6), 1509-1518 (2020).</li>
<li>Kim, Y. C., Park, J. H., Prausnitz, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+for+drug+and+vaccine+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Microneedles for drug and vaccine delivery.</a> Adv Drug Deliv Rev. 64 (14), 1547-1568 (2012).</li>
<li>Bui, V. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dissolving+microneedles+for+long-term+storage+and+transdermal+delivery+of+extracellular+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Dissolving microneedles for long-term storage and transdermal delivery of extracellular vesicles.</a> Biomaterials. 287, 121644(2022).</li>
<li>Nir, Y., Potasman, I., Sabo, E., Paz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fear+of+injections+in+young+adults%3A+Prevalence+and+associations%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Trop+Med+Hyg%22%5BJournal%5D)">Fear of injections in young adults: Prevalence and associations.</a> Am J Trop Med Hyg. 68 (3), 341-344 (2003).</li>
<li>Zhang, Y., Jiang, G., Yu, W., Liu, D., Xu, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedles+fabricated+from+alginate+and+maltose+for+transdermal+delivery+of+insulin+on+diabetic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mater+Sci+Eng+C+Mater+Biol+Appl%22%5BJournal%5D)">Microneedles fabricated from alginate and maltose for transdermal delivery of insulin on diabetic rats.</a> Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 85, 18-26 (2018).</li>
<li>Roy, G., Garg, P., Venuganti, V. V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle+scleral+patch+for+minimally+invasive+delivery+of+triamcinolone+to+the+posterior+segment+of+eye%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Pharm%22%5BJournal%5D)">Microneedle scleral patch for minimally invasive delivery of triamcinolone to the posterior segment of eye.</a> Int J Pharm. 612, 121305(2022).</li>
<li>Creighton, R. L., Woodrow, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microneedle-mediated+vaccine+delivery+to+the+oral+mucosa%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Healthc+Mater%22%5BJournal%5D)">Microneedle-mediated vaccine delivery to the oral mucosa.</a> Adv Healthc Mater. 8 (4), 1801180(2019).</li>
<li>Hu, S., Zhu, D., Li, Z., Cheng, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detachable+microneedle+patches+deliver+mesenchymal+stromal+cell+factor-loaded+nanoparticles+for+cardiac+repair%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Detachable microneedle patches deliver mesenchymal stromal cell factor-loaded nanoparticles for cardiac repair.</a> ACS Nano. 16 (10), 15935-15945 (2022).</li>
<li>Yang, W., Zheng, H., Lv, W., Zhu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+status+and+prospect+of+immunotherapy+for+colorectal+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Colorectal+Dis%22%5BJournal%5D)">Current status and prospect of immunotherapy for colorectal cancer.</a> Int J Colorectal Dis. 38 (1), 266-276 (2023).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+and+technologies+for+exosome+isolation+and+characterization%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Methods%22%5BJournal%5D)">Methods and technologies for exosome isolation and characterization.</a> Small Methods. 2 (9), 1800021(2018).</li>
<li>Bosch, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Trehalose+prevents+aggregation+of+exosomes+and+cryodamage%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Trehalose prevents aggregation of exosomes and cryodamage.</a> Sci Rep. 6, 36162(2016).</li>
<li>Bhattacharyya, M., Jariyal, H., Srivastava, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hyaluronic+acid%3A+More+than+a+carrier%2C+having+an+overpowering+extracellular+and+intracellular+impact+on+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Carbohydr+Polym%22%5BJournal%5D)">Hyaluronic acid: More than a carrier, having an overpowering extracellular and intracellular impact on cancer.</a> Carbohydr Polym. 317, 121081(2023).</li>
<li>Chang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryomicroneedles+for+transdermal+cell+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Cryomicroneedles for transdermal cell delivery.</a> Nat Biomed Eng. 5 (9), 1008-1018 (2021).</li>
</ol>

H. C., F.L.Q ו- S.J.M הם ממציאים בבקשת פטנט שהוגשה על סמך הנתונים בכתב יד זה. H.C. הוא המייסד המדעי של Medcraft Biotech. בע"מ

נכון לעכשיו, השיטות העיקריות לבידוד אקסוזומים כוללות אולטרה-צנטריפוגה, צנטריפוגה הדרגתית צפיפות, אולטרה-סינון, משקעים, חרוזים מגנטיים של זיקה חיסונית ומיקרופלואידיקה24. בשל יכולת ההעמסה המוגבלת של מיקרו-מחטים הנגרמת על ידי שטח קצה המחט הקטן שלהם, יש צורך להגדיל את ריכוז האקסוזומים כדי לטעון יותר. לכן, בחרנו באולטרה-סינון כדי לרכז את תרבית התא ולאחר מכן השתמשנו באולטרה-צנטריפוגה כדי לבודד את האקסוזומים. ריכוז האקסוזומים הוגדל על ידי כמות קטנה של תרחיף נוזלי כך שניתן היה לטעון את המיקרו-מחטים בעשרות עד מאות מיקרוגרמים של אקסוזומים. עם זאת, שיטה זו גורמת לנוכחות משמעותית של חלבונים בתמיסה האקזוזום המבודדת. בנוסף, אובדן משמעותי של אקסוזומים מתרחש במהלך תהליך הצנטריפוגה. כיום, אחת המגבלות של היישום הטיפולי של אקסוזומים היא היעדר שיטות יעילות לבודד אקסוזומים עם טוהר גבוה ובכמויות גדולות. ככל שהפוטנציאל הקליני של אקסוזומים נחקר יותר ויותר, יש צורך לפתח טכניקות מתקדמות יותר בעתיד כדי להתמודד עם האתגרים הקשורים למיצוי שלהם.
טכנולוגיית המפתח במחקר זה היא תכנון של מיקרו-מחטים מבוססות אקסוזומים. על מנת למזער את בזבוז האקסוזומים ולהשיג השפעות טיפוליות חזקות יותר, אומצה שיטת יציקה דו-שלבית לייצור טלאים exo@MN. טרהלוז דווח בעבר כחומר מתאים לשימור ליופילי של אקסוזומים25, בעוד שחומצה היאלורונית מפגינה תאימות ביולוגית מצוינת, הידרופיליות ותפקודה בעיכוב דלקת וקידום תיקון העור26. ייצור קצות מחטים עמוסי אקסוזום באמצעות שני חומרים אלה מסייע לשמור על הפעילות הביולוגית של האקסוזומים, ומאפשר את פירוקם המהיר ושחרורם בתוך העור. יתר על כן, גישה זו ממזערת את הסיכון לזיהום ותורמת להחלמה מהירה של העור. באמצעות צנטריפוגה וייבוש ואקום, האקסוזומים התרכזו בקצות המחטים. בהתחשב בחוסר התאימות של אתנול וטרהלוז, PVP מומס באתנול מוחלט נבחר כחומר הגיבוי. שיטת ייצור שכבתית זו שיפרה ביעילות את יעילות המסירה של האקסוזומים.
היציבות הירודה של אקסוזומים במבחנה, בין אם היא מאוחסנת ב-4°C, 37°C או -80°C, עלולה להוביל לשינויים במבנה האקזוזום או להתדרדרות11. על מנת לפתור בעיה זו, מספר מחקרים בחנו את שיטות האחסון של אקסוזומים, כגון ייבוש בהקפאה. טכנולוגיית מיקרו-מחטים מספקת אסטרטגיה חדשנית נוספת. על ידי ייבוש ב- RT, טכנולוגיית מיקרו-מחטים יכולה לשפר את יציבות האקסוזומים וניתן להשתמש בה ישירות למשלוח אקסוזום ללא טיפולים אחרים. יתר על כן, תהליך המיצוי של אקסוזומים הוא מורכב ונוטה להתכלות, מה שהופך יישומים בקנה מידה גדול למאתגרים. אחסון אקסוזומים שחולצו באמצעות טכנולוגיית מיקרו-מחטים אינו מפשט את שלבי המיצוי אלא מפחית את מספר העקירות הנדרשות. מיצוי בודד יכול לייצר כמות גדולה של exo@MN טלאי, אשר ניתן לאחסן לתקופה ממושכת. שימוש במיקרו-מחטים אקסוזום מאותה אצווה עבור כל טיפול ממזער את ההשפעה הפוטנציאלית של שינויים בין אצוות שונות על התוצאות הטיפוליות, ובכך משפר את החזרתיות והאמינות של ננו-פלטפורמה אקסוזום27. זה מספק אפשרויות נוספות ליישום קליני של אקסוזומים.
במחקר עתידי כדאי לבחון שיטות המאפשרות שליטה מדויקת במטען וממזערות את השונות התרופתית בין קצות המחטים. ניתן להשיג זאת באמצעות אופטימיזציה של תהליכים, יישום אמצעי בקרת איכות ושימוש בטכניקות מתקדמות. טיפול בהיבטים אלה יתרום באופן משמעותי לפיתוח מערכות אספקת תרופות אמינות ועקביות.

אקסוזומים, שהם שלפוחיות קטנות המשתחררות על ידי תאים לתוך המטריצה החוץ תאית, הוצעו כטיפולים ביולוגיים פוטנציאליים ווקטורים למתן תרופות לטיפול במספר מחלות וסרטן1. במהלך תהליך הביוגנזה שלהם, אקסוזומים עוטפים מולקולות ביולוגיות פעילות שונות מתוך התאים, כולל חלבונים פונקציונליים וחומצות גרעין2. כתוצאה מכך, כאשר הם נלקחים על ידי התאים המקבלים במהלך תהליך ההובלה, לאקסוזומים יש את היכולת לווסת את ביטוי הגנים ואת תפקודי התאים בתאי היעד3. כסוג של שליח מידע טבעי, אקסוזומים נוצלו במלואם בהתחדשות רקמות, ויסות חיסוני, וכמוביל משלוח4. באמצעות טכניקות הנדסיות, ליגנדות ספציפיות יכולות להיות מועשרות על פני השטח של אקסוזומים, מה שמאפשר אינדוקציה או עיכוב של אירועי איתות בתאי המקבל או מיקוד לסוגי תאים ספציפיים5. ניתן גם לטעון חומרים כימותרפיים לתוך אקסוזומים לטיפול בסרטן6. יתר על כן, אקסוזומים יש את היכולת לחצות את מחסום הדם-מוח עבור משלוח מטען טיפולי, מה שהופך אותם מבטיחים מאוד לטיפול בהפרעות מוח7. בהשוואה לליפוזומים, אקסוזומים מפגינים ספיגה תאית משופרת ותאימות ביולוגית משופרת8. הם מסוגלים להיכנס ביעילות לתאים אחרים תוך הפגנת סבילות טובה יותר ורעילות נמוכה יותר9. עם זאת, הזרקת הבולוס המסורתית של אקסוזומים מועדת לקיבוע ופינוי מהיר על ידי הכבד, הכליות והטחול בזרם הדם10. יתר על כן, לאקסוזומים יש יציבות נמוכה במבחנה והם רגישים לתנאי אחסון, המגבילים את היישומים הקליניים שלהם11.
מיקרו-מחטים, מערך של קצות מחטים בגודל מיקרומטרי, מסוגלים לחדור מחסומים פיזיולוגיים להעברת תרופות במולקולות קטנות12, חלבונים13, חומצות גרעין14 וננו-תרופות15. מיקרו-מחטים מהונדסות במדויק כדי להתמקד בנגעים על פני העור, והקצוות המפוזרים שלהן מבטיחים פיזור תרופות אחיד באתר הממוקד, ובכך מגבירים את השפעתם הטיפולית16. העיצוב והרכב החומר של מיקרו-מחטים מאפשרים אחסון יבש של חומרים ביו-אקטיביים כגון חלבונים וחומצות גרעין, ומשפרים את יציבותם17. לשיטות ההזרקה המסורתיות יש משך פעולה קצר יחסית והן עלולות לגרום לכאב, ולעורר פחד בקרב מטופלים18. אורך המיקרומטר של מיקרו-מחט ממזער טראומה לרקמות ומונע גירוי עצבי, ובכך מבטל כאב ומשפר את היענות המטופל19. בנוסף, האופי הידידותי למשתמש של מיקרו-מחטים מאפשר למטופלים לנהל את הטיפול באופן עצמאי ללא צורך בצוות מיוחד16. בנוסף לעור, מיקרו-מחטים יכולות לשמש גם ברקמות כגון העיניים20, רירית הפה21, הלב22 וכלי הדם23. היישום של microneedles עבור משלוח קליני של exosomes מספק אסטרטגיה מבטיחה ופוטנציאלית.
לפיכך, אנו מציגים תיקון מיקרו-מחט (exo@MN) עמוס אקסוזום וחושפים את שיטת הייצור שלו. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו בשיטת יציקה דו-שלבית, יחד עם צנטריפוגה וייבוש ואקום, המקדמים צבירה של אקסוזומים בקצות המיקרו-מחטים, ובכך משפרים את יעילות ההעברה. גם קצות המחט וגם הגב נבנו מחומרים המציגים תאימות ביולוגית מעולה ומסיסות במים. טרהלוז וחומצה היאלורונית (HA) שולבו כחומרי קצה כדי לספק הגנה לאקסוזומים, ופוליוויניל פירולידון (PVP) מומס באתנול מוחלט נבחר כחומר הגיבוי. המורפולוגיה של מדבקת המיקרו-מחט אופיינה באמצעות מיקרוסקופ ומיקרוסקופ אלקטרונים סורק (SEM). הבדיקה המכנית של המיקרו-מחט הוערכה באמצעות מד מתיחה כדי לאשר את יכולתם לחדור לעור, וקצב השחרור על עור חזיר נחקר כ-60 שניות. יתר על כן, המורפולוגיה, הגודל ותכולת החלבונים הן של אקסוזומים טריים והן של אקסוזומים exo@MN אופיינו באמצעות מיקרוסקופ אלקטרונים תמסורת (TEM), ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים (NTA) וכתמים מערביים (WB). הפנמת האקסוזומים על ידי תאים דנדריטיים (DCs) אופיינה באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי (CLSM), והבשלת DCs הוערכה באמצעות ציטומטריית זרימה. האפיון המורפולוגי והתפקודים הביולוגיים של שני סוגי האקסוזומים עקביים במהותם.

<table><tbody><tr><td>100x תמיסות פניצילין-סטרפטומיצין</td><td>Jrunbio</td><td>Scientific MA0110</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>180 kDa סמן חלבון צבוע מראש</td><td>Thermo</td><td>26616</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>3% אורניל אצטט</td><td>הנאן Ruixin אספקה ניסיונית</td><td>GZ02625</td><td>אפיון מורפולוגי של אקסוזומים</td></tr><tr><td>מדפסת תלת מימד</td><td>טכנולוגיית</td><td>BMF עובש nanoArch S130</td><td> הכנה</td></tr><tr><td>4%&ndash; 20% ג'ל טרומי</td><td>Genscript</td><td>ExpressPlus PAGE GEL</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>5&times; מאגר טעינה SDS-PAGE</td><td>Titan</td><td>04048254</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>נגד עכבר Alix נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>12422-1-AP</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>נגד עכבר CD63 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>ab217345</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>APC נגד עכבר CD80 נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>104713</td><td>נוגדן</td></tr><tr><td>ציפוי עדין אוטומטי</td><td>ZIZHU</td><td>JBA5-100</td><td>אפיון מורפולוגי של</td></tr><tr><td>ערכת בדיקת BCA</td> מיקרו-מחט <td>Beyotime</td><td>P0012</td><td>בדיקת ריכוז חלבון</td></tr><tr><td>צנטריפוגה</td><td>תרמו פישר</td><td>Muitifuge X1R pro</td><td>צנטריפוגת תאים</td></tr><tr><td>משאבת ואקום מים במחזור</td><td>Yuhua Instrument</td><td>SHZ-D(III)</td><td></td></tr> <tr><td>חממת CO2</td> סינון <td>Eppendorf</td><td>CellXpert C170</td><td>תרבית</td></tr> <tr><td>תאיםמיקרוסקופ סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>A1HD25</td><td>הדמיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>רשת נחושת</td><td>בייג'ינג Zhongjingkeyi טכנולוגיה&nbsp;</td><td>JF-ZJKY/300</td><td>אפיון מורפולוגי של אקסוזומים</td></tr><tr><td>D- (+) -טרהלוז דיהידראט</td><td>אלאדין</td><td>5138-23-4</td><td>ייצור מיקרו-מחטים&nbsp;</td></tr><tr><td>דולבקו s שונה Eagle' s medium</td><td>Meilunbio</td><td>MA0212</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>Dulbecco' s תמיסת מלח חוצצת פוספט</td><td>Meilunbio</td><td>MA0010</td><td></td></tr><tr><td>מערכת אלקטרופורזה</td> תרבית תאים <td>Bio-rad</td><td>PowerPac-basic</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי</td><td>Jrunbio Scientific</td><td>JR100</td><td>תרבית תאים</td></tr><tr><td>FITC אנטי עכבר CD11c נוגדן</td><td>Biolegend</td><td>117305</td><td></td></tr><tr><td>ציטומטריית זרימת</td> נוגדנים <td>BD</td><td>LSR Fortessa</td><td>זיהוי פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>מצלמת ג'ל</td><td>Cytiva</td><td>Amersham ImageQuant 800</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>HRP מצומד אנטי ארנב IgG</td><td>CST</td><td>7074S</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>HTL שרף</td><td></td><td>טכנולוגיית BMF</td><td>הכנת עובש</td></tr><tr><td>חומצה היאלורונית (MW = 300 kDa)</td> <td>Bloomage Biotechnology</td><td>9004-61-9</td><td>ייצור מיקרו-מחט&nbsp;</td></tr><tr><td>שמן טבילה</td><td>Nikon</td><td>MXA22168</td><td>הדמיה פלואורסצנטית</td></tr><tr><td>מנקה יונים</td><td>JEOL</td><td>EC-52000IC</td><td>אפיון מורפולוגי של אקסוזומים</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ</td><td>אולימפוס</td><td>CKX53</td><td>התבונן בתהליך המסת קצה המיקרו-מחט</td></tr><tr><td>תא סרטן השחלות של העכבר ID8</td><td>MeisenCTCC</td><td>&nbsp; </td><td>CC90105 תרבית תאים</td></tr><tr><td>ניתוח מעקב אחר ננו-חלקיקים</td><td>חלקיק Metrix</td><td>Zetaהצג</td><td>ניתוח גודל של אקסוזומים</td></tr><tr><td>פסיפיק כחול נגד עכבר נוגדן I-A/I-E</td> נוגדן <td>Biolegend</td><td>107619</td><td></td></tr><tr><td>פנילמתאן סולפוניל פלואוריד</td><td>Beyotime</td><td>ST507</td><td>מעכבי פרוטאז</td></tr><tr><td>מנקה פלזמה</td><td>Hefei Kejing טכנולוגיית חומרים</td><td>PDC-36G</td><td>ייצור מיקרו-מחט&nbsp;</td></tr><tr><td>פולידימתילסילוקסן</td><td>דאו קורנינג</td><td>9016-00-6</td><td>הכנת עובש</td></tr><tr><td>פוליוויניל פירולידון (MW = 40 kDa)</td><td>אלאדין</td><td>9003-39-8</td><td>ייצור מיקרו-מחט&nbsp;</td></tr><tr><td>פריזמה&nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>גרסה 9</td><td>ניתוח סטטיסטי</td></tr><tr><td>ממברנת PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western Blotting</td></tr><tr><td>צנטריפוגה מהירה</td><td>בקמן</td><td>344619</td><td>מיצוי אקסוזומים</td></tr><tr><td>RIPA מאגר ליזה</td><td>Applygen</td><td>C1053</td><td>קרום ליזה</td></tr><tr><td>מכון הנצחה רוזוול פארק 1640</td><td>Meilunbio</td><td>MA0548</td><td>תרבית</td></tr> <tr><td>תאיםמיקרוסקופ אלקטרונים סורק</td><td>JEOL</td><td>JSM-IT800</td><td>אפיון מורפולוגי של מיקרוסקופ סטריאו מיקרו-מחט</td></tr><tr><td></td><td>אולימפוס</td><td>SZX16</td><td>אפיון מורפולוגיה</td></tr><tr><td>מגיב זיהוי סופר ECL</td><td>Applygen</td><td>P1030</td><td>מד</td></tr><tr><td>מתיחה</td> מערבי <td>Instron</td><td>68SC-05</td><td>בדיקה מכנית</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אלקטרונים שידור</td><td>JEOL</td><td>JEM-2100plus</td><td>אפיון מורפולוגי של אקסוזומים</td></tr><tr><td>Tris חוצץ מלח</td><td>סנגון ביוטק</td><td>JF-A500027-0004</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Beyotime</td><td>ST825</td><td>Western blotting</td></tr><tr><td>Ultracentrifuge</td><td>בקמן</td><td>אופטימה XPN-100</td><td>אקסוזומים מיצוי</td></tr><tr><td>צינור אולטרה-סינון</td><td>Millipore</td><td>UFC910096</td><td>ריכוז אקסוזומים</td></tr><tr><td>תנור ייבוש ואקום</td><td>שנחאי Yiheng Technology</td><td>DZF-6024</td><td>ייצור של מיקרו-מחט</td></tr><tr><td>מערכת סינון ואקום</td><td>Biosharp</td><td>BS-500-XT</td><td>סינון</td></tr></tbody></table>

ייצור ואפיון מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה של אקסוזומים

Fabrication and Characterization of Microneedle Patches for Loading and Delivery of Exosomes

אקסוזומים, כטיפולים ביולוגיים מתפתחים של "הדור הבא" ווקטורים של אספקת תרופות, טומנים בחובם פוטנציאל עצום בתחומים ביו-רפואיים מגוונים, החל ממתן תרופות ורפואה רגנרטיבית ועד אבחון מחלות ואימונותרפיה של גידולים. עם זאת, הפינוי המהיר על ידי הזרקת בולוס מסורתית ויציבות ירודה של אקסוזומים מגבילים את היישום הקליני שלהם. מיקרו-מחטים משמשות כפתרון המאריך את זמן השהייה של האקסוזומים באתר הניהול, ובכך שומר על ריכוז התרופה ומקל על השפעות טיפוליות מתמשכות. בנוסף, microneedles גם יש את היכולת לשמור על יציבות של חומרים ביו-אקטיביים. לכן, אנו מציגים מדבקת מיקרו-מחט לטעינה והעברה של אקסוזומים וחולקים את השיטות, כולל בידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של מדבקות מיקרו-מחטים עמוסות אקסוזומים. מדבקות המיקרו-מחטים יוצרו באמצעות טרהלוז וחומצה היאלורונית כחומרי קצה ופוליוויניל פירולידון כחומר הגיבוי בשיטת יציקה דו-שלבית. המיקרו-מחטים הפגינו חוזק מכני חזק, עם קצוות המסוגלים לעמוד ב-2 N. עור חזיר שימש להדמיית עור אנושי, וקצות המיקרו-מחטים נמסו לחלוטין תוך 60 שניות לאחר ניקוב העור. האקסוזומים ששוחררו מהמיקרו-מחטים הציגו מורפולוגיה, גודל חלקיקים, חלבוני סמן ותפקודים ביולוגיים דומים לאלה של אקסוזומים טריים, מה שאיפשר לתאים הדנדריטיים להיקלט ולקדם את הבשלתם.

כאן, אנו מציגים פרוטוקול לבידוד אקסוזומים, ייצור ואפיון של טלאי exo@MN. איור 1 מדגים את תרשים הזרימה של התהליך לייצור טלאי exo@MN. האקסוזומים עורבבו עם טרהלוז וחומצה היאלורונית, ולאחר מכן הוסיפו את התערובת לתבנית המיקרו-מחטים והצנטריפוגות. תהליך זה הקל על הצטברות האקסוזומים בקצות המחטים, וקידם שחרור מהיר. לאחר הייבוש נוספה תמיסת PVP וצנטריפוגה כדי למלא את התבנית לחלוטין. לאחר הייבוש המלא, התבנית הוסרה כדי לקבל את exo@MN המדבקות. המורפולוגיה של המיקרו-מחטים אופיינה באמצעות מיקרוסקופיה ו-SEM, כפי שניתן לראות באיור 2. הקצוות במדבקה exo@MN הציגו צורה חרוטית מסודרת במערך של 10X10 עם קצות מחטים חדים ושלמים. קצה המחט יכול לעמוד בכוח של 2 N, המאפשר לו לחדור דרך מחסום העור. יתר על כן, עור חזירי שימש כתחליף לעור אנושי כדי לדמות את היישום של מדבקות exo@MN. המדבקות נלחצו על עור החזיר כדי לצפות בזמן השחרור, כאשר קצות המחטים נמסו לחלוטין תוך 60 שניות. exo@MN המדבקות הומסו ב-DPBS ואופיינו, כפי שניתן לראות באיור 3. תמונות TEM צילמו שלפוחיות עם מבנים טיפוסיים בצורת גביע, התואמים את המורפולוגיה של אקסוזומים. התפלגות גודל החלקיקים של תמיסת exo@MN על ידי נת"ע גילתה כי החלקיקים היו מרוכזים בעיקר בטווח של 50-250 ננומטר. עם זאת, היו גם כמה חלקיקים גדולים יותר, אשר ניתן לייחס את תכונות הדבק של חומר HA, גרימת הצטברות exosome. ניתוח WB של חלבוני CD63/Alix בתמיסת exo@MN הראה כי exo@MN מסוגל לשמור חלקית חלבונים של אקסוזומים. הפונקציונליות הביולוגית של אקסוזומים ששוחררו מה-exo@MN אומתה באיור 4, תוך התמקדות בספיגת אקסוזומים על-ידי תאים ובהפעלת תאים דנדריטיים בהשוואה לאקזוזומים טריים. תמונות CLSM אישרו את הספיגה היעילה הן של אקסוזומים טריים והן של אקסוזומים exo@MN על ידי DCs. תמונות מייצגות וסטטיסטיקות פרופורציונליות מציטומטריית זרימה מראות כי האקסוזומים exo@MN הם בעלי פונקציות ביולוגיות המקדמות את ההפעלה של DCs בדומה לאקזוזומים טריים.
<img alt="תרשים ייצור מיקרו-מחטים, תמונת SEM, גרף לחץ-תזוזה, רצף בדיקת חדירה." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> איור 2: אפיון טלאי exo@MN. (A) תמונות מיקרוסקופ סטריאו של exo@MN טלאיים. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. (B) תמונת SEM של exo@MN טלאיים. סרגל קנה מידה = 200 מיקרומטר. (C) פרופילי העומס לעומת התזוזה של תיקון exo@MN. (D) תמונות מיקרוסקופיות של exo@MN טלאים שהוחדרו לעור החזיר בזמנים שונים. סרגל קנה מידה = 400 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig02large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="מיקרוסקופ אלקטרונים של אקסוזומים; גרף התפלגות גודל; כתם מערבי של סמני חלבון." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> איור 3: אפיון אקסוזומים ואקסוזומים טריים ב-exo@MN. (A) מורפולוגיה של אקסוזומים על-ידי TEM. סרגל קנה מידה = 100 ננומטר. (B) התפלגות גודל חלקיקים של אקסוזומים על ידי נת"ע. (C) CD63 ואליקס של אקסוזומים על ידי WB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="תוצאות מיקרוסקופיה אקסוזומית וזרימה ציטומטרית; צביעת תאים, ניתוח זרימה, ביטוי CD80 MHCII." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67109/67109fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> איור 4: בדיקה ביולוגית של אקסוזומים ואקסוזומים טריים ב-exo@MN. (A) תמונות CLSM של אקסוזומים שצולמו על-ידי DCs. סרגל קנה מידה = 10 מיקרומטר. (B) חלקות מייצגות של הפעלת DCs על-ידי ציטומטריית זרימה. (C) כימות אחוז DCs CD11c + CD80 + MHCII+ DC. הנתונים מוצגים כממוצע ± SD (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67109/67109fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

אקסוזומים הם בעלי פוטנציאל קליני משמעותי, אך היישום המעשי שלהם מוגבל בשל פינוי קל in vivo ויציבות ירודה. מיקרו-מחטים מציגות פתרון בכך שהן מאפשרות אספקה מקומית על ידי ניקוב מחסומים פיזיולוגיים ושימור מצב יבש, ובכך נותנות מענה למגבלות מתן האקזוזום ומרחיבות את התועלת הקלינית שלהן.

Exosomes, as emerging &#34;next-generation&#34; biotherapeutics and drug delivery vectors, hold immense potential in diverse biomedical fields, ranging ...

fabrication-characterization-microneedle-patches-for-loading-delivery

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

כאן, אנו מציגים פרוטוקול המתאר תהליך ייצור ללא עובש של המחטים המיקרו-פולימריות על ידי פוטוליתוגרפיה.

ייצור מערך microneedle פולימרית יתוגרפיה

מאמר זה מציג שיטה ייחודית לייצור תבניות מאסטר עם חור אוורור למניעת לכידת אוויר במהלך יציקת פולימר צמיגי, ומאפשרת ייצור מחטי ג'לטין עם קצה חד. על ידי הפחתת נפח היציקה של ג'לטין בעל צמיגות גבוהה, ניתן היה גם לייצר מחטים מיקרו-פירמידליות חלולות עם דפנות דקות.

ייצור תבנית ראשית למחטים מיקרו עם חור אוורור בגודל מיקרון

פרוטוקול זה מתאר ייצור טלאי מחטים מיקרו-מתמוססים הכוללים ננומיצלות α-לקאלבומין טעונות בקפסאיצין. השיטה מציעה גישה כפולה ומינימלית פולשנית להעברה ממוקדת טרנסדרמלית של חומרים ביואקטיביים הידרופוביים לרקמת השומן, מה שמקל על הפחתת שומן מקומית יעילה ועלול להרחיב יישומים בניהול השמנת יתר.

ייצור מדבקות מיקרו-מחט ממוססות טעונות בננומיצלות α-לקטאלבומין להעברת קפסאיצין טרנסדרמל והפחתת רקמת שומן

העבודה הנוכחית שואפת לשמש כמדריך מעשי המאפשר לחוקרים להכין מכשירי DMAP משלהם באמצעות שיטת יציקת הממס, הידועה גם כמיקרו-molding, ולבצע אפיון בסיסי.

מערך מערך מיקרו-מחטים הממוסס המיוצר בטכניקת יציקת ממס ואפיון חיוני של מכשירים ביומדיים מבוססי מיקרו-מחטים

מאמר זה מפרט את הבנייה של חיישן microneedle מבוסס multiplexed. המכשיר מפותח עבור בדגימה באתרו וניתוח אלקטרוכימי של analytes מרובים בצורה מהירה סלקטיבית. אנחנו מדמיינים ברפואה קלינית מחקר ביו משתמש עבור אלה microneedle מבוססי חיישנים.

חיישן הולו Microneedle מבוסס על מרובב דרך העור אלקטרוכימי חישה

עיצבנו bioreactor טעינה מכאני רומן שניתן להחיל מאמץ מכאני uniaxial או biaxial לbiocomposite סחוס לפני ההשתלה לתוך פגם סחוס במפרק.

עיצוב של Bioreactor טוען מכונות Biaxial להנדסת רקמות

ניתן לשלב nanosensors סול ביולוגית pH מגיב לפולי (חומצה לקטית-Co-גליקולית) (PLGA) פיגומי electrospun. פיגומי דיווח עצמיים המיוצרים יכולים לשמש לניטור באתר של תנאי microenvironmental תוך תאי culturing על הפיגום. זה מועיל כמבנה התאי 3D יכול להיות במעקב בזמן אמת מבלי להפריע לניסוי.

פיגומים דיווח עצמי לתרבית תאים 3-Dimensional

שני נוזלים סמוכים העוברים דרך ערוץ מיקרופלואידי מחורץ יכולים להיות מכוונים ליצירת נדן סביב ליבת רב-אופן; ובכך לקבוע הן צורה והן חתך רוחב. פולמור Photoinitiated, כגון כימיה לחץ תיול, מתאים היטב לחיזוק במהירות את נוזל הליבה לתוך מיקרופייבר עם גודל וצורה קבועים מראש.

ייצור מיקרופלואידי של סיבים פולימריים וביוהיברידים עם גודל וצורה מעוצבים מראש

מאמר זה מציג שיטות לייצור ואפיון מערכת אלקטרונית קונפורמלית, דמוית עור ופרוטוקולים לשימוש ביישומים קליניים, במיוחד בניהול פצעים עוריים.

ייצור ואפיון של מערכת אלקטרונית כמו-עור קונפורמי לניהול כמותי, עורית פצע

מטריקס רקמות ספציפיות (ECM) הוא מתווך המפתח תפקוד התא. מאמר זה מתאר שיטות סינתזת קצף טהור הנגזרות ECM ו- microcarriers כי הם יציבים בתרבות ללא צורך crosslinking כימי עבור יישומי 3D מתקדם במודלי תרבית תאים במבחנה או כפי bioscaffolds פרו-רגנרטיבית.

ייצור של תאי מטריקס הנגזרות קצפים Microcarriers כמו תרבית תאי רקמות ספציפיות פלטפורמות משלוח

למדו לייצר ולאפיין מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה יעילה של אקסוזומים. שיטה זו משפרת את היציבות והשימושיות הקלינית של הטיפולים המבוססים על אקסוזומים.

ייצור ואפיון מדבקות מיקרו-מחטים להעמסה ואספקה של אקסוזומים

גלה סרטונים נוספים