Name: זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-08-23T14:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 55 s
Description: חקור מנגנוני נזק DNA במהלך שכפול תאים אנושיים באמצעות בדיקת שביט נייטרלי. הפרוטוקול מאפשר הערכת שבירות DNA ויציבות גנום תחת מתח שכפול.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

אנו מודים לחברי מעבדת Dungrawala על המשוב והמשוב שלהם. עבודה זו מומנה על ידי מענק NIH R35GM137800 ל-HD.

פרוטוקול זה (איור 1) משתמש בעיקר בקווי תאים סרטניים נצמדים של U2OS, אולם הוא ניתן להתאמה למגוון רחב של תאים נצמדים ותרחיפים הגדלים בתרבית רקמות. הפתרונות והמאגרים ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלה 1. הריאגנטים והציוד בהם נעשה שימוש מפורטים בטבלת החומרים.
1. הכנת חומרים
<ol><li>לפני יום הניסוי, הניחו את הבקבוק המסופק עם אגרוז נמס נמוך (1% אגרוז נמס נמוך ב- PBS) באמבט מים חמים למשך 5-10 דקות כדי להבטיח שהאגרוז נמס לחלוטין. הערה: אין לחמם את הבקבוק במיקרוגל.</li>
	<li>לאחר המסה, במהירות aliquot 100 μL של agarose כדי 1.5 מ"ל צינורות צנטריפוגה לפי הצורך ולאחסן את הצינורות ב 4 ° C. האגרוז המוצק ניתן לאחסן ב 4 °C (75 °F) למשך עד שנה.</li>
	<li>ביום הניסוי, הסר את המספר הנדרש של צינורות צנטריפוגות מהאחסון של 4 מעלות צלזיוס. להמיס את agarose על ידי הצבת צינורות בלוק חום או אמבט מים ב 42 °C (75 °F). הערה: הניחו את הצינורות בטמפרטורה של 42°C לפני קצירת התאים כדי להבטיח שהאגרוז נמס לחלוטין לצורך השעיה (שלב 3.7).</li>
	<li>הכינו חיץ ליזיס טרי וחיץ TAE ביום הניסוי ואחסנו אותם בטמפרטורת החדר וב-4°C, בהתאמה, עד שיהיו מוכנים לשימוש. בנוסף, aliquot 1x PBS ב 15 מ"ל צינור חרוטי ומניחים אותו במקרר לשימוש בשלב ההשעיה (שלב 3.5).</li>
	<li>סמנו את זיהויי הדגימות בקצה החלבי של מגלשות השביט הדו-באריות ואחסנו אותן בטמפרטורת החדר עד שיהיו מוכנות לשימוש.</li>
</ol>2. הכנת דגימות
<ol><li>לפני יום הניסוי, זרעו את התאים בצלוחית של 6 בארות ותרבו לילה בטמפרטורה של 37°C עם 5% CO2. עבור תאי U2OS, כ 2-3 x 105 תאים נזרעו עבור כל דגימה. הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את מספרי התאים בהתאם לסוג התא המשמש לניתוחים.</li>
	<li>ביום הניסוי, יש לטפל בתאים בתנאים בהתאם לתכנון הניסוי. כבקרה חיובית להדגמת השראת שבירה תלוית שכפול, יש לטפל בתאים עם CPT של 1 מיקרומטר למשך שעה אחת. CPT הוא מעכב טופואיזומראז-1 הגורם לשברים דו-גדיליים באופן תלוי שכפול14.</li>
</ol>3. השעיית תאים וליזיס
<ol><li>יש לשאוף לתרבית תאים ולשטוף פעמיים עם PBS אחד.</li>
	<li>הוסף 300 μL של טריפסין לכל באר. דוגרים על המנה באינקובטור תרביות רקמה למשך 2-3 דקות. הערה: דגירה ממושכת בטריפסין יכולה לייצר תוצאות מזויפות במהלך ניתוחי שביטים.</li>
	<li>הוסף 700 μL של מדיה תרבית תאים לכל באר. השהה בעדינות והעבר את הדגימות לצינורות צנטריפוגות 1.5 מ"ל. הערה: ספירת תאים בשלב זה מומלצת כדי להשיג את צפיפות התאים המתאימה בשלב 3.6 כדי להפחית את התדירות של זנבות חופפים במהלך הניתוח.</li>
	<li>צנטריפוגה את מתלה התא ב 2400 x גרם במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>לשאוף את התקשורת להשעות מחדש את התאים ב 1 מ"ל של קר 1x PBS.</li>
	<li>חזור על שלב 3.4 ושלב 3.5 פעמיים והשהה מחדש את התאים ב- PBS 1x קר בצפיפות תאים של 2 x 105 תאים למ"ל. הערה: הערכת כדאיות התא בשלב זה מומלצת כדי להבטיח נוכחות מספקת של תאים בני קיימא. מומלץ לפחות 90% כדאיות.</li>
	<li>משעים מחדש 10 μL של תרחיף התא ב 100 μL aliquot של אגרוז מומס, ובאמצעות אותו קצה פיפטה, מערבבים בעדינות ומפזרים את התערובת באופן שווה לתוך באר אחת של המגלשה. חזור על שלב זה עבור כל הדגימות לפי הצורך. הערה: הימנע מהסרת כל aliquots מ 42 מעלות צלזיוס אמבט מים בבת אחת כדי למנוע agarose מלהתמצק. שלב זה צריך להתבצע על ידי אמבט המים, וכל דגימה הוא resuspended ולהפיץ באופן מדורג. הימנעו מהחדרת בועות בעת פיזור האגרוז על המגלשה מכיוון שכיסי האוויר ישפיעו על נדידת זנבות השביט במהלך אלקטרופורזה (שלב 4.5) ויכניסו סדקים בשלב הייבוש (שלב 5.3)</li>
	<li>אחסנו את המגלשות בטמפרטורה של 4°C בחושך למשך 15-20 דקות כדי להבטיח שהאגרוז התמצק לחלוטין (איור 2A).</li>
	<li>מניחים את המגלשות בצנצנות קופלין וטובלים את המגלשות בחיץ ליזיס למשך שעה אחת בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>שטפו את המגלשות פעם אחת עם מאגר TAE קר וטבלו את המגלשות במאגר TAE קר למשך 30 דקות ב-4°C.</li>
</ol>4. אלקטרופורזה
<ol><li>הגדר את התא האלקטרופורטי על משטח שטוח ויישר את המערכת באמצעות ארבע ידיות הפילוס בשולי המנגנון. הכנס חבילות קרות בתא התחתון כדי לשמור על התמיסה קרה במהלך אלקטרופורזה.</li>
	<li>יוצקים כ~ 850 מ"ל של חיץ קר 1x TAE לתוך המנגנון.</li>
	<li>הסר את השקופיות מ 4 ° C והנח אותם על מגש אלקטרופורזה בכיוון הנכון כדי לאפשר נדידה של DNA שבור. הערה: המגש מכיל עשר שקופיות של 2 בארות. מקם את השקופיות במרכז המגש אם הן עובדות עם מספר קטן יותר של דגימות. אם אתה עובד עם מספר אי-זוגי של שקופיות, כלול שקופית ריקה כך שכל באר מכילה 2 שקופיות.</li>
	<li>הנח בעדינות את כיסוי מגש השקופיות שסופק על גבי המגש כדי לכסות את המגשיות. הערה: לצורך פעולה תקינה של המנגנון, נפח מאגר TAE לא צריך להיות נמוך מהמשטח התחתון של שכבת העל ולא יעלה על המשטח העליון של שכבת העל.</li>
	<li>לאחר חיבור הכבלים, הגדר את המתח על 21 V ובצע אלקטרופורזה (1 V / cm) במשך 40 דקות. הערה: ייתכן שיהיה צורך להתאים את זמן האלקטרופורזה בהתאם לסוג התא המשמש לניתוחים. זנבות ארוכים בדגימות לא מטופלות מצביעים על זמן ריצה מוגזם. לעומת זאת, זנבות קצרים בדגימות בקרה חיוביות עשויים לשקף זמן ריצה לא מספיק.</li>
</ol>5. צביעה
<ol><li>לאחר השלמת אלקטרופורזה, להסיר את שקופיות מן המכשיר לטבול אותם בתמיסת משקעים DNA במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השליכו את תמיסת משקעי הדנ"א וטבלו את המגלשות בתמיסת אתנול 70% למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.</li>
	<li>השליכו את תמיסת האתנול 70%. הסירו את המגלשות וייבשו אותן בתנור הכלאה בטמפרטורה של 45°C למשך 30 דקות בחושך (איור 2B). הערה: ניתן להשאיר את המגלשות במקום חשוך ויבש למשך הלילה לצורך שלב הייבוש.</li>
	<li>לדגור על הבארות עם 100 μL של 1x SYBR Green פתרון במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר בחושך.</li>
	<li>דקרו את תמיסת SYBR Green על ידי הטיית המגלשות והסרת העודפים על ידי טפטוף עדין של קצה הבאר עם מגבון ללא סיבים.</li>
	<li>מניחים את המגלשות במגירה ומניחים להן להתייבש למשך 30 דקות.</li>
	<li>המשך בהדמיה של השקפים.</li>
</ol>6. הדמיה וניתוחים
<ol><li>הגדר את המיקרוסקופ למטרות הדמיה. הערה: כל התמונות נרכשו באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. נעשה שימוש בהגדלה של פי 10 עם צמצם מספרי של 0.45 עם זמן חשיפה של 1/40 שניות ורווח של +6dB. מצב הלכידה של 8bit מונוכרום נוצל עם 2 x 2 binning ותיקון איזון שחור.</li>
	<li>הניחו את השקופיות על במת המיקרוסקופ והתחילו בהדמיה באמצעות מסנן FITC. הערה: השתמש תחילה בדגימה שלא טופלה כדי לבדוק את זמן החשיפה. רוב התאים אינם מציגים זנבות שביט מכיוון שהדנ"א קומפקטי יותר. עברו לבאר עם תאים שטופלו ב-CPT ותמונה באותו זמן חשיפה. זנבות שביט בעלי אורך מוגבר ייצפו בדגימה זו עקב נדידת קצוות DNA שבורים.</li>
	<li>קבל תמונות עבור לפחות 100 שביטים בכל דגימה באמצעות אותו זמן חשיפה על פני שלושה עותקים משוכפלים טכניים. הערה: זנבות שביט בקצה הכיסויים נוטים לנדוד באופן לא אחיד ולפעול כחריגים בהתפלגות הדגימה. רוב כוכבי השביט שנלכדו לצורך ניתוח נמצאים קרוב למרכז הכיסוי (איור 3).</li>
	<li>ייצא תמונות וניקוד את כוכבי השביט באופן ידני (באמצעות תמונה J) או באמצעות תוכנת ניקוד שביטים הזמינה באופן חופשי. שביטים הניתנים להבחנה בנפרד ומוכלים במלואם בשדה הראייה נבחרים להבקעה. שביטים חופפים או נראים חלקית אינם נחשבים לניתוחים נוספים (איור 4). הערה: משתמשים יכולים להבקיע כוכבי שביט בתמונה J באמצעות התוסף הבא: https://cometbio.org/index.html. פרטים על ניקוד שביטים באמצעות תוכנת CometScore כלולים באיור 5.</li>
	<li>רגעי זנב העלילה הנרכשים מהניתוחים כעלילות קופסה ושפם המתארות ערכי אחוזון 10-90. בצע בדיקות תקינות כדי לקבוע אם יש להשתמש בבדיקות פרמטריות או לא פרמטריות לניתוחים סטטיסטיים. הערה: ברוב המקרים, בדיקות לא פרמטריות מיושמות באמצעות מבחן מאן-ויטני אם משווים שתי דגימות בלבד או מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן אם משווים שלוש דגימות או יותר.</li>
</ol>

חקירת היקף הפסקות הדנ"א המתרחשות במהלך שכפול הדנ"א 

<ol><li>Olive, P. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+proliferation+as+a+requirement+for+development+of+the+contact+effect+in+Chinese+hamster+v79+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Cell proliferation as a requirement for development of the contact effect in Chinese hamster v79 spheroids.</a> Radiat Res. 117 (1), 79-92 (1989).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P., Durand, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Heterogeneity+in+radiation-induced+DNA+damage+and+repair+in+tumor+and+normal+cells+measured+using+the+%26%2334%3Bcomet%26%2334%3B+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Radiat+Res%22%5BJournal%5D)">Heterogeneity in radiation-induced DNA damage and repair in tumor and normal cells measured using the &#34;comet&#34; assay.</a> Radiat Res. 122 (1), 86-94 (1990).</li>
<li>Singh, N. P., Mccoy, M. T., Tice, R. R., Schneider, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+technique+for+quantitation+of+low+levels+of+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells.</a> Exp Cell Res. 175 (1), 184-191 (1988).</li>
<li>Olive, P. L., Banath, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+method+to+measure+DNA+damage+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A method to measure DNA damage in individual cells.</a> Nat Protoc. 1 (1), 23-29 (2006).</li>
<li>De Lapuente, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay+and+its+applications+in+the+field+of+ecotoxicology%3A+A+mature+tool+that+continues+to+expand+its+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Genet%22%5BJournal%5D)">The comet assay and its applications in the field of ecotoxicology: A mature tool that continues to expand its perspectives.</a> Front Genet. 6, 180(2015).</li>
<li>Azqueta, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+comet+assay+in+human+biomonitoring%3A+An+hcomet+perspective%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res+Rev+Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Application of the comet assay in human biomonitoring: An hcomet perspective.</a> Mutat Res Rev Mutat Res. 783, 108288(2020).</li>
<li>Speit, G., Hartmann, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet+assay%3A+A+sensitive+genotoxicity+test+for+the+detection+of+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet assay: A sensitive genotoxicity test for the detection of DNA damage.</a> Methods Mol Biol. 291, 85-95 (2005).</li>
<li>Collins, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measuring+DNA+modifications+with+the+comet+assay%3A+A+compendium+of+protocols%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Measuring DNA modifications with the comet assay: A compendium of protocols.</a> Nat Protoc. 18 (3), 929-989 (2023).</li>
<li>Rapp, A., Hausmann, M., Greulich, K. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+comet-fish+technique%3A+A+tool+for+detection+of+specific+DNA+damage+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The comet-fish technique: A tool for detection of specific DNA damage and repair.</a> Methods Mol Biol. 291, 107-119 (2005).</li>
<li>Saldivar, J. C., Cortez, D., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+essential+kinase+atr%3A+Ensuring+faithful+duplication+of+a+challenging+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The essential kinase atr: Ensuring faithful duplication of a challenging genome.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (10), 622-636 (2017).</li>
<li>Cimprich, K. A., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr%3A+An+essential+regulator+of+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Atr: An essential regulator of genome integrity.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 9 (8), 616-627 (2008).</li>
<li>Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication-coupled+DNA+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Replication-coupled DNA repair.</a> Mol Cell. 74 (5), 866-876 (2019).</li>
<li>Strumberg, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Conversion+of+topoisomerase+I+cleavage+complexes+on+the+leading+strand+of+ribosomal+DNA+into+5%27-phosphorylated+DNA+double-strand+breaks+by+replication+runoff%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Conversion of topoisomerase I cleavage complexes on the leading strand of ribosomal DNA into 5'-phosphorylated DNA double-strand breaks by replication runoff.</a> Mol Cell Biol. 20 (11), 3977-3987 (2000).</li>
<li>Pommier, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topoisomerase+I+inhibitors%3A+Camptothecins+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Topoisomerase I inhibitors: Camptothecins and beyond.</a> Nat Rev Cancer. 6 (10), 789-802 (2006).</li>
<li>Hsiang, Y. H., Hertzberg, R., Hecht, S., Liu, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Camptothecin+induces+protein-linked+DNA+breaks+via+mammalian+DNA+topoisomerase+i%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Camptothecin induces protein-linked DNA breaks via mammalian DNA topoisomerase i.</a> J Biol Chem. 260 (27), 14873-14878 (1985).</li>
<li>Bryant, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+killing+of+brca2-deficient+tumours+with+inhibitors+of+poly%28adp-ribose%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Specific killing of brca2-deficient tumours with inhibitors of poly(adp-ribose) polymerase.</a> Nature. 434 (7035), 913-917 (2005).</li>
<li>Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+underlying+mechanism+for+the+parp+and+BRCA+synthetic+lethality%3A+Clearing+up+the+misunderstandings%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Oncol%22%5BJournal%5D)">The underlying mechanism for the parp and BRCA synthetic lethality: Clearing up the misunderstandings.</a> Mol Oncol. 5 (4), 387-393 (2011).</li>
<li>Mcglynn, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bromodeoxyuridine+comet+assay%3A+Detection+of+maturation+of+recently+replicated+DNA+in+individual+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">The bromodeoxyuridine comet assay: Detection of maturation of recently replicated DNA in individual cells.</a> Cancer Res. 59 (23), 5912-5916 (1999).</li>
<li>Morocz, M., Gali, H., Rasko, I., Downes, C. S., Haracska, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+cell+analysis+of+human+rad18-dependent+DNA+post-replication+repair+by+alkaline+bromodeoxyuridine+comet+assay%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Single cell analysis of human rad18-dependent DNA post-replication repair by alkaline bromodeoxyuridine comet assay.</a> PLoS One. 8 (8), e70391(2013).</li>
<li>Thakar, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lagging+strand+gap+suppression+connects+BRCA-mediated+fork+protection+to+nucleosome+assembly+through+PCNA-dependent+CAF-1+recycling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Lagging strand gap suppression connects BRCA-mediated fork protection to nucleosome assembly through PCNA-dependent CAF-1 recycling.</a> Nat Commun. 13 (1), 5323(2022).</li>
<li>Vaitsiankova, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parp+inhibition+impedes+the+maturation+of+nascent+DNA+strands+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Parp inhibition impedes the maturation of nascent DNA strands during DNA replication.</a> Nat Struct Mol Biol. 29 (4), 329-338 (2022).</li>
<li>Dungrawala, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radx+promotes+genome+stability+and+modulates+chemosensitivity+by+regulating+rad51+at+replication+forks%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Radx promotes genome stability and modulates chemosensitivity by regulating rad51 at replication forks.</a> Mol Cell. 67 (3), 374-386.e5 (2017).</li>
<li>Townsend, A., Lora, G., Engel, J., Tirado-Class, N., Dungrawala, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dcaf14+promotes+stalled+fork+stability+to+maintain+genome+integrity%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dcaf14 promotes stalled fork stability to maintain genome integrity.</a> Cell Rep. 34 (4), 108669(2021).</li>
<li>Lemacon, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mre11+and+exo1+nucleases+degrade+reversed+forks+and+elicit+mus81-dependent+fork+rescue+in+brca2-deficient+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Mre11 and exo1 nucleases degrade reversed forks and elicit mus81-dependent fork rescue in brca2-deficient cells.</a> Nat Commun. 8 (1), 860(2017).</li>
<li>Leung, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Atr+protects+ongoing+and+newly+assembled+DNA+replication+forks+through+distinct+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Atr protects ongoing and newly assembled DNA replication forks through distinct mechanisms.</a> Cell Rep. 42 (7), 112792(2023).</li>
<li>Bhowmick, R., Mehta, K. P. M., Lerdrup, M., Cortez, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrator+facilitates+RNApii+removal+to+prevent+transcription-replication+collisions+and+genome+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Integrator facilitates RNApii removal to prevent transcription-replication collisions and genome instability.</a> Mol Cell. 83 (13), 2357-2366.e8 (2023).</li>
<li>Mosler, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((R-loop+proximity+proteomics+identifies+a+role+of+ddx41+in+transcription-associated+genomic+instability%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">R-loop proximity proteomics identifies a role of ddx41 in transcription-associated genomic instability.</a> Nat Commun. 12 (1), 7314(2021).</li>
<li>Petermann, E., Orta, M. L., Issaeva, N., Schultz, N., Helleday, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea-stalled+replication+forks+become+progressively+inactivated+and+require+two+different+rad51-mediated+pathways+for+restart+and+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea-stalled replication forks become progressively inactivated and require two different rad51-mediated pathways for restart and repair.</a> Mol Cell. 37 (4), 492-502 (2010).</li>
<li>Sestili, P., Cantoni, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Osmotically+driven+radial+diffusion+of+single-stranded+DNA+fragments+on+an+agarose+bed+as+a+convenient+measure+of+DNA+strand+scission%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Osmotically driven radial diffusion of single-stranded DNA fragments on an agarose bed as a convenient measure of DNA strand scission.</a> Free Radic Biol Med. 26 (7-8), 1019-1026 (1999).</li>
<li>Sestili, P., Martinelli, C., Stocchi, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fast+halo+assay%3A+An+improved+method+to+quantify+genomic+DNA+strand+breakage+at+the+single-cell+level%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">The fast halo assay: An improved method to quantify genomic DNA strand breakage at the single-cell level.</a> Mutat Res. 607 (2), 205-214 (2006).</li>
<li>Gorczyca, W., Gong, J., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+DNA+strand+breaks+in+individual+apoptotic+cells+by+the+in+situ+terminal+deoxynucleotidyl+transferase+and+nick+translation+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of DNA strand breaks in individual apoptotic cells by the in situ terminal deoxynucleotidyl transferase and nick translation assays.</a> Cancer Res. 53 (8), 1945-1951 (1993).</li>
<li>Hanada, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structure-specific+endonuclease+mus81+contributes+to+replication+restart+by+generating+double-strand+DNA+breaks%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structure-specific endonuclease mus81 contributes to replication restart by generating double-strand DNA breaks.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (11), 1096-1104 (2007).</li>
</ol>

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים מתחרים.

פרוטוקול זה מתאר בדיקת NC להערכת הפסקות DNA בתאים אנושיים שעברו שכפול פעיל. הפרוטוקול פשוט יחסית לביצוע, וחוקרים יכולים להתאים אותו בקלות לתנאי pH גבוהים עבור אנליזות אלקליין8. הוא כולל שני שלבים קריטיים, כמתואר בשלבים 3.7 ו-4.5. בשלב 3.7, חיוני להפיץ את האגרוז המומס עם תאים באופן אחיד על פני הבאר כדי למנוע חפיפה של שביטים במהלך הניתוח. ודא כי אגרגטים תאיים מומסים לפני resuspending את התאים באגרוז. מניעת שחרור קצה פיפטה תוך פיזור האגרוז תסייע למזער את הכנסת הבועות. התנאים לאלקטרופורזה חיוניים להשגת נדידת זנב שביט מתאימה לצורך הדמיה וניתוח. חוקרים צריכים לשקול את טבעם של קווי התאים המשמשים לניתוח, מאחר שהיקף נדידת הזנב ואחוז התאים המציגים זנבות שביטים משתנים בין סוגי תאים שונים (איור 9). לכן, מומלץ לקבוע אמפירית את זמן הפעולה של האלקטרופורזה לפני הניסוי.
אם לא נצפו זנבות שביט בדגימות ביקורת חיוביות (תאים שטופלו ב-CPT), יש לאמת את יעילות התרופה במקביל באמצעות גישות חלופיות, כגון צביעה חיסונית עבור סמן הנזק לדנ"א γH2AX. נדידת זנב נרחבת יכולה למנוע ניתוח של אינדוקציה להפסקה. מזעור זמן האלקטרופורזה והערכת המורפולוגיה של התא לפני הניתוח יכולים למנוע קבלת זנבות שביט ארוכים מדי. ייבוש לא מספיק של השקופיות עלול לגרום לתמונות שביט מטושטשות ומעורפלות. ודא שהאגרוז במגלשת השביט מיובש ומשוטח באופן שווה לפני הצביעה בתמיסת SYBR 1x. אם טווח השראת הקיפול צר, ביצוע עקומת מנה-תגובה עם CPT יכול לסייע בקביעת טווח עבודה אופטימלי למטרות ניסוי. יישום עצות אלה לפתרון בעיות יעזור למקסם את התוצאות מבדיקות אלה.
מתודולוגיית בדיקה זו היא חסכונית ורגישה מאוד בהשוואה לטכניקות אחרות המשמשות לחקר השראת שבירת DNA, כגון בדיקת Halo 29,30, בדיקת TUNEL31 ואלקטרופורזה32 של ג'ל שדה פולסים. עם זאת, לטכניקת הבדיקה הנוכחית יש מגבלות מסוימות. הוא אינו מספק מספר מדויק של נגעי DNA אך מציע הערכה יחסית של הצטברות שברים בהשוואה לתאים שלא ניזוקו. בנוסף, הוא אינו יכול להעריך אינדוקציה של שבירה המתרחשת באופן תלוי מחזור התא. כדי למנוע שינויים באינדוקציה של הפסקה עקב הבדלים בהתקדמות מחזור התא, יש לבצע ניתוח מחזור התא על ידי ציטומטריית זרימה במקביל.

בדיקת השביט היא שיטת אלקטרופורזה בג'ל המשמשת לזיהוי שברי DNA ברמת התא הבודד. הוא מסתמך על העיקרון שהפסקות דנ"א פתוחות נודדות בתנאים אלקטרופורטיים, בעוד שדנ"א שלם נשאר סטטי במידה רבה. דנ"א שבור נודד מכיוון שהפסקות גורמות להרפיה של דנ"א מפותל-על, מה שגורם למיקום המרחבי ההדרגתי שלו לכיוון האנודה בתא האלקטרופורטי, מה שגורם למראה דמוי שביט שנצפה על ידי אימונופלואורסנציה 1,2. מידת הנזק לדנ"א נמדדת לאחר מכן על ידי כימות כמות הדנ"א השבור שנדד ביחס לדנ"א הקומפקטי.
שתי שיטות בדיקת השביט הנפוצות ביותר הן בדיקת השביט הבסיסי (AC) ובדיקת השביט הנייטרלי (NC). בדיקת AC מבוצעת בתנאי דנטורינג באמצעות תמיסת pH אלקליין גבוהה, ואילו בדיקת NC מתבצעת בתמיסה עם pH ניטרלי. בדיקות NC ו- AC יכולות לזהות באופן אמין הפסקות DNA המתרחשות בגרעין. עם זאת, הגרסה אלקליין הוא גם יתרון לאיתור אתרים אלקלייםlabile 3. שני הפורמטים של הבדיקה דורשים שימוש בתנאי ליזה כדי להבטיח שהדנ"א נקי מחלבונים לפני אלקטרופורזה.
בדיקה זו היא שיטה פשוטה לאיתור שברי דנ"א ומציעה מספר יתרונות ייחודיים לקביעת נזק לדנ"א תאי. השיטה קלה יחסית להתקנה ודורשת ריאגנטים שניתן להכין במעבדה או לרכוש מספקים מסחריים. כטכניקת רזולוציה של תא יחיד, הבדיקה דורשת מעט מאוד חומר התחלתי. יש לציין כי בדיקת NC יכולה למדוד הפסקות ברגישות גבוהה, המדווחת כמזהה בין 50 ל -10,000 הפסקות לכל תא4. הרבגוניות של טכניקה זו מודגמת על ידי מגוון רחב של יישומים, כולל אקוטוקסיקולוגיה5, ניטור ביולוגי אנושי6, ומחקרי גנוטוקסיות7. ניתן גם להשתמש בבדיקה באופן אמין בין סוגי תאים שונים ולהתאים אותה למבחני תפוקה גבוהה8 ולהערכת הפסקות באזורים גנומיים ספציפיים9. לפיכך, בדיקה זו משמשת כטכניקה מהירה ואמינה לחקר היווצרות הפסקה ברמת התא הבודד.
תהליך שכפול הדנ"א מאותגר כל הזמן על ידי מספר גורמי עקה אנדוגניים ואקסוגניים10,11. עיכוב של replisomes עקב נגעים כאלה יכול לגרום לשברים DNA ולגרום חוסר יציבות גנום מוגברת. הפסקות דנ"א מתעוררות לעתים קרובות גם כמתווכי שכפול כדי להקל על תיקון דנ"א12. בנוסף, מספר תרופות כימותרפיות גורמות לשברים דו-גדיליים תלויי שכפול (DSBs), כגון קמפטוטצין (CPT) 13,14,15 ומעכבי PARP 16,17. לפיכך, בדיקה זו משמשת מתודולוגיה רבת עוצמה לחקר טבעם של נגעי DNA, הערכת העיבוד של מזלגות שכפול, ולחקור את הפוטנציאל הטיפולי של סוכנים מזיקים ל- DNA. התאמות של הבדיקה הכוללות תיוג DNA מסונתז חדש עם BrdU היו שימושיות לחקר פנוטיפים מתח הקשורים לשכפול 18,19,20,21. יש לציין כי בדיקת NC היא שיטה אמינה לחקר השראת שבירת DNA בהקשר של שכפול, כפי שהודגם במחקרים הכוללים אפיון חלבוני מזלג 22,23, ניתוח מתווכי שכפול24,25, וחקירת קונפליקטים של שעתוק ושכפול בתחזוקת גנום26,27. כאן, אנו מתארים פרוטוקול בדיקת NC במטרה לכמת הפסקות DNA במהלך שכפול בתאים אנושיים. פרוטוקול זה יכול להיות מיושם בקלות על ידי חוקרים המעוניינים להעריך נזק הקשור לשכפול מתח במגוון רחב של תאים אנושיים מתחלקים.

<table><tbody><tr><td>1x DPBS</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Camptothecin</td><td>Selleckchem</td><td>S1288</td><td></td></tr><tr><td>שביט LMAgarose (LMA)</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-02</td><td></td></tr><tr><td>CometAssay Electrophoresis System II</td><td>R& D systems</td><td>4250-050-ES</td><td>כולל מיכל אלקטרופורזה, מכסה בטיחות, כבלים, מגשי שקופיות 2/20 בארות וכיסוי מגש החלקה</td></tr><tr><td>תוכנת CometScore</td><td>TriTek</td><td></td><td>קוד פתוח</td></tr><tr><td>CometSlide</td><td>R& מערכות D</td><td>4250-050-03</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, גלוקוז גבוה</td><td>Gibco</td><td>11965092</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>DMSO&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>D128-4</td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי</td><td>Keyence</td><td>BZ-X810</td><td></td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי - פרימיום</td><td>Bio-Techne</td><td>S11150</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Trypsin-EDTA (0.05%), פנול אדום</td><td>Gibco</td><td>25300054</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prism 10.0</td><td>תאי HEK293T GraphPad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>ATCC</td><td>CRL-11268</td><td></td></tr><tr><td>תאי hTERT-RPE-1</td><td>ATCC</td><td>CRL-4000</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyurea</td><td>Millipore מעכב Sigma</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>PARP Olaparib</td><td>Selleckchem</td><td>S8096</td><td></td></tr><tr><td>PowerPac&nbsp;</td><td>FisherSci</td><td>FB300Q</td><td></td></tr><tr><td>צלחת תרבית רקמות סטריליות מטופלות פני השטח</td><td>FisherSci</td><td>FB012927</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green I כתם ג'ל חומצת גרעין (10,000x)</td> <td>FisherSci</td><td>S7567</td><td></td></tr><tr><td>תאי U2OS</td><td>ATCC</td><td>HTB-96</td><td></td></tr><tr><td>UVP&nbsp; חממת היברידיזציה HB-1000</td><td>FisherSci</td><td>UVP95003001</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי הפסקות dna בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

Detection of DNA Breaks in Dividing Human Cells by Neutral Comet Assay

שכפול דנ"א מאותגר כל הזמן על ידי מגוון רחב של גורמי עקה אנדוגניים ואקסוגניים שיכולים לפגוע בדנ"א. נגעים כאלה שנתקלים בהם במהלך שכפול הגנום יכולים לעכב את הרפליזומים ולהמיר מזלגות שכפול לשברים דו-גדיליים. אם לא יתוקנו, שברי דנ"א רעילים אלה עלולים לגרום לסידור מחדש של הכרומוזומליים, מה שמוביל לחוסר יציבות גנומי מוגבר ולסבירות מוגברת לשינוי תאי. בנוסף, תאים סרטניים מפגינים עקה מתמשכת של שכפול, מה שהופך את מיקוד נקודות התורפה של מזלג השכפול בתאי הגידול לאסטרטגיה אטרקטיבית לכימותרפיה. טכניקה רב-תכליתית ורבת עוצמה לחקר הפסקות דנ"א במהלך שכפול היא בדיקת השביט. טכניקת אלקטרופורזה ג'ל זו מזהה באופן אמין את ההשראה והתיקון של שברי DNA ברמת התא הבודד. כאן, מתואר פרוטוקול המאפשר לחוקרים למדוד את מידת הנזק לדנ"א בחלוקה מיטוטית של תאים אנושיים באמצעות חומרים מעכבי מזלג על פני סוגי תאים מרובים. צימוד זה עם ניקוד שביטים אוטומטי מאפשר ניתוח מהיר ומשפר את האמינות בחקר אינדוקציה של הפסקות DNA.

ניתוח של אינדוקציה הפסקה על ידי ריאגנטים מתח שכפול תאי U2OS טופלו ב-DMSO, 4 של mM hydroxyurea (HU), או 100 ננומטר של CPT במשך 4 שעות, ונותחו להצטברות הפסקה על-ידי בדיקת NC (איור 6A). בעוד CPT גורם להפסקות במהלך שלב S על ידי חסימת טופואיזומראז-113, דלדול המושרה על ידי HU של בריכות נוקלאוטידים מעכב מזלגות שכפול המומרים בהדרגה ל-DSBs28. הנתונים מצביעים על כך שחשיפה ל- HU או CPT מפעילה אינדוקציה של שבירה בשלב S, הניתנת לזיהוי על ידי בדיקת NC.
ניתוח של אינדוקציה הפסקה השוואת ליזה בטמפרטורות שונות תאי U2OS שלא טופלו הודגרו בחיץ ליזה בטמפרטורת החדר (RT) או ב-4°C לפני ניתוח השראת השבירה (איור 6B). התוצאות מצביעות על כך שלטמפרטורה שבה מבוצעת הליזיס יש השפעה מינימלית על נדידת הזנבות במבחן.
ניתוח זמני של הפסקות על ידי hydroxyurea (HU) תאי U2OS נותרו ללא טיפול או טופלו ב-4 מילימטר של HU במשך 4 שעות ו-8 שעות לפני ניתוח השראת השבירה על-ידי בדיקת NC (איור 7). התוצאות מצביעות על כך שהשהיה ממושכת של מזלגות שכפול עם HU גורמת לקריסת מזלג שכפול לתוך DSB.
ניתוח תלוי מינון של הפסקות על ידי camptothecin תאי U2OS טופלו במינונים מוגברים של CPT במשך שעה אחת ונקטפו לניתוחי הפסקה באמצעות בדיקת NC (איור 8). בעוד שהצטברות שברים היא מינימלית בתאים שאינם מטופלים ב-CPT, מידת השראת ההפסקה עולה בהדרגה עם העלייה במינון של CPT, ובכך מדגימה את התועלת של הבדיקה בחקר השפעות תלויות מינון על הצטברות הפסקה במהלך שכפול DNA.
ניתוח השוואתי של מעברים בין סוגי תאים מרובים רמות בסיסיות של הפסקות דנ"א הוערכו בשלושה סוגי תאים מיטוטיים שונים – תאי אפיתל פיגמנט ברשתית אימורטליים hTERT (hTERT-RPE-1), וירוס סימיאן 40 (SV40), אנטיגן T גדול המבטא תאי כליה עובריים אנושיים (HEK293T) ותאי אוסטאוסרקומה עצם (U2OS) (איור 9). כל קו תאים הדגים נדידה דיפרנציאלית של מומנטי זנב בהיעדר לחץ שכפול נוסף, אשר עשוי לנבוע מהבדלים בהתפלגות מחזור התא, ארגון הכרומטין או מספר מזלגות השכפול הפעילים. כל סוג תא נחשף גם למיקרומטר אחד של CPT למשך שעה אחת כדי לאמת עלייה בשברי DNA תלויי שכפול.
ניתוח אינדוקציה של הפסקה על ידי בדיקת AC תאי U2OS טופלו ב-DMSO, 4 מילימטר של HU, 1 מיקרומטר של CPT, או 10 מיקרומטר של מעכב PARP (PARPi) אולפריב ונותחו להשראת שבירה (איור 10). התאים טופלו ב- DMSO, HU ו- PARPi במשך שעתיים ואילו הטיפול ב- CPT היה במשך שעה אחת. התוצאות מצביעות על כך שחשיפה ללחץ שכפול גורמת להצטברות שברים, אשר נצפתה על ידי בדיקת AC.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig01.jpg"> איור 1: ייצוג סכמטי של בדיקת NC. (A) מספר התאים הנדרש נזרע יום קודם לכן בצלוחית בת 6 בארות. (B) לאחר טיפולים תרופתיים, התאים עוברים טריפסינזציה ונקצרים ב-PBS קר. (C) התאים מרחפים מחדש בעדינות באגרוז מומס ביחס של 10:1 (10 מיקרוליטר אגרוז עבור 1 מיקרוליטר של תרחיף תאים) באמצעות קצה פיפטה. (D) מתלה התא מועבר לבאר מגלשה באמצעות קצה פיפטה ונמרח באופן אחיד כדי לכסות את פני הבאר לחלוטין באגרוז. (E) לאחר הדגירה ב-4°C, המגלשות שקועות במאגר ליזיס, ואחריו חיץ קר 1x TAE. (ו) הדגימות עוברות אלקטרופורזה באמצעות המכשיר המתאים. (G) לאחר מכן השקפים שקועים בתמיסת משקעים בדנ"א, ואחריה תמיסת אתנול 70%. (H) לאחר הייבוש, הבארות מוכתמות בתמיסת SYBR Green 1x. (I) השקופיות מצולמות באמצעות מיקרוסקופ אפיפלואורסצנטי. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig02.jpg"> איור 2: מבט מהצד על אגרוז על בארות מגלשת שביטים. (A) לאחר הדגירה ב-4°C (שלב 3.8), האגרוז המוצק מופיע כ'בועה' בעלת צורה קמורה. (B) לאחר ייבוש בטמפרטורה של 45°C (שלב 5.3), האגרוז נראה שטוח על הבאר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig03.jpg"> איור 3: הדמיה וניתוח של שביטים. (A) שביטים בתוך המעגל הפנימי של הבאר (מסומנים בכחול) נבחרים לניתוח. שביטים לכיוון הקצה החיצוני של הבאר אינם נכללים בשל רגעי זנב ארוכים באופן חריג, מה שמסמן אותם כחריגים. (B) לפחות 100 שביטים מייצגים נבחרים באופן אקראי מהאזור בצבע כחול. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig04.jpg"> איור 4: תמונה מייצגת של שביטים שהתקבלה מניסוי NC. הפאנל הימני מציג שדה ראייה מייצג של גרעיני SYBR המוכתמים בירוק, ואילו הפאנל השמאלי מדגיש את האזור (קו מתאר ירוק) המשמש להבקעת שביטים. גרעינים גלויים חלקית או מוערמים קרוב זה לזה (קו מתאר אדום, לוח ימני) אינם נכללים בניתוח. כוכבי שביט שנבחרו לניקוד צריכים להיות ניתנים להבחנה בנפרד, מוכלים במלואם בתוך שדה הראייה, ומפגינים עוצמת צביעה אחידה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig05.jpg"> איור 5: ניקוד מייצג של שביטים שהתקבל מבדיקת NC. (A) גרעינים בודדים מתוארים באמצעות תוכנת CometScore. (B) תצוגת הספקטרום המלא (הפאנל השמאלי) מופעלת, והסף (סרגל החיתוך) מותאם להשגת עוצמת אות מיטבית עם רקע מינימלי. האות 'ספקטרום מלא' צריך להתאים לתמונה 'גוון יחיד' (תמונה עליונה, פאנל ימני) ולא לחרוג מקו המתאר (תמונה תחתונה, פאנל ימני). (C) הקו הצהוב האנכי בתיבה מיושר עם מרכז ראש השביט, תוך שימוש בחלק הרחב ביותר של ראש השביט כנקודת ייחוס לעקביות. (D) הניקוד של כל כוכב שביט מנותח מדווח בפינה הימנית העליונה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig06.jpg"> איור 6: ניתוח השראת שבירה על-ידי ריאגנטים של עקת שכפול. (A) תאי U2OS טופלו ב-DMSO, 100 ננומטר קמפטוטצין (CPT), או 4 מילימטר הידרוקסיאוריאה (HU) לפני ניתוח אינדוקציה להפסקה. הגרף המייצג מראה הצטברות שבירה מוגברת בתאים שטופלו ב-CPT או HU. (B) תאי U2OS שלא טופלו נזרעו על שקופיות שביט והודגרו לליזה (שלב 3.9) בטמפרטורת החדר (RT) או ב-4°C כדי להשוות את ההשפעה של טמפרטורת הליזיס. רגעי זנב מהניתוחים משורטטים כחלקות קופסה ושפם המתארות ערכי אחוזון 10-90, כאשר ערכי החציון מיוצגים על ידי קווים אופקיים בתוך הקופסאות. ערכי P חושבו באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן (ערך p חתך של 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig07.jpg"> איור 7: ניתוח זמני של הפסקות המושרות על-ידי הידרוקסיוריאה. תאי U2OS לא טופלו או טופלו ב- 4 mM HU במשך 4 שעות או 8 שעות לפני ניתוח השראת הפסקה. הגרף המייצג מתאר עלייה הדרגתית בהצטברות שברים בתאים שטופלו ב-HU. רגעי זנב מהניתוחים משורטטים כחלקות קופסה ושפם המתארות ערכי אחוזון 10-90, כאשר ערכי החציון מיוצגים על ידי קווים אופקיים בתוך הקופסאות. ערכי P חושבו באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן (ערך p חתך של 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig07large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 8" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig08.jpg"> איור 8: ניתוח תלוי מינון של הפסקות המושרות על-ידי קמפטוטצין. תאי U2OS טופלו ב-DMSO או בריכוזים הולכים וגדלים של CPT (25 ננומטר, 100 ננומטר, 500 ננומטר ו-1 מיקרומטר) במשך שעה אחת לפני ניתוח ההפסקה. רגעי זנב מהניתוחים משורטטים כחלקות קופסה ושפם המתארות ערכי אחוזון 10-90, כאשר ערכי החציון מיוצגים על ידי קווים אופקיים בתוך הקופסאות. הגרף המייצג מראה עלייה תלוית מינון בהפסקות המושרות על ידי CPT. ערכי P חושבו באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן (ערך p חתך של 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig08large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 9" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig09.jpg"> איור 9: ניתוח השוואתי של הפסקות בין סוגי תאים מרובים. תאי hTERT-RPE-1, HEK293T ו-U2OS טופלו ב-DMSO או ב-1 מיקרומטר CPT במשך שעה אחת. הגרף המייצג מראה את ההיקף היחסי של נזק לדנ"א בין שלושת סוגי התאים בנוכחות או היעדר CPT. רגעי זנב מהניתוחים משורטטים כתרשימי קופסה ושפם המתארים ערכי אחוזון 10-90, כאשר ערכי החציון מיוצגים על ידי קווים אופקיים בתוך הקופסאות. ערכי P חושבו באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן (ערך p חתך של 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig09large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 10" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67110/67110fig10.jpg"> איור 10: ניתוח אינדוקציה של שבירה על ידי בדיקת AC. תאי U2OS טופלו ב-DMSO, 4 mM HU, 1 μM CPT או 10 μM PARP inhibitor Olaparib לפני ניתוח אינדוקציה של הפסקה. התאים טופלו במעכבי DMSO, HU ו-PARP במשך שעתיים, בעוד שהטיפול ב-CPT היה במשך שעה אחת. הגרף המייצג מדגים הצטברות שבירה מוגברת בתאים שטופלו במעכבי CPT, HU או PARP. רגעי זנב מהניתוחים משורטטים כחלקות קופסה ושפם המתארות ערכי אחוזון 10-90, כאשר ערכי החציון מיוצגים על ידי קווים אופקיים בתוך הקופסאות. ערכי P חושבו באמצעות מבחן קרוסקל-וואליס עם השוואות מרובות של דאן (ערך p חתך של 0.05). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67110/67110fig10large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td>מגיב</td>
			<td>פתרון עבודה</td>
		</tr><tr><td>חיץ ליזיס</td>
			<td>0.5% SDS, 200 mM Tris-Cl (pH 7.4), 50 mM EDTA</td>
		</tr><tr><td>1x מאגר TAE</td>
			<td>40 mM בסיס טריס, 20 mM חומצה אצטית, 1 mM EDTA ב- pH 8.45</td>
		</tr><tr><td>תמיסת משקעים DNA</td>
			<td>1 מטר אמוניום אצטט, 87% אתנול</td>
		</tr><tr><td>תמיסת אתנול 70%</td>
			<td>70% אתנול במים מזוקקים</td>
		</tr><tr><td>1x פתרון SYBR ירוק</td>
			<td>1x SYBR ירוק ב-1x TAE buffer</td>
		</tr><tr><td>מדיה תרבותית DMEM</td>
			<td>DMEM עם FBS של 7.5%</td>
		</tr><tr><td>מדיה תרבותית DMEM/F12</td>
			<td>DMEM/F12 עם FBS של 7.5%</td>
		</tr><tr><td>פתרון התרעה אלקליין (לשימוש בבדיקת שביט אלקליין)</td>
			<td>200 mM NaOH, 1 mM EDTA ב- pH&gt;13</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: רשימת מאגרים ופתרונות.

פרוטוקול זה נועד לחקור את מידת הנזק לדנ"א המתרחש במהלך שכפול DNA. בתנאים ניטרליים, ניתן להעריך בקלות את השראת הפסקות הדנ"א תוך פרק זמן קצר. בנוסף, הפרוטוקול ניתן להתאמה לסוגי תאים אחרים ולריאגנטים שונים של עקת שכפול.

זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

DNA replication is constantly challenged by a wide variety of endogenous and exogenous stressors that can damage DNA. Such lesions encountered during ...

detection-of-dna-breaks-in-dividing-human-cells-by-neutral-comet-assay

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

הסרטון מדגים את בדיקת השביט לאיתור נזק לדנ"א בעקבות חשיפה לחומרים מזיקים. בתנאים בסיסיים, הדנ"א משתחרר ומתפרק, ועם אלקטרופורזה, הדנ"א שלא ניזוק וניזוק נודד באופן שונה בג'ל האגרוז, ויוצר מבנה בצורת שביט. הדנ"א הנודד לאיטו ללא נזק יוצר את ראש השביט המעגלי, בעוד שמקטעי הדנ"א הפגומים הנודדים במהירות יוצרים את זנב השביט המוארך.

בדיקת שביט לגילוי נזק לדנ"א בתאים

Assay השביט הוא דרך יעילה לאיתור הפסקות בודדות וגדיל כפול, לרבות אתרים אלקלי רופפים וDNA-DNA/DNA-protein-קישורי צלב שעל ה-DNA בכל התאים, כוללים נוירונים ביפוקמפוס. השיטה מנצלת את הגירת ההפרש של ה-DNA בשדה חשמלי בשל הבדלים בכמות הניזק לדנ"א.

Assaying ניזק לדנ&quot;א בנוירונים ביפוקמפוס שימוש Assay השביט

אנו מתארים כאן פלטפורמה שמאפשרת זיהוי assay שביט של נזק לדנ"א עם תפוקה חסרת תקדים. דפוסי מכשיר תאי יונקים לmicroarray ומאפשר עיבוד מקביל של 96 דגימות. הגישה מאפשרת ניתוח של קינטיקה הנזק לדנ"א רמת בסיס, נזק לדנ"א הנגרם על ידי חשיפה ותיקון DNA.

CometChip: תפוקה גבוהה 96-ובכן פלטפורמה למדידת נזק לדנ&quot;א בתאי Microarrayed אדם

שביט וזמינותו היא שיטה יעילה לאיתור נזק לדנ א כולל יחיד, כפול גדילי ה-DNA שובר. אנו מתארים שביט אלקליין ונייטרלי מבחני למדוד נזק לדנ א בתאים סרטניים כדי להעריך את השפעת טיפולי כימותרפיה.

הערכת במבחנה נזק לדנ א שימוש Assay שביט

פרוטוקול זה מתאר מספר הליכים להכנת דגימות רקמה באיכות גבוהה קפואה בזמן נקרוזה לשימוש במערכת שביט להעריך נזק DNA: 1) רקמות טחון, 2) מגורד תאים אפיתל ממערכת העיכול, ו 3) לקוביות רקמה דגימות, הדורשות הומוגון באמצעות מכשיר משתמש ברקמה.

שימוש ברקמות קפואות בתוך שיטת שביט להערכת נזק לדנ א

כאן אנו מתארים שני שינויים של בדיקת סיבי הדנ"א כדי לחקור פערי דנ"א חד-גדיליים בשכפול דנ"א לאחר אינדוקציה של נגע. בדיקת הסיבים S1 מאפשרת זיהוי של פערים לאחר שכפול באמצעות אנדונוקלאז S1 ספציפי ל-SSDNA, בעוד שבדיקת מילוי הפער מאפשרת הדמיה וכימות של תיקון פערים.

זיהוי של פערים לאחר שכפול הצטברות ותיקון בתאים אנושיים באמצעות בדיקת סיבי DNA

בדיקת השביט היא אמצעי פופולרי לאיתור נזק לדנ"א. מחקר זה מתאר גישה להפעלת שקופיות בגרסאות מייצגות של בדיקת השביט. גישה זו הגדילה משמעותית את מספר הדגימות תוך הפחתת זמן הריצה של הבדיקה, מספר מניפולציות השקופיות והסיכון לפגיעה בג'לים.

גישת בדיקת שביט בתפוקה גבוהה להערכת נזק לדנ"א תאי

פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה לכימות ההבדל בנזק ל-DNA הנגרם על ידי מעכבים מסוג I וסוג II בתאים מוטנטיים מסוג FLT3 באמצעות יישום מבחן השביט.

בדיקת שביט לכימות נזק ל-DNA בתאי 32D המבטאים מוטציה FLT3 לאחר חשיפה למעכבי FLT3 מסוג I ו-II

"ה-DNA" חיישנים, reagentless, biosensors אלקטרוכימיים כי ביצועים טובים גם כאשר תיגר ישירות בדם מטריצות מורכבות אחרות, הותאמו זיהוי של מגוון רחב של חומצת גרעין חלבון, ו analytes מולקולה קטנה. כאן אנו מציגים הליך כללי עבור ייצור ושימוש של חיישנים כאלה.

המצאה של אלקטרוכימי-DNA Biosensors לגילוי Reagentless של חומצות, חלבונים ומולקולות קטנות גרעין

אנו מדגימים את הרכבה ואת היישום של התקן מולקולרי בקנה מידה מופעל על ידי חלבון topoisomerase. לבנות הוא חיישן ביולוגי מולקולרי אשר תוויות שני סוגים עיקריים של הפסקות DNA בסעיפים רקמה על ידי מצרפת שניים fluorophores שונים למטרותיהם.

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

חקור מנגנוני נזק DNA במהלך שכפול תאים אנושיים באמצעות בדיקת שביט נייטרלי. הפרוטוקול מאפשר הערכת שבירות DNA ויציבות גנום תחת מתח שכפול.

זיהוי הפסקות DNA בחלוקת תאים אנושיים על ידי בדיקת שביט נייטרלי

גלה סרטונים נוספים