Name: חיקוי קרום מרתף ננופיברילרי עשוי ממשי עכביש פונקציונלי רקומביננטי בתוספות תרבית רקמה בהתאמה אישית (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-11-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: למדו שימוש בקרומי FN-silk ממשי עכביש פונקציונלי לתרבית תאי קרטינוציטים אנושיים. שיטה זו מחקה את קרום המרתף הטבעי ומשפרת את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים תוך-מעבדתיים לחקר תרופות והנדסת רקמות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>היווצרות וחיבור של קרומי משי FN לתוספות של תרבית תאים

<ol><li>Kumar, P., Kedaria, D., Mahapatra, C., Mohandas, M., Chatterjee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+designer+cell+culture+insert+with+a+nanofibrous+membrane+toward+engineering+an+epithelial+tissue+model+validated+by+cellular+nanomechanics%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale+Adv%22%5BJournal%5D)">A designer cell culture insert with a nanofibrous membrane toward engineering an epithelial tissue model validated by cellular nanomechanics.</a> Nanoscale Adv. 3 (16), 4714-4725 (2021).</li>
<li>Wang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultrathin+and+handleable+nanofibrous+net+as+a+novel+biomimetic+basement+membrane+material+for+endothelial+barrier+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+Surf+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Ultrathin and handleable nanofibrous net as a novel biomimetic basement membrane material for endothelial barrier formation.</a> Colloids Surf B Biointerfaces. 219, 112775(2022).</li>
<li>Jain, P., Rauer, S. B., Möller, M., Singh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimicking+the+natural+basement+membrane+for+advanced+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Mimicking the natural basement membrane for advanced tissue engineering.</a> Biomacromolecules. 23 (8), 3081-3103 (2022).</li>
<li>Eom, S., Park, S. M., Han, S. J., Kim, J. W., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+fabrication+of+a+tunable+nanofibrous+well+insert+via+electrolyte-assisted+electrospinning%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Advances%22%5BJournal%5D)">One-step fabrication of a tunable nanofibrous well insert via electrolyte-assisted electrospinning.</a> RSC Advances. 7 (61), 38300-38306 (2017).</li>
<li>Kim, D., Eom, S., Park, S. M., Hong, H., Kim, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+collagen+gel-coated%2C+aligned+nanofiber+membrane+for+enhanced+endothelial+barrier+function%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A collagen gel-coated, aligned nanofiber membrane for enhanced endothelial barrier function.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-11 (2019).</li>
<li>Ebrahim, N. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+honeycomb+film+membranes+enhance+endothelial+barrier+integrity+in+human+vascular+wall+bilayer+model+compared+to+standard+track-etched+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Porous honeycomb film membranes enhance endothelial barrier integrity in human vascular wall bilayer model compared to standard track-etched membranes.</a> J Biomed Mater Res A. 111 (5), 701-713 (2023).</li>
<li>Zakharova, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transwell-integrated+2+%C2%B5m+thick+transparent+polydimethylsiloxane+membranes+with+controlled+pore+sizes+and+distribution+to+model+the+blood-brain+barrier%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials+Technologies%22%5BJournal%5D)">Transwell-integrated 2 µm thick transparent polydimethylsiloxane membranes with controlled pore sizes and distribution to model the blood-brain barrier.</a> Advanced Materials Technologies. 6 (12), 2100138(2021).</li>
<li>Park, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+elastic%2C+porous%2C+and+ultrathin+co-culture+membranes+to+control+the+endothelial+barrier+function+via+cell+alignment%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Use of elastic, porous, and ultrathin co-culture membranes to control the endothelial barrier function via cell alignment.</a> Advanced Functional Materials. 31 (9), 2008172(2021).</li>
<li>Youn, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Facile+and+adhesive-free+method+for+bonding+nanofiber+membrane+onto+thermoplastic+polystyrene+substrate+to+fabricate+3D+cell+culture+platforms%5BTitle%5D)+AND+%22Materials+Today+Bio%22%5BJournal%5D)">Facile and adhesive-free method for bonding nanofiber membrane onto thermoplastic polystyrene substrate to fabricate 3D cell culture platforms.</a> Materials Today Bio. 20, 100648(2023).</li>
<li>Liu, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrohydrodynamic+jet-printed+ultrathin+polycaprolactone+scaffolds+mimicking+Bruch%E2%80%99s+membrane+for+retinal+pigment+epithelial+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Bioprint%22%5BJournal%5D)">Electrohydrodynamic jet-printed ultrathin polycaprolactone scaffolds mimicking Bruch’s membrane for retinal pigment epithelial tissue engineering.</a> Int J Bioprint. 8 (3), 550(2022).</li>
<li>Dogan, A. A., Dufva, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Customized+3D-printed+stackable+cell+culture+inserts+tailored+with+bioactive+membranes%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Customized 3D-printed stackable cell culture inserts tailored with bioactive membranes.</a> Sci Rep. 12 (1), 1-12 (2022).</li>
<li>Rohde, F., Danz, K., Jung, N., Wagner, S., Windbergs, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+scaffolds+as+cell+culture+substrates+for+the+cultivation+of+an+in+vitro+blood%E2%80%93brain+barrier+model+using+human+induced+pluripotent+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Pharmaceutics%22%5BJournal%5D)">Electrospun scaffolds as cell culture substrates for the cultivation of an in vitro blood–brain barrier model using human induced pluripotent stem cells.</a> Pharmaceutics. 14 (6), 1308(2022).</li>
<li>Slater, S. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in+vitro+model+of+the+glomerular+capillary+wall+using+electrospun+collagen+nanofibres+in+a+bioartificial+composite+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">An in vitro model of the glomerular capillary wall using electrospun collagen nanofibres in a bioartificial composite basement membrane.</a> PLoS ONE. 6 (6), e20802(2011).</li>
<li>Harris, T. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Utilizing+recombinant+spider+silk+proteins+to+develop+a+synthetic+Bruch%E2%80%99s+membrane+for+modeling+the+retinal+pigment+epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Utilizing recombinant spider silk proteins to develop a synthetic Bruch’s membrane for modeling the retinal pigment epithelium.</a> ACS Biomater Sci Eng. 5 (8), 4023-4036 (2019).</li>
<li>Hjelm, L. C., Hedhammar, M., Löfblom, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+blood%E2%80%93brain+barrier+model+based+on+recombinant+spider+silk+protein+nanomembranes+for+evaluation+of+transcytosis+capability+of+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">In blood–brain barrier model based on recombinant spider silk protein nanomembranes for evaluation of transcytosis capability of biomolecules.</a> Biochem Biophys Res Commun. 669, 77-84 (2023).</li>
<li>Gustafsson, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+forms+tough+and+elastic+nanomembranes+that+are+protein-permeable+and+support+cell+attachment+and+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Functional+Materials%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk forms tough and elastic nanomembranes that are protein-permeable and support cell attachment and growth.</a> Advanced Functional Materials. 30 (40), 2002982(2020).</li>
<li>Tasiopoulos, C. P., Gustafsson, L., Van Der Wijngaart, W., Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibrillar+nanomembranes+of+recombinant+spider+silk+protein+support+cell+co-culture+in+an+in+vitro+blood+vessel+wall+model%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Fibrillar nanomembranes of recombinant spider silk protein support cell co-culture in an in vitro blood vessel wall model.</a> ACS Biomater Sci Eng. 7 (7), 3332-3339 (2021).</li>
<li>Marino, A., Baronio, M., Buratti, U., Mele, E., Ciofani, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+optically+transparent+cellulose+acetate+scaffolds+for+biomimetic+blood-brain+barrier+in+vitro+models%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Bioeng+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Porous optically transparent cellulose acetate scaffolds for biomimetic blood-brain barrier in vitro models.</a> Front Bioeng Biotechnol. 9, 630063(2021).</li>
<li>Schramm, R. A., Koslow, M. H., Nelson, D. A., Larsen, M., Castracane, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+impedance+biosensor+for+measurement+of+trans-epithelial+resistance+in+cells+cultured+on+nanofiber+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors%22%5BJournal%5D)">A novel impedance biosensor for measurement of trans-epithelial resistance in cells cultured on nanofiber scaffolds.</a> Biosensors. 7 (3), 35(2017).</li>
<li>Qi, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+a+human+iPSC-+and+nanofiber-based+microphysiological+blood-brain+barrier+system%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Establishment of a human iPSC- and nanofiber-based microphysiological blood-brain barrier system.</a> ACS Appl Mater Interfaces. 10 (26), 21825-21835 (2018).</li>
<li>Rickabaugh, E., Weatherston, D., Harris, T. I., Jones, J. A., Vargis, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+a+biomimetic+in+vitro+model+of+Bruch%E2%80%99s+membrane+using+hagfish+slime+intermediate+filament+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Biomater+Sci+Eng%22%5BJournal%5D)">Engineering a biomimetic in vitro model of Bruch’s membrane using hagfish slime intermediate filament proteins.</a> ACS Biomater Sci Eng. 9 (8), 5051-5061 (2023).</li>
<li>Choi, J. W., Youn, J., Kim, D. S., Park, T. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS-derived+blood-brain+barrier+model+exhibiting+enhanced+barrier+properties+empowered+by+engineered+basement+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Human iPS-derived blood-brain barrier model exhibiting enhanced barrier properties empowered by engineered basement membrane.</a> Biomaterials. 293, 121983(2023).</li>
<li>Widhe, M., Shalaly, N. D., Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+fibronectin+mimetic+motif+improves+integrin+mediated+cell+biding+to+recombinant+spider+silk+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">A fibronectin mimetic motif improves integrin mediated cell biding to recombinant spider silk matrices.</a> Biomaterials. 74, 256-266 (2016).</li>
<li>Johansson, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+of+functionalized+silk+together+with+cells+to+obtain+proliferative+3D+cultures+integrated+in+a+network+of+ECM-like+microfibers%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Assembly of functionalized silk together with cells to obtain proliferative 3D cultures integrated in a network of ECM-like microfibers.</a> Sci Rep. 9 (1), 1-13 (2019).</li>
<li>Widhe, M., Johansson, U., Hillerdahl, C. O., Hedhammar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+spider+silk+with+cell+binding+motifs+for+specific+adherence+of+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Recombinant spider silk with cell binding motifs for specific adherence of cells.</a> Biomaterials. 34 (33), 8223-8224 (2013).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td><חזק>כימיקלים</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>Invitrogen; Thermo Fisher Scientific</td><td>A-21121</td><td>עז נגד עכברים, דילול 1:500</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 488 Phalloidin</td><td>Invitrogen; Thermo Fisher Scientific</td><td>A12379</td><td>דילול 1:400</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-ZO-1 (1A12)</td><td>Invitrogen; תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>&nbsp; 33-9100</td><td>עכבר אנטי-אנושי, חד-שבטי, דילול 1:200</td></tr><tr><td>דקסטרן, Alexa Fluor 680; 3,000 מגה-וואט,</td><td>אניוני אינוויטרוגן; Thermo Fisher Scientific</td><td>D34681</td><td>מדולל 2,5% (w/v) ב-200 ul של מדיום תרבית</td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td><td>31330095</td><td>בתוספת 5% v/v FBS ו-1% v/v פניצילין-סטרפטומיצין</td></tr><tr><td>אתנול&nbsp;</td><td>Solveco</td><td>1326</td><td>70% (CAS-no 64-17-5)</td></tr><tr><td>סרום בקר עוברי, מוסמך, מושבת בחום, ארצות הברית</td><td>Gibco; Thermo Fisher Scientific</td><td>16140071</td><td></td></tr><tr><td>FN-silk</td><td>Spiber technologies AB</td><td></td><td>Store ב-80 מעלות; C</td></tr><tr><td>איזופרופנול, מגיב אנליטי EMPARTA ACS</td><td>Supelco</td><td>1096342511</td><td>&ge; 99.5% (CAS-no 67-63-0)</td></tr><tr><td>ערכת חי/מת חי/ציטוטוקסיות</td><td>Invitrogen; תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>PBS&nbsp;</td><td>הסוכנות הווטרינרית השוודית / וטרינר סטטנס; rmedicinska anstalt</td><td>992420</td><td>&nbsp; ללא Ca ו-Mg,</td></tr><tr><td>פניצילין-סטרפטומיצין מסונן (10,000 U/mL)</td><td>ג'יבקו; תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>11548876</td><td></td></tr><tr><td><חזק>חומר</חזק></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>דנטלי LT שקוף שרף</td><td>Denthouse</td><td>&nbsp;#DLCL-01</td><td></td></tr><tr><td>תאי HaCaT</td><td>CLS</td><td>300493</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cell-Culture Treated Multidish 24 בארות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10604903</td><td></td></tr><tr><td>Nunc Cell-Culture Assisted Multidish 48- וול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10644901</td><td></td></tr><tr><td>הכנסת TC, לצלחות 24 בארות, PET, שקוף</td><td>Sarstedt</td><td>83.3932.041</td><td>גודל נקבוביות: 0.4 ומיקרו; m</td></tr><tr><td>מוסיף תרבית תאים ThinCert, קרום שקוף (PET)</td> <td>Greiner</td><td>662640</td><td>גודל נקבוביות: 0.4 ומיקרו; מד m</td></tr><tr><td>EQUIPMENT</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>EVOM עם מקלות אכילה&nbsp;</td><td>World Precision Instruments (WPI) גרמניה, GMBH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form 3B</td><td>FormLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form Wash</td><td>FormLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Form Cure</td><td>FormLabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isotemp לשימוש כללי אמבטיות מים דלוקס</td><td>Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך Eclipse Ti</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך DMI6000 B</td><td>מכסה</td> הזרימה הלמינארי של Leica <td></td><td></td></tr><tr><td>Ninosafe, Class II</td><td>Labolutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Midi CO2&nbsp; אינקובטור, 40 ליטר</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

חיקוי קרום מרתף ננופיברילרי עשוי ממשי עכביש פונקציונלי רקומביננטי בתוספות תרבית רקמה בהתאמה אישית

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

תצלומים מייצגים של התוספות תצלומים של התוספות לפני ואחרי השחרור מפלטפורמת ההדפסה מוצגים באיור 3A,B. תמונה של תוספת מוגמרת שממנה הוסרה התמיכה מוצגת באיור 3C. התוצאה היא קבוצה של תוספות מודפסות בתלת-ממד, מוכנות לעיקור ולשימוש לאחר מכן.
הרמה וטיפול בקרומי משי FN סכמה כללית של היווצרות קרום משי FN והרמה ידנית מוצגת באיור 1. התוצאה היא מספר תוספות עם קרום משי FN מחובר. כדי להבטיח את שיעור ההצלחה הגבוה ביותר עם הרמת קרומים שלמים, יש לעקוב במדויק אחר השלבים המתוארים בפרוטוקול. איור 4 מראה תצלומים של קרום כשהוא שלם (A,D) ולאחר קריעה (B,E,F). ניתן להמחיש את הקרע באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר (איור 4E,F) ו/או באמצעות טפטוף של נוזל דרך הממברנה (איור 4B). חשוב להרים ולהוריד את התוספות בניצב לממברנה, כדי לוודא שהקרום נצמד באופן שווה ונמתח מתחת לתוספות. ניתן לראות הידבקות קרום באופן חזותי, כפי שמוצג באיור 4A. אם מורידים את האינסרט לפי ההוראות ורמות הנוזלים נשמרות כפי שמוצג באיור 2, הממברנה נשארת מחוברת לאינסרט לאורך תקופות תרבית ארוכות.
כאן, חיבור הממברנה לעלון מאומת על ידי ביצוע ניסוי חלחול 15,16,17 על ממברנות שהוחזקו בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים במשך 9 ימים. בקצרה, כאשר מוסיפים מולקולה פלואורסצנטית על גבי הממברנה ומודדים את האות בתמיסה למטה, פרופיל החדירה של קרומי המשי עוקב אחר זה של תוספת תרבית רקמה זמינה מסחרית (איור 4C), מה שמראה שאין דליפה במשך 36 שעות של חלחול ומציין שהקרום נשאר שלם וגם מחובר לעלון. ניסויים דומים נערכו בעבר עם תאים שנזרעו עלאחד 15 או שני הצדדים של קרום המשי17. עוצמת ההדבקה הודגמה בעבר באמצעות כניסת מאקרו16 ומבחני אינפלציה16,17. במסגרת ניסויי הזחת המאקרו, נעשה שימוש בחרט כדי למתוח את הממברנה, אשר נקרעה בכוח של 1.4 mN, תוך שהיא נשארת מחוברת לאינפרט16.
יש לציין כי אחוזי ההצלחה של הרמת קרומים שלמים קשורים לחומר ולטיפול שלאחר התוספות. בפרוטוקול זה, 95% מהקרומים שהורמו באמצעות תוספות שהודפסו עם השרף שבו נעשה שימוש התאימו לזריעת תאים, בהשוואה ל-74% כאשר נעשה שימוש בשרף דומה במקום. אנו משערים כי ההיצמדות נעזרת באינטראקציות הידרופוביות ובכוחות ואן דר ואלס, ולכן שינוי תכונות החומר משנה את עוצמת ההדבקה. זה נתמך עוד יותר על ידי העובדה כי הממברנות אינן נצמדות היטב לחומרים הידרופיליים (נתונים לא מוצגים).
תוצאות מייצגות של תרבית תאים על קרומי משי FN תמונות אימונופלואורסצנטיות של קרטינוציטים (HaCaT) בתרבית בצד האפי או הבסיסי של הממברנה מוצגות באיור 5. התאים שהודבקו (איור 5D.i) נצפו מכסים באופן שווה את אזור התרבית ביום 1 בזמן שהם רוכשים את המורפולוגיה הטיפוסית של אבן מרוצפת קרטינוציטים (איור 5A.i-B.i). ביום השלישי, הקרטינוציטים יצרו שכבה קונפלואנטית (איור 5A.ii-B.ii) ויצרו רשת של צמתים הדוקים (איור 5D.ii), מה שמצביע על כך שהם מניחים תפקודי אפיתל פיזיולוגיים. הרמות הגבוהות של כדאיות התא שהושגו במטריצות משי FN 15,17,23,24 הוצגו גם במערך תרבית החדרת קרום המשי המתואר כאן. לאחר 3 ימים בתרבית, קרטינוציטים נשארו בני קיימא מאוד (איור 5C.i-iv). בנוסף, לא נצפה הבדל בפיזור התאים המתים בין המרכז (איור 5C.i-ii) לבין הפריפריה של הממברנה (איור 5C.iii-iv), מה שלא חשף השפעה משמעותית של חומר ההחדרה על הכדאיות של HaCaT. בסך הכל, מערכת תרבית החדרת המשי הציעה כדאיות קרטינוציטים דומה (איור 5i-ii, v-vi) אם לא משופרת (איור 5iii-iv, vii-viii) עם זו של מערכת מסחרית להחדרת קרום PET.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig01.jpg"> איור 1: איור מפורט של היווצרות והרמה של קרומי משי FN יחידים. (A) מלאו כל באר שנייה (הימנעו מהשורה/עמודה החיצונית) בצלחת בת 48 בארות עם תמיסת חלבון משי FN, כאשר (B) היא מתכנסת בעצמה לקרום בממשק נוזל-אוויר למשך הלילה. (C) תפוס את האינסרט עם זוג פינצטות והורד אותו באיטיות אל הממברנה באמצעות קווי העזר (D,E) שעל העלון המודפס בתלת-ממד כדי לוודא שהאינסרט מונמך בניצב לממברנה. הגדלה של הדבקת קרום המשי מראה חתך רוחב של האינסרט (F) ממש מעל הממברנה ו-(G) כשהוא נוגע בקרום המשי. במהלך תקופת הדגירה של 2 שעות, (H) קרום המשי מתחבר באופן ספונטני לתוספת, ואז (I) משמש להרמת הממברנה מהממשק. קיצורים: FN = פיברונקטין PBS = מלח חוצץ פוספט. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig02.jpg"> איור 2: איור מפורט המראה כיצד לטפל בקרום משי FN לאחר הרמת אותו מלוח היצירה. (A) התוספת (אפור) עם הממברנה (סגול) מיד לאחר ההרמה. (B) נוזל (כחול) מתווסף בצד האפי של הממברנה, אשר לאחר מכן ממוקם בלוח (C) 24 בארות שבו החלק הארוך יותר של זרועות הכנס תלוי על הקירות, והחלק הקצר יותר שומר על האינסרט ממוקם במרכז הצלחת. (D) מוסיפים נוזל לבאר, ומבטיחים שרמת הנוזל מאוזנת ומעל קצה הממברנה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig03.jpg"> איור 3: תצלומים של התוספות שהודפסו בתלת-ממד. (A) התוספות מיד לאחר הוצאתן ממדפסת התלת-ממד, עדיין מחוברות ללוח הבנייה. (B) תוספת אחת לאחר הוצאתה מלוח הבנייה, לפני שבירת התמיכות. (ג) תוספת אחת לאחר הסרת התמיכות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig04.jpg"> איור 4: קרום משי FN לפני ואחרי שבירה. (A) תצלום של קרום שלם הנושא 200 מיקרוליטר PBS צבוע (כחול) בצד האפיקאלי. קצה הממברנה הכרוך סביב העלון מסומן בחצים לבנים. (B) צילום של אותו קרום לאחר הקריעה. PBS דולף דרך הממברנה. (C) תרשים המראה חלחול של מולקולה פלואורסצנטית של 3 kDa במשך 36 שעות דרך קרום משי או קרום PET זמין מסחרית שנשמר בתנאי תרבית תאים סטנדרטיים במשך 9 ימים. (D) תמונת שדה בהיר של קרום לפני קריעה. (E) תמונת שדה בהיר של אותו קרום לאחר קריעה. האזור הפגום מסומן על-ידי קו המתאר המקווקו הכחול. (F) תצוגה מוגדלת של הקרע המוצג ב-D עם קצה הקרום הקרוע המסומן בחצים כחולים. פסי קנה מידה = 1 מ"מ (D,E), 200 מיקרומטר (F). קיצורים: FN = פיברונקטין PBS = מלח חוצץ פוספט; PET = פולי(אתילן טרפתלט). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67116/67116fig05.jpg"> איור 5: קרטינוציטים (HaCaT) שגודלו בתרבית על קרום משי FN. ביום הראשון, קרטינוציטים נצמדו וכיסו באופן שווה את שטח הפנים של הממברנה בצד האפי (A.i) או הבסיסי (B.i) (פאלואדין, ירוק). ביום השלישי, נוצרת חד-שכבה מתמזגת בצד האפי (A.ii) או הבסיסי (B.ii) (פאלואדין, ירוק). (C) הערכת כדאיות התא על קרום המשי (i-iv) בהשוואה לקרום PET מסחרי (v-viii) במרכז (i, ii, v, vi) ובפריפריה (iii, iv, vii, viii) של שכבת התא. תאים חיים מוצגים בירוק (i, iii, v, vii) ותאים מתים באדום (i, iii, v, vii) או לבן (ii, iv, vi, viii). הקו המקווקו מסמן את שלב החדרת הממברנה. (D) זום בפירוט, (i) ציון (חיצים לבנים) היצמדות תאים לקרום (phalloidin, לבן) ו-(ii) רשת צומת הדוקה שנוצרה לאחר 3 ימים בתרבית (ZO-1, לבן). פסי קנה מידה = 1 מ"מ (שורה עליונה: A,B), 100 מיקרומטר (שורה תחתונה: A,B,Ci, ii, v, vi), 500 מיקרומטר (C iii, iv, vii, viii), 50 מיקרומטר (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
טבלה 1: סקירה כללית של עבודות קודמות שבהן שולבו ממברנות בתוספות תרבית תאים. קיצורים: PCL = polycaprolactone; PEGDA = פולי (אתילן גליקול) דיאקרילט; PLGA = פולי(חומצה לקטית-קו-גליקולית); PDMS = Polydimethylsiloxane; PC = פוליקרבונט; RSS = חלבון משי עכביש רקומביננטי; PLCL = פולי(לקטיד-קו-קפרולקטון); RHSIF = רקומביננטי דג רפש רפש חלבוני נימה ביניים <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Table%20I.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת טבלה זו.</a>
טבלה 2: סקירה כללית של עבודות קודמות המסכמות את סוגי התאים השונים שגודלו בתרבית על קרומי משי FN. FN-4repCT (FN-silk) היא גרסה קצרה של משי הדראגליין של Euprosthenops australis, אשר מיוצר באופן רקומביננטי ומתפקד עם מוטיב RGD מפיברונקטין ברמה גנטית. חלבון זה משמש בכל המקרים המסוכמים כאן. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Table%20II.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
טבלה 3: פתרון בעיות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Talble%20III.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
קובץ משלים 1: קובץ עיצוב ( .stl) להדפסת תלת מימד של התוספות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/JoVe_Silk_Insert.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
קובץ משלים 2: פרוטוקול להדפסה, לאחר טיפול ועיקור בעת שימוש במדפסת ובשרף המפורטים בטבלת החומרים. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Supplemental%20File%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים S1: סכמטי של התבנית המוצעת לשימוש בעת הנחת תמיסת משי FN בלוח 48 בארות. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67116/67116_Supplemental%20Fig%20S1.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...

nanofibrillar-basement-membrane-mimic-made-recombinant-functionalized

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

סרטי משי הם קבוצה חדשה של biomaterials בקלות להתאמה אישית עבור מערך של יישומים ביו. הסרט הציג משי מערכת התרבות ניתנת להתאמה ביותר למגוון...

סרט משי תרבות מערכת במבחנה ניתוח ביולוגי עיצוב

למרות תכונות מכניות ביוכימי הבולטים של משי עכביש, חומר זה לא ניתן לקצור בכמויות גדולות באמצעים קונבנציונליים. כאן אנו מתארים אסטרטגיה יעילה לטוות קורי עכביש מלאכותיים סיבי, שהוא תהליך חשוב עבור החוקרים הלומדים ייצור עכביש המשי ואת השימוש בהם הדור הבא של biomaterials.

ייצור סינתטי קורי עכביש בקנה מידה מעבדה

סיבי משי עכביש להציג תכונות מכאניות יוצאות דופן. תכנון...

התקנים כוללים מסנן אוויר משתלב לא ארוג של חלבונים קורי עכביש רקומביננטי electrospun

שיטה להשיג nanofibers וננו המורכב מחלבונים מטריצת חוץ תאיים בודדים או מרובים מתוארת. שיטה זו משתמשת באינטראקציות חלבון פני השטח כדי ליצור חומרים המבוססים על חלבונים חופשיים עומדים עם הרכב מתכונן וארכיטקטורה לשימוש במגוון רחב של יישומי הנדסה וביוטכנולוגיה רקמות.

Nanofibers חלבון ECM ועצרת ביוזמת פני שטח באמצעות ננו תכנון הנדסי

ההתקדמות בטכנולוגיות ביו-חומרים מאפשרת פיתוח מבנים תלת מימדיים מרובי תאים. פיתחנו פרוטוקולי אלקטרו-ספינינג לייצור שלושה פיגומים בודדים לתרבית התאים המבניים העיקריים של דרכי הנשימה כדי לספק מודל תלת מימדי במבחנה של דופן הסימפונות של דרכי הנשימה.

התאמת תהליך Electrospinning לספק שלוש סביבות ייחודיות לTri-שכבתי<em&gt; במבחנה</em&gt; דגם של חומת Airway

פרוטוקול microfluidic ספינינג, מיקרו אפיון מחדש fibroin משי monofilament מוצג.

Microfluidic יבש-ספינינג ואפיון של סיבי Fibroin משי מחדש

המטרה של פרוטוקול זה הוא ייצור של סיבי מטריצה חוץ-תאית כל ממוקד עבור תיקון הפצע אשר מתאימים להערכה פרה כחלק שתל משובי לגרדום. סיבים אלו המיוצר על ידי התרבות של fibroblasts על ממברנות הולופייבר, שחולצו על ידי פירוק הממברנות.

ייצור סיבים מטריצה חוץ-תאית באמצעות תרבית תאים הממברנה ההקרבה הולופייבר

מטרת פרוטוקול זה היא להראות את ההרכבה של ננומטריקס ביומימטי (NM) עם צינוריות בסיס יאנוס (JBNTs) ו fibronectin (FN). כאשר הם מתרבים במשותף עם תאי גזע mesenchymal אנושי (hMSCs), NMs להפגין ביואקטיביות מעולה בעידוד הידבקות hMSCs.

ייצור ננו-מטריקס ביומימטי עם צינורות בסיס יאנוס ופיברונקטין להדבקת תאי גזע

מיזוג הוא גישה יעילה ליצירת חומרים ביולוגיים עם מגוון רחב של מאפיינים ותכונות משולבות. על ידי חיזוי האינטראקציות מולקולריות בין חלבוני משי טבעי השונים, פלטפורמות סגסוגת חלבון חדשות משי משי עם גמישות מתכונן מכאנית, תגובה חשמלית, שקיפות אופטית, processability הכימי, פריקות ביולוגית, או יציבות תרמית יכולות להיות מתוכננות.

עיצוב פרוטאין משי משי חומרי סגסוגת עבור יישומים ביו

תובנה לגבי הפעולות המורכבות של המוח דורשת כלי מחקר מתקדמים. כאן אנו מדגימים מודל תלת מימדי חדש מבוסס משי-קולגן של רקמה עצבית הדומה לארכיטקטורה דמוית מוח. המודל יכול לשמש לחקר הרכבת רשת עצבית, הנחיה אקסונלית, אינטראקציות תא-תא ופעילות חשמלית.

דגם של רקמות עצביות מקוטב מבוסס משי-קולגן מהונדס 3D

למדו שימוש בקרומי FN-silk ממשי עכביש פונקציונלי לתרבית תאי קרטינוציטים אנושיים. שיטה זו מחקה את קרום המרתף הטבעי ומשפרת את הרלוונטיות הפיזיולוגית של מודלים תוך-מעבדתיים לחקר תרופות והנדסת רקמות.

חיקוי קרום מרתף ננופיברילרי עשוי ממשי עכביש פונקציונלי רקומביננטי בתוספות תרבית רקמה בהתאמה אישית

גלה סרטונים נוספים