Name: ברגמאייר כימות גלוקוז לדגימות מיקרוביולוגיות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T12:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למדו את שיטת ברגמאייר לכימות גלוקוז בדגימות מיקרוביולוגיות. הפרוטוקול משפר דיוק ורגישות בזיהוי ריכוזי גלוקוז נמוכים בתרביות חיידקים ושמרים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. הכנת פתרון
<ol>
	<li>הכן 100 מ"ל של חיץ פוספט 0.1 M. שוקלים 1.28 גרם אשלגן דימימן פוספט (KH2PO4) ו-0.1304 גרם פוספט דיפוטסיום (K2HPO4) ומוסיפים אותם לכוס זכוכית. כעת, הוסיפו 70 מ"ל מים שעברו דה-יוניזציה (H2Odi) וכווננו את ה-pH ל-5.5 באמצעות חומצה הידרוכלורית (HCl) או אשלגן הידרוקסידי (KOH). מעבירים את התמיסה לבקבוק נפחי ומתאימים את הנפח הסופי ל -100 מ"ל. לאחר מכן, העבירו את התמיסה למיכל ענבר ואחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4-8 מעלות צלזיוס למשך עד 3 חודשים. אזהרה: יש ללבוש כפפות ניטריל לאורך כל תהליך ההכנה כדי למנוע מגע בעור וזיהום פוטנציאלי, שכן O-dianisidine dihydrochloride הוא מסרטן פוטנציאלי.</li>
	<li>הכינו תמיסת 1% w/v של o-dianisidine dihydrochloride. שוקלים 0.01 גרם של o-dianisidine dihydrochloride ומניחים אותו בצינור צנטריפוגה 2.0 מ"ל. בעזרת מיקרופיפטה של 1,000 מ"ל, מוסיפים 1.0 מ"ל של H2Odi כדי להמיס את התרכובת, ואז מערבבים לאט על ידי פיפטינג למעלה ולמטה. הגן על התמיסה מפני אור על ידי עטיפת המיכל ברדיד אלומיניום ואחסן אותו בטמפרטורה של -20°C כדי לשמור על יציבות. הערה: כדי להקל על התמיכה בצינור במהלך המדידה על האיזון האנליטי, ניתן להשתמש בכוס של 10 מ"ל כתמיכה נוספת. זה עוזר לייצב את הצינור, הבטחת מדידה מדויקת על ידי מזעור הסיכון של עקירה או הטיה שעלולה לשנות את התוצאות המתקבלות על האיזון.</li>
	<li>בצלוחית נפחית של 100 מ"ל, הוסף 10 מ"ל של תמיסת חיץ פוספט ואחריה 1 מ"ל של תמיסת 1% v/v o-dianisidine dihydrochloride. לאחר מכן, התאם את הנפח הסופי ל -100 מ"ל עם חיץ פוספט כדי לקבל ריכוז סופי של תערובת חיץ 0.01% o-dianisidine. מעבירים את התמיסה לבקבוק ענבר ועוטפים אותו ברדיד אלומיניום כדי להגן עליו מפני אור. אחסנו את התמיסה בטמפרטורה של 4-8°C למשך עד 3-4 חודשים. הערה: קירור חיוני למניעת הירקבות, אשר עלולה לסכן את שלמות המדידות הניסיוניות. כדי למנוע התפרקות של תערובת חיץ o-dianisidine, חלק קטן של 13 מ"ל (מספיק עבור 12 דגימות) ניתן להציב בתוך צינור פלסטיק 14 מ"ל על קרח עד לשימוש.</li>
	<li>הכינו פתרון 50% H2SO4 . מניחים בקבוק נפח של 100 מ"ל עם 30 מ"ל של H2Odi באמבט קרח ומניחים לו להתקרר במשך 10 דקות. לאחר מכן, לשפוך באיטיות 51 מ"ל של H2SO4 (98% v/v) במורד קירות הצלוחית, רועד בזהירות כדי הומוגניזציה של התמיסה. המתן עד שהתערובת תתקרר, מכיוון שהתגובה היא אקסותרמית (יוצרת חום). כוונן את עוצמת הקול הסופית ל -100 מ"ל עם H2Odi והעבר את התמיסה לצלוחית ענבר זכוכית. הערה: השתמש במכסה אדים ופעל לפי כל פרוטוקולי הבטיחות, הקפד ללבוש ציוד מגן מתאים. הכינו 50 מ"ל של תמיסת 40% סידן פחמתי כדי לנטרל כל שפיכה אפשרית שעלולה להתרחש.</li>
	<li>הכן 50 mM נתרן אצטט פתרון על ידי המסת 0.04 גרם של נתרן אצטט ב 5 מ"ל של H2אודי בכד. התאם את ה- pH ל- 5.1 באמצעות חומצה אצטית קרחונית. לבסוף, התאם את עוצמת הקול ל -10 מ"ל עם H2Odi.</li>
</ol>
2. הכנת אנזימים
<ol>
	<li>במיקרו-צינורית סטרילית של 2.0 מ"ל, שוקלים 0.01 גרם גלוקוז אוקסידאז ומערבבים עם 1 מ"ל של 50 מ"מ נתרן אצטט, pH 5.0, כדי לקבל ריכוז סופי של 10 מ"ג/מ"ל. מכסים את הצינור ברדיד אלומיניום ומאחסנים ב-20°C-. הערה: ניתן לאחסן את התמיסה עד חודשיים בטמפרטורה של -20°C.</li>
	<li>חשב את נפח תמיסת האנזים V2 הדרוש להשגת פעילות האנזים הרצויה בכל קובטה פלסטית (עם נפח כולל של 1.5 מ"ל) באמצעות Eq (1): V1C1 = V2C2, כאשר V1 הוא 1,500 μL, C1 הוא 28.5 U של פעילות האנזים, ו- C2 (ריכוז תמיסת האנזים) הוא 12,970 U/mL (10 מ"ג של האנזים [129,000 יחידות / גרם] ב 1 מ"ל של H2Odi). V2 = (1,500 μL × 28.5 U)/12,970 U = 3.29 μL (1) הערה: לקבלת פיפטינג מדויק יותר, ניתן לעגל את הערך ל- 3.3 μL.</li>
	<li>במיקרו-צינורית חדשה של 2 מ"ל, שקלו 0.0031 גרם של אנזים פרוקסידאז והוסיפו 1 מ"ל של מאגר פוספט, pH 5.5, כדי להשיג ריכוז סופי של 3.1 מ"ג/מ"ל. כסו את המיקרו-צינור ברדיד אלומיניום ואחסנו בטמפרטורה של -20°C.</li>
	<li>חשב את נפח תמיסת הפרוקסידז הנדרשת להשגת פעילות האנזים הרצויה לכל קובטה באמצעות Eq (1). התחל עם נפח קובטה כולל של 1,500 μL ופעילות אנזים מטרה של 1.25 U. לאחר מכן, לקבוע את הנפח הדרוש של תמיסת האנזים, בהתחשב בריכוז שלה של 1,551 U. V2 = (1,500 μL × 1.25 U)/1,551 U = 1.208 μL הערה: לקבלת צנרת מדויקת יותר, הערך עוגל ל- 1.20 μL.</li>
</ol>
3. תקן גלוקוז
<ol>
	<li>הכינו תקן D-גלוקוז של 1 גרם/ליטר על ידי הוספת 0.01 גרם של D-גלוקוז ל-10 מ"ל של H2Odi בצלוחית נפחית. כדי לדלל את הריכוז ל 0.5 גרם / ליטר, לקחת 500 μL של תמיסת מלאי ולערבב אותו עם 500 μL של H2Odi כדי להשיג נפח סופי של 1 מ"ל. הערה: תהליך דילול זה חיוני ליצירת פתרונות סטנדרטיים מדויקים.</li>
</ol>
4. הכנת עקומה סטנדרטית
<ol>
	<li>באמצעות מיקרו-צינור חדש של 2 מ"ל, הוסף את נפח החיץ והגלוקוז המצוין בטבלה 1.</li>
	<li>הגדר את thermobath יבש ל 37 °C. ברגע שהטמפרטורה יציבה, הוסף 3.3 מיקרוליטר של גלוקוז אוקסידאז לכל הצינורות ולאחר מכן הוסף 1.2 מיקרוליטר של פרוקסידאז לכל צינור. לדגור את הצינורות ב 37 ° C במשך 20 דקות.</li>
	<li>לאחר הדגירה, יש להוסיף מיד 750 μL של 50% H2SO4 (v/v) לכל מיקרו-צינור ולתת לתערובת להתקרר באמבט קרח למשך 2 דקות. התוצאה היא נפח סופי של 1,500 μL. לבסוף, להעביר את הפתרון לקובט פלסטיק ולמדוד את הספיגה ב 529 ננומטר.</li>
</ol>
טבלה 1: עקומת כיול גלוקוז עבור שיטת GOX-H2SO4 . קיצורים: אלוהים = גלוקוז אוקסידאז; POD = peroxidase; H2SO4 = חומצה גופרתית. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126_Table%201.xlsx" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד טבלה זו.</a>
5. בדיקת דגימות מיקרוביולוגיות
<ol>
	<li>קבל את הדגימה על ידי גידול חיידקים או שמרים בתווך תרבית נוזלית בתנאים מסוימים, כולל טמפרטורה, מהירות תסיסה וזמן הדגירה. ברגע שהתרבית מגיעה לצפיפות האופטית הרצויה (OD) או לריכוז התא, אספו את התרבית לעיבוד נוסף. הערה: Pseudomonas reptilivora תורבת במהירות תסיסה קבועה של 300 סל"ד ו 28 ° C, בעוד Debaryomyces hansenii היה תרבית עם מהירות תסיסה של 200 סל"ד ב 30 ° C ב shaker מסלולית. במקרה הספציפי של D. hansenii, שמן קנולה אכיל שימש גם כגורם לייצור ליפאז.</li>
	<li>נקו את אזור העבודה עם תמיסת 70% אלכוהול או חומר ניקוי מתאים על פי פרוטוקולי בטיחות ביולוגית. הדליקו מבער כדי להבטיח אספסיס.</li>
	<li>העבר 100 μL של מדיה תרבותית לתוך 1.5 מ"ל או 2 מ"ל מיקרו צינור באמצעות קצוות סטריליים.</li>
	<li>צנטריפוגה הדגימות ב 7,500 × גרם במשך 7 דקות ב 4 ° C, או ב 10,000 × גרם במשך 7 דקות ללא בקרת טמפרטורה. לאחר הצנטריפוגה, בזהירות להסיר את supernatant, אשר מכיל גלוקוז בתמיסה, ולהשליך את הכדור.</li>
	<li>השתמש 0.5 μL של supernatant עבור ריכוזי גלוקוז הנעים בין 1 ל 20 גרם / ליטר, ולאחר מכן לערבב עם 749.5 μL של o-dianisidine-buffer, 3.3 μL של אלוהים, ולאחר מכן 1.2 μL של POD. לדגור את microtubes במשך 20 דקות ב 37 ° C, כמפורט בשלב 4.2 ומיד להוסיף 750 μL של 50% H2SO4 ולתת לו להתקרר באמבט קרח במשך 2 דקות.<ol>
		<li>עבור ריכוזים מעל 20 גרם / ליטר, בצע דילול 1:1 עם H2Odi סטרילי לפני שתמשיך.</li>
		<li>אם דגימות הסופרנאטנט הוקפאו בעבר בטמפרטורה של -80°C או -20°C, הפשירו אותן בטמפרטורת החדר ומערבולות במשך 30 שניות לפני השימוש. אם יש צורך בדילול, השתמש סטרילי H2Odi.</li>
		<li>עבור דגימות עם ריכוז גלוקוז מעל 30 גרם / ליטר, לבצע דילול 1: 1 עם סטרילי H2Odi, וכתוצאה מכך גורם דילול של 2.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>חשב את ריכוז הגלוקוז הכולל בכל דגימה באמצעות Eq (2) בתוכנית גיליון אלקטרוני. 
	<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67126/67126eq11.jpg" style="margin: auto;">(2) איפה: 
	x = ריכוז גלוקוז (גר'/ל') δ = נפח התגובה הסופי (0.0015 ליטר) 
	y = ספיגה M.S. = כמות הדגימה בשימוש* הערה: הערכים b ו - m הם מהמשוואה המדמה את קו המגמה של עקומת הכיול עבור השיטה (y = mx + b). *ערך MS חייב להתבסס על כמות הדגימה המשמשת לקבלת היחס בדילול המתאים (כלומר, אם לוקחים 0.5 μL של הסופרנטנט, M.S. = 0.0000005 L = 0.5 × 10-6 L); אם נעשה שימוש בגורם דילול (DF), הכפל את הספיגה המתקבלת על ידי DF. לדוגמה, אם מתקבל ספיגה של 0.5 ונעשה שימוש ב- DF של 2, התוצאה תהיה 1.0. לכן, y = 1.0, ויש להזין ערך זה ב- Eq (2), כפי שתואר קודם לכן.</li>
</ol>
6. אימות אנליטי
<ol>
	<li>חישוב פרמטרי האימות האנליטיים של שיטת GOX-H2SO4 על פי מה שנקבע על ידי המרכז הלאומי למטרולוגיה וישות ההסמכה המקסיקנית10 (CENAM-ema).<ol>
		<li>חישוב דיוק כאחוז ממקדם השונות או %CV = (S/x) × 100, כאשר x הוא ממוצע קבוצת המדגם ו - S הוא סטיית התקן עם ערך קבלה של ≤10%.</li>
		<li>קבע ליניאריות על-ידי התאמת העקומה הסטנדרטית לדגם ליניארי R2 מעל 0.995.</li>
		<li>חשב את גבול הכימות (LOQ) באמצעות המשוואה: LOQ = yB + 10sB, כאשר yB מייצג את ריכוז האנליטה המפיק אות שווה ערך לאות המטרה, ו- 10sB מציין פי 10 את סטיית התקן של הריק</li>
		<li>חשב את השגיאה השיטתית באמצעות משוואה זו: Slant = x - m, כאשר x = ממוצע ריכוז הניסוי ו- m הוא הריכוז התיאורטי.</li>
		<li>לקבוע דיוק כמידת ההסכמה בין ערך ממשי לערך תיאורטי. התאוששות% = (CR/CV) × 100 כאשר CR הוא הממוצע של ריכוז הניסוי ו- CV הוא מקדם השונות של הריכוז התיאורטי.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
7. התערבות על ידי הפחתת סוכרים אחרים
<ol>
	<li>העריכו בנפרד ארבעה סוכרים מפחיתים: גלוקוז, פרוקטוז, גלקטוז וקסילוז מתמיסת ציר של 0.5 גרם/ליטר. בנוסף, השתמש בטרהלוז כבקרה שלילית. עקוב אחר הפרוטוקול עבור כל הדגימות ומדוד את הספיגה ב- 545 ו- 529 ננומטר.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>כימות גלוקוז אנזימטי ברגמאייר לאנליזה מיקרוביאלית ושמרים

<ol><li>Huang, W. C., Tang, I. C. Bacterial and yeast cultures: process characteristics, products, and applications. Bioprocessing for value-added products from renewable resources. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHuang%2C+WC+%22New+Technologies+and+Applications%22">New Technologies and Applications</a>. , Elsevier. 185-223 (2007).</li>
<li>Hernandez-Lopez, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+reducing+sugars+based+on+the+qualitative+technique+of+Benedict%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">Quantification of reducing sugars based on the qualitative technique of Benedict.</a> ACS Omega. 5 (50), 32403-32410 (2020).</li>
<li>Miller, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+dinitrosalicylic+acid+reagent+for+determination+of+reducing+sugar%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar.</a> Anal Chem. 31 (3), 426-428 (1959).</li>
<li>Deshavath, N. N., Mukherjee, G., Goud, V. V., Veeranki, V. D., Sastri, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pitfalls+in+the+3%2C5-dinitrosalicylic+acid+%28DNS%29+assay+for+the+reducing+sugars%3A+interference+of+furfural+and+5-hydroxymethylfurfural%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Pitfalls in the 3,5-dinitrosalicylic acid (DNS) assay for the reducing sugars: interference of furfural and 5-hydroxymethylfurfural.</a> Int J Biol Macromol. 156, 180-185 (2020).</li>
<li>De Abreu, J. R., Santos, C. D. D., De Abreu, C. M. P., Corrêa, A. D., De Oliveira Lima, L. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sugar+fractionation+and+pectin+content+during+the+ripening+of+guava+cv.+Pedro+Sato%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Sci+Technol%22%5BJournal%5D)">Sugar fractionation and pectin content during the ripening of guava cv. Pedro Sato.</a> Food Sci Technol. 32 (1), 156-162 (2020).</li>
<li>Dubois, M., Gilles, K. -A., Hamilton, J. K., Roberts, P. A., Smith, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+colorimetric+method+for+the+determination+of+sugars%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A colorimetric method for the determination of sugars.</a> Nature. 168 (4265), 167(1951).</li>
<li>Gonzalez, N. M., Fitch, A., Al-Bazi, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+RP-HPLC+method+for+determination+of+glucose+in+Shewanella+oneidensis+cultures+utilizing+1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone+derivatization%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Development of a RP-HPLC method for determination of glucose in Shewanella oneidensis cultures utilizing 1-phenyl-3-methyl-5-pyrazolone derivatization.</a> PLoS ONE. 15 (3), e0229990(2020).</li>
<li>Galant, A. L., Kaufman, R. C., Wilson, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glucose%3A+Detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Chem%22%5BJournal%5D)">Glucose: Detection and analysis.</a> Food Chem. 188, 149-160 (2015).</li>
<li>Bergmeyer, H. U. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBergmeyer%2C+HU+%22Methods+of+enzymatic+analysis%22">Methods of enzymatic analysis</a>. 2, Elsevier Inc. (2012).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Gu%C3%ADa+t%C3%A9cnica+sobre+trazabilidad+e+incertidumbre+en+las+mediciones+anal%C3%ADticas+que+emplea+la+t%C3%A9cnica+de+espectrofotometr%C3%ADa+de+ultravioleta-visible%22">Guía técnica sobre trazabilidad e incertidumbre en las mediciones analíticas que emplea la técnica de espectrofotometría de ultravioleta-visible</a>. , CENAM-EMA. (2008).</li>
<li>Yuen, V. G., McNeill, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+glucose+oxidase+method+for+glucose+determination+by+manual+assay+and+automated+analyzer%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of the glucose oxidase method for glucose determination by manual assay and automated analyzer.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 44 (3), 543-546 (2000).</li>
<li>Hansen, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specificity+of+glucose+oxidase+reaction+and+interference+with+quantitative+glucose+oxidase-peroxidase-O-dianisidine+method%5BTitle%5D)+AND+%22Scand+J+Clin+Lab+Investig%22%5BJournal%5D)">Specificity of glucose oxidase reaction and interference with quantitative glucose oxidase-peroxidase-O-dianisidine method.</a> Scand J Clin Lab Investig. 14 (6), 651-655 (1962).</li>
<li>Kumar, V., Gill, K. D. Estimation of blood glucose levels by glucose oxidase method. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKumar%2C+V+%22Basic+concepts+in+clinical+biochemistry%3A+A+practical+guide%22">Basic concepts in clinical biochemistry: A practical guide</a>. , Springer eBooks. 57-60 (2018).</li>
</ol>

גלוקוז משמש כמקור האנרגיה והפחמן העיקרי עבור מיקרואורגניזמים רבים, כולל חיידקים, שמרים ופטריות. מיקרואורגניזמים אלה קולטים גלוקוז באמצעות טרנספורטרים הממוקמים על הממברנה החוץ-תאית, שם הוא עובר סדרה של תגובות ביוכימיות בתוך המסלול המטבולי של גליקוליזה כדי להפוך לפירובט1. ישנן טכניקות שונות לכימות הפחתת סוכרים כגון גלוקוז. לדוגמה, מגיב2 של בנדיקט, השימוש בחומצה 3,5-dinitrosalicylic (DNS)3,4, שיטת anthrona5, או חומצה פנול-גופרתית6 שיטות ניתן להשתמש. עם זאת, שיטות אלה מזהות כל הפחתת סוכר נוכח בדגימה, כגון פרוקטוז ומלטוז, אשר יכול לתרום את האות ולסבך את הכימות המדויק של סוכר מסוים.
בנוסף, הם דורשים בקרת טמפרטורה קפדנית וטיפול בחומרים מסוכנים, אשר יכול לסבך את התהליך ולהשפיע על הדיוק. שיטות אלה יכולות גם לסבול מהפרעות של תרכובות אחרות הקיימות בדגימה, מה שמקשה על כימות מדויק של גלוקוז. לעומת זאת, כרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים (HPLC) מציעה חלופה מדויקת יותר, המאפשרת הבחנה בין גלוקוז לסוכרים מפחיתים אחרים, אם כי עם עלויות תפעול גבוהות יותר. שיטות מנוגדות אלה מדגישות את הצורך המתמשך בפיתוח טכניקות כימות גלוקוז מדויקות וחסכוניות7.
שיטת גלוקוז אוקסידאז-פרוקסידאז-חומצה גופרתית (GOX-H2SO4) משתמשת בשני אנזימים, גלוקוז אוקסידאז (GOD) ופרוקסידז (POD). GOD הוא אנזים אוקסידורדוקטאז שהוא סלקטיבי מאוד לחמצון של β-D-גלוקוז8. קומפלקס זה פועל כזרז במהלך התגובה המתרחשת כאשר גלוקוז נמצא בנוכחות חמצן, המייצר חומצה גלוקונית ומי חמצן (H2O2). H2O2 מזוהה באמצעות מקבל חמצן כרומוגני, o-dianisidine, אשר, באינטראקציה עם POD, גורם לחמצון שלו ולשחרור H2O2, ומונע המרה חזרה של חומצה גלוקונית לגלוקוז (ראו איור 1). הצבע המתקבל מיוצב על ידי תוספת של חומצה גופרתית (H2SO4), אשר גם מפסיק את התגובה האנזימטית, ובכך למנוע הפרעה אפשרית שעלולה להתרחש אם התגובה נמשכת9.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67126/67126fig01.jpg"> 
איור 1: סקירה כללית של שיטת כימות הגלוקוז באמצעות האנזים גלוקוז אוקסידאז. אשר מגיב עם גלוקוז לייצור מי חמצן (H2O2) וחומצה גלוקונית. לאחר מכן, האנזים peroxidase מגיב עם H2O2 בנוכחות O-dianisidine dihydrochloride. בשלב האחרון, חומצה גופרתית (H2SO4) מתווספת כדי לעצור את התגובה האנזימטית, וכתוצאה מכך צבע ורוד שנמדד ב 529 ננומטר. קיצורים: POD = peroxidase; אלוהים = גלוקוז אוקסידאז. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67126/67126fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
השיטה האנזימטית GOX-H2SO4 היא טכניקה בשימוש נרחב למדידת ריכוז הגלוקוז בדגימות ביולוגיות, שרובן בעלות עניין קליני. עם זאת, מחקרים מעטים חקרו טכניקה המאפשרת לכמת את כמות הגלוקוז במדיום צמיחה כדי להעריך את צריכתו. לכן, בפרוטוקול הנוכחי, המתודולוגיה לכימות גלוקוז באמצעות התגובה האנזימטית של גלוקוז אוקסידאז, peroxidase, o-dianisidine dihydrochloride, ו- H2SO4 בדגימות נוזל מיקרוביולוגיות מוצגת, אשר עולה כשינוי של העבודה שנעשתה על ידי Bergmeyer9, באמצעות 50% (v/v) H2SO4 וכמויות נמוכות יותר של ריאגנטים.

<table><tbody><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינור</td><td>Eppendorf</td><td></td>-<td>-</td></tr><tr><td>2.0 מ"ל מיקרו-צינור</td><td>Eppendorf</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>CaCO3</td><td>Meyer</td><td>471-34-1</td><td>סידן פחמתי</td></tr><tr><td>D-גלוקוז</td><td>מאייר</td><td>50-99-7</td><td>D-גלוקוז&nbsp;</td></tr><tr><td>Drybath</td><td>FisherScientific</td><td>11-718-4</td><td>סידורי 911NO251. בלוק רוחב x עומק x גובה מ"מ/אינץ': 124 x 76 x 39 / 4.9 x 3.0 x 1.5</td></tr><tr><td>גלוקוז אוקסידאז&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G6125-50KU</td><td>אבקת אנזים</td></tr><tr><td>H2O</td><td>-</td><td></td><td>-מים נטולי יונים</td></tr><tr><td>H2SO4</td><td>Meyer</td><td>7664-93-9</td><td>חומצה גופרתית</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Meyer</td><td>7647-01-0</td><td>חומצה הידרוכלורידרית&nbsp;</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Meyer</td><td>7758-11-4</td><td>דיפוטסיום פוספט</td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Meyer</td><td>7778-77-0</td><td>מונופוטסיום פוספט</td></tr><tr><td>KOH</td><td>Meyer</td><td>1310-58-3</td><td>אשלגן הידרוקסיד</td></tr><tr><td>למבדה 35</td><td>PerkinElmer-ספקטרופוטומטר</td><td></td><td></td></tr> <tr><td>מיקרו-צינור צנטריפוגה</td> <td>-</td><td></td><td>--</td></tr> <tr><td>O-Dianisidine dihydrochloride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D3252</td><td>Chromogenic</td></tr><tr><td>Peroxidase</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8125-50KU</td><td>אבקת אנזים</td></tr><tr><td>pH-meter</td><td>Hanna&nbsp;</td><td>1131</td><td>Hanna 1170</td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>מאייר</td><td>127-09-3</td><td>מאייר</td></tr><tr><td>מרית שקילה&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>-</td></tr></tbody></table>

ברגמאייר כימות גלוקוז לדגימות מיקרוביולוגיות

Bergmeyer Glucose Quantification for Microbiological Samples

הניתוח הספקטרופוטומטרי של GOX-H2SO4 חשף בליעה מקסימלית אחת של 529 ננומטר (λmax) (איור 2A), עם ערכי בליעה נוספים שנצפו ב-545 ננומטר. על-ידי ניתוח ערכי הספיגה בריכוזי גלוקוז שונים, קיבלנו ליניאריות (R²) של 0.9977 עבור λ529 ננומטר ו-R² של 0.9967 עבור λ545 ננומטר (איור 2B). לינאריות, בטווח נתון, מתייחסת ליכולת לספק תוצאות ביחס ישר לריכוז הגלוקוז בדגימות. זה הוערך באמצעות מקדם הקביעה, המשקף את הדיוק של מודל הרגרסיה (איור...

The glucose concentration is a key indicator of cellular metabolism and could indicate the total metabolism rate, an aberration in glucose metabolism, ...

bergmeyer-glucose-quantification-for-microbiological-samples

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

שיטה בדיוק להפיק באופן מקיף לאפיין המורפולוגיה של פטריות...

התאמה אישית של אספרגילוס ניז&#39;ר מורפולוגיה באמצעות תוספת של חלקיקי טלק מיקרו

סרטון זה מדגים בדיקה חוץ גופית למדידה עקיפה של ספיגת גלוקוז תוך תאית. הבדיקה משתמשת באנלוג גלוקוז עם תווית פלואורסצנטית כדי לקבוע מתאם בין דלדול גלוקוז חוץ-תאי לבין ספיגת גלוקוז תוך תאי.

בדיקת דלדול גלוקוז במבחנה: שיטה מבוססת פלואורסצנטיות לכימות ספיגת גלוקוז בתאים באמצעות מדידת דלדול גלוקוז חוץ-תאי

סרטון וידאו זה מתאר בדיקה קולורימטרית למדידת לקטט בליזטים של תאים באמצעות האנזים לקטט דהידרוגנאז. אנזים זה ממיר לקטט לפירובט, יחד עם המרה של NAD ל-NADH שמגיב עם צבעי טטרזוליום ונותן תוצר צבעוני שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית כדי לכמת את הלקטט.

בדיקה קולורימטרית לכימות לקטט בדגימות בדיקה

סרטון זה מדגים הליך לאיסוף שתן עכבר והערכת רמות הגלוקוז שלו. כדי להעריך את רמת הגלוקוז, לטבול רצועת בדיקה מצופה אנזימים וצבע כרומוגני לתוך הדגימה, ליזום שינוי צבע המציין את רמות הגלוקוז. לכימות רמות הגלוקוז בשתן, יש להכניס דגימת שתן לצלחת מרובת בארות עם ריכוזי גלוקוז עולים, להוסיף את תערובת התגובה ולדגור. למדוד את הספיגה כדי ליצור עקומה סטנדרטית ולחשב את רמות הסוכר בהתבסס על ספיגת הדגימה.

בדיקות להערכה איכותית וכמותית של ריכוזי גלוקוז בשתן עכברים

תיאור כיצד לכייל את חיישני העברת פורסטר התהודה האנרגיה משולבים ביולוגיים (FIBS) בפרופיל מטבולי אתר מוצג. FIBS ניתן להשתמש כדי למדוד את הרמות תאית של מטבוליטים noninvasively סיוע בפיתוח מודלים מטבוליים והקרנת תפוקה הגבוהה של תנאי Bioprocess.

FIBS מאופשר פולשנית מטבולית פרופיל

אנו מציגים שיטה מודולרית אוטומטית בעלת תפוקה גבוהה לזיהוי ואפיון של אקסופוליסכרידים מיקרוביאליים בקנה מידה קטן. שיטה זו משלבת בחירה מוקדמת מהירה לניתוח הכמות הכוללת של פוליסכרידים המופרשים עם טביעת אצבע מפורטת של פחמימות כדי לאפשר סינון מהיר של זני חיידקים שבודדו לאחרונה או אוספי זנים שלמים.

פלטפורמה הגבוהה הקרנת מודולרי האוטומטי תפוקת Exopolysaccharide בשילוב עם ניתוח רגיש מאוד טביעות אצבע פחמימות

פרוטוקול זה מתאר את הכימות המהיר ורגיש מאוד של העברת אנרגית תהודת פורסטר נתוני חיישנים (סריג) באמצעות נתח סריג נייד מחוייט. המכשיר שימש לאיתור מלטוז בטווח טמפרטורה קריטית הממקסם רגישות זיהוי, שמאפשרים להעריך מעשית ויעילה של תכולת הסוכר.

רגיש מאוד מהיר קרינת איתור עם Analyzer Portable סריג

כאן, אנו מתארים בדיקה קולורימטרית לאיתור נוכחות של סוכרים מפחיתים במהלך נביטת נבגי חיידקים.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

מונוציטים הם מרכיבים אינטגרליים של מערכת החיסון המולדת האנושית המסתמכים על חילוף חומרים גליקוליטי כאשר הם מופעלים. אנו מתארים פרוטוקול זרימה ציטומטרית למדידת ביטוי טרנספורטר גלוקוז וספיגת גלוקוז על ידי סך כל המונוציטים ותת-אוכלוסיות המונוציטים בדם מלא טרי.

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי וכמות של סוגים עיקריים של מטבוליטים מסיסים במים ב cerevisiae Saccharomyces שמרים. השיטה המתוארת היא רב-תכליתית, חזקה ורגישה. היא מאפשרת הפרדה בין איסומרים מבניים וצורות סטריאואיזומריות של מטבוליטים מסיסים במים זה מזה.

מטבולומיה כמותית של Saccharomyces Cerevisiae באמצעות כרומטוגרפיה נוזלית בשילוב עם ספקטרומטריית מסה דו-מושבית

פרוטוקול מתואר להכנת מודל פשוט של מערכת אקולוגית המשחזרת את שיפוע מונה המתאן-חמצן שנמצא בבית הגידול הטבעי של חיידקים מחמצני מתאן אירוביים, ומאפשר לחקור את הפיזיולוגיה שלהם בהקשר של פתרון מרחבי. כמו כן מתוארים שינויים בבדיקות ביוכימיות נפוצות לשימוש במערכת האקולוגית של המודל מבוסס האגרוז.

מודל אקולוגי מבוסס אגרוז לטיפוח מתאנוטרופים בשיפוע מונה מתאן-חמצן

למדו את שיטת ברגמאייר לכימות גלוקוז בדגימות מיקרוביולוגיות. הפרוטוקול משפר דיוק ורגישות בזיהוי ריכוזי גלוקוז נמוכים בתרביות חיידקים ושמרים.

ברגמאייר כימות גלוקוז לדגימות מיקרוביולוגיות

גלה סרטונים נוספים