טכניקת שחייה אופקית בצורת U להכנת זרע איכותי עם אינדקס פיצול DNA נמוך

[קריין] המחקר מתמקד בשיטה לאופטימיזציה של זרע, במטרה לקבוע האם טכניקת UHS מציעה יתרונות בהכנת זרע באיכות גבוהה עם אינדקס פיצול DNA נמוך. נעשה שימוש בטכנולוגיה מיקרופלואידית כדי לייעל את בחירת הזרע באיכות גבוהה עם DFI נמוך יותר. המגבלה העיקרית של שיטת UHS היא ההסתמכות הגבוהה שלה על יכולת השחייה העצמית של זרע באיכות גבוהה. שיטת UHS אינה מתאימה לחולים עם זרע לא נייד לחלוטין. תיגמוטקסיס ממלא תפקיד מכריע בהפרדת הזרע. למסלול בצורת U יש גבול ארוך יותר, המאפשר תנועה חופשית של זרע באיכות גבוהה, ומאפשר הפרדה מוחלטת שלהם מזרע לא נייד, זיהומים ורכיבים אחרים. בהשוואה לטכניקת DGC, שיטת נתיב UHS כוללת פחות שלבי הפעלה ידניים עבור אנשי מעבדה, וזרע באיכות גבוהה המתקבל בשיטת נתיב UHS אינו עובר הליכי צנטריפוגה חוזרים ונשנים, וכתוצאה מכך DFI נמוך יותר. כדי להתחיל, הוסף 20 מיקרוליטר של מדיום דישון לצלחת ההפעלה ליצירת מסלולים בצורת U. מוצצים 10 מיקרוליטר של מדיום הפריה בעזרת פיפטה ליצירת טיפה עגולה בנקודת ההתחלה השמאלית של המסלול בצורת U. באמצעות מדיום הפריה, צור שתי טיפות חיץ של 10 מיקרוליטר כל אחת במרווחים לאורך החלק האמצעי השמאלי של המסילה בצורת U. חבר את כל הטיפות עם מדיום הפריה ליצירת מסלול רציף. השתמש ב-2.5 מיקרוליטר של פוליוויניל פירולידון, או PVP, כדי ליצור רצועה ארוכה של טיפת נוזל בצד ימין של המסילה בצורת U. צור שש מיקרו-טיפות באמצעות מדיום עיבוד הביציות בצד ימין של רצועת ה-PVP. הוסף לתבשיל שבעה מיליליטר שמן תרבית, וודא שהשמן מכסה לחלוטין את הנקודה הגבוהה ביותר של הטיפות. מניחים את המנה באינקובטור של 37 מעלות צלזיוס, 6% פחמן דו חמצני למשך הלילה לשיווי משקל. לאחר איסוף הזרע יש למדוד את נפחו בשיטת השקילה, תוך הקפדה על דיוק של 0.01 מיליליטר. הניחו את דגימת הזרע בסביבה של 37 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 30 דקות, ושאבו אותה לתוך פיפטה חד פעמית מפלסטיק רחבת קדח. אם הזרע אינו נוזל תוך 60 דקות, הוסף כמות שווה של מדיום הפריה. שאפו ונשפו שוב ושוב את התערובת באמצעות פיפטת העברה חד פעמית מפלסטיק עד שהיא מתנזלת לחלוטין. מדוד את ערך ה-pH של הזרע באמצעות נייר בדיקת pH מדויק בטווח של שש עד 10. קח 10 מיקרוליטר זרע נוזלי לחלוטין וטפטף אותו על תא ספירה מקולרי. העריכו את תנועתיות הזרע בשדה 200X באמצעות מיקרוסקופ אופטי. הוסף חמישה מיקרוליטר זרע למיקרו-טיפת מדיום ההפריה בנקודת ההתחלה השמאלית של המסלול בצורת U בצלחת ההפעלה ICSI. התאם את הזווית והמיקום של המחט המחזיקה את הביציות ומחט ההזרקה מתחת לעדשת האובייקט 4X. לאחר אימות ההגדרה, העבר את הביצית שנבחרה לתוך המיקרו-טיפה של המדיום לעיבוד ביציות בצלחת ההפעלה ICSI. הנח את צלחת ההפעלה המכילה את הביציות על השלב החם של מפעיל המיקרוסקופ המוכן. לאחר התאמת המיקוד, הורד את מחט ההזרקה לתוך רצועת ה-PVP של צלחת ההפעלה ICSI. העבר את מחט ההזרקה לרצועה הארוכה בצד ימין של המסלול בצורת U וחלץ זרעונים באיכות גבוהה. העבירו את הזרע לרצועת ה-PVP בצד ימין והניחו את הזרע בתחתית צלחת הניתוח. לחץ בעדינות על מחט ההזרקה בחלק האמצעי או התחתון של זנב הזרע. משוך במהירות את מחט ההזרקה לאחור ושרוט את הזרע כדי לשתק אותו. כעת, שאפו את הזרע מהזנב לראש לתוך מחט ההזרקה. הזרקו לאט זרע לציטופלזמה של הביצית, ודגרו על הביצית המוזרקת. הוסף 1.5 מיליליטר של תמיסת צנטריפוגה בשיפוע בצפיפות של 45% למבחנה תחתונה חרוטית סטרילית של 15 מיליליטר. והוסף לאט לאט 1.5 מיליליטר של תמיסת צנטריפוגה שיפוע בצפיפות של 90% לתחתית תמיסת השיפוע של 45%. כעת, הוסף את הזרע הנוזלי לתמיסת הצנטריפוגה השיפוע, וסובב את הצינור ב -300 גרם למשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. לאחר הסרת הסופרנטנט, אספו כ- 0.5 מיליליטר ממשקעי הזרע שנותרו וערבבו אותו עם שלושה מיליליטר של מדיום הפריה. צנטריפוגה את התערובת בחום של 200 גרם למשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. פיפטה בזהירות את הסופרנטנט, משאיר כ-0.2 מיליליטר משקעים, ואז מנער ומערבב כדי להשעות מחדש את המשקעים. לבסוף, ספרו את ריכוז הזרע והתנועתיות לפני אחסון הדגימה ב-37 מעלות צלזיוס, אינקובטור פחמן דו חמצני 6% לשימוש מאוחר יותר. הנח צינור המכיל 25 מיקרוליטר של תמיסת אגרוז עם נקודת התכה נמוכה לאמבט מים של 90 עד 100 מעלות צלזיוס למשך דקה עד שתיים. לאחר מכן העבירו את הצינור לאמבט מים של 37 מעלות צלזיוס למשך חמש דקות עד שהטמפרטורה מתייצבת. הוסף שלושה עד 10 מיקרוליטר זרע לצינורות אגרוז בנקודת התכה נמוכה וערבב היטב. זרוק 30 מיקרוליטר מהתערובת על שקופית זכוכית שטופלה מראש במצב אופקי. לאחר הכיסוי, הכניסו את שקופית הזכוכית המטופלת מראש למקרר בטמפרטורה של שתיים עד שמונה מעלות צלזיוס למשך ארבע דקות, והבטיחו שהיא תישאר במצב אופקי. הוציאו את השקופית מהמקרר והחליקו בעדינות את זכוכית הכיסוי. טבלו במהירות את מגלשת הזכוכית המטופלת מראש בתמיסת דנטורציה למשך שבע דקות. הסר את השקופית והפוך אותה לזקופה. לאחר מכן השתמש בנייר סינון כדי לספוג עודפי טיפות מים מבלי לגעת באזור הדגימה. שטפו את השקופית במים מזוקקים למשך חמש שניות. טבלו את מגלשת הזכוכית באופן סדרתי בפתרונות המתאימים לתקופה הספציפית. לאחר מכן שמור על שקופית הזכוכית המטופלת מראש אופקית, הוסף כמיליליטר אחד מתמיסת הצבע המעורב על השקופית. לאחר מכתים במשך חמש דקות, יש לשטוף בעדינות את שקופית הזכוכית הצבעונית במים מזוקקים 10 עד 15 פעמים. זרע איכותי עם תנועתיות מתקדמת טובה שחה בצורה חלקה לאורך קצה המסלול בצורת U, מה שהקל על מחט הזרקת הזרע התוך-ציטופלזמית לתפוס אותם בנפרד. בעוד שזרע טוב הושג בשתי השיטות, מדד פיצול ה-DNA של זרע באיכות גבוהה שהופרד בשיטת צנטריפוגה של שיפוע צפיפות היה גבוה משמעותית בהשוואה לשיטת השחייה האופקית בצורת U.