Name: הזרקה תוך-מותנית של וקטורים של ריפוי גנטי למיקוד מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-16T12:10:00.000+00:00
Duration: 5 min 9 s
Description: חקור שיטת הזרקה תוך-מותנית לטיפול גנטי במחלות נוירולוגיות נדירות בעכברים וחולדות. הפרוטוקול מאפשר מסירה יעילה של וקטורים לתוך מערכת העצבים המרכזית למחקר טרום-קליני.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<ol><li>Deverman, B. E., Ravina, B. M., Bankiewicz, K. S., Paul, S. M., Sah, D. W. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+therapy+for+neurological+disorders%3A+Progress+and+prospects%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Gene therapy for neurological disorders: Progress and prospects.</a> Nat Rev Drug Discov. 17 (9), 641-659 (2018).</li>
<li>Pupo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV+vectors%3A+The+Rubik%27s+cube+of+human+gene+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther%22%5BJournal%5D)">AAV vectors: The Rubik's cube of human gene therapy.</a> Mol Ther. 30 (12), 3515-3541 (2022).</li>
<li>Ling, Q., Herstine, J. A., Bradbury, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV-based+in+vivo+gene+therapy+for+neurological+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">AAV-based in vivo gene therapy for neurological disorders.</a> Nat Rev Drug Discov. 22 (10), 789-806 (2023).</li>
<li>Lykken, E. A., Shyng, C., Edwards, R. J., Rozenberg, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+and+considerations+for+AAV+gene+therapies+targeting+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurodev+Disord%22%5BJournal%5D)">Recent progress and considerations for AAV gene therapies targeting the central nervous system.</a> J Neurodev Disord. 10 (1), 16(2018).</li>
<li>Hocquemiller, M., Giersch, L., Audrain, M., Parker, S., Cartier, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+virus-based+gene+therapy+for+CNS+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated virus-based gene therapy for CNS diseases.</a> Hum Gene Ther. 27 (7), 478-496 (2016).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodistribution+of+adeno-associated+virus+gene+therapy+following+cerebrospinal+fluid-directed+administration%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Biodistribution of adeno-associated virus gene therapy following cerebrospinal fluid-directed administration.</a> Hum Gene Ther. 34 (3-4), 94-111 (2023).</li>
<li>Corning, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+anesthesia+and+local+medication+of+the+cord%5BTitle%5D)+AND+%22NY+Med.+J%22%5BJournal%5D)">Spinal anesthesia and local medication of the cord.</a> NY Med. J. , 483-485 (1885).</li>
<li>Hylden, J. L., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+morphine+in+mice%3A+A+new+technique%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Intrathecal morphine in mice: A new technique.</a> Eur J Pharmacol. 67 (2-3), 313-316 (1980).</li>
<li>Fairbanks, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spinal+delivery+of+analgesics+in+experimental+models+of+pain+and+analgesia%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Drug+Deliv+Rev%22%5BJournal%5D)">Spinal delivery of analgesics in experimental models of pain and analgesia.</a> Adv Drug Deliv Rev. 55 (8), 1007-1041 (2003).</li>
<li>Choi, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-frequency+ultrasound-guided+intrathecal+injections+in+a+young+mouse+model%3A+Targeting+the+central+nervous+system+in+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">High-frequency ultrasound-guided intrathecal injections in a young mouse model: Targeting the central nervous system in drug delivery.</a> J Neurosci Methods. 386, 109778(2023).</li>
<li>Li, D., Li, Y., Tian, Y., Xu, Z., Guo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+intrathecal+injection+of+recombinant+adeno-associated+viruses+in+adult+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Direct intrathecal injection of recombinant adeno-associated viruses in adult mice.</a> J Vis Exp. 144, e58565(2019).</li>
<li>Njoo, C., Heinl, C., Kuner, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+SiRNA+transfection+and+gene+knockdown+in+spinal+cord+via+rapid+noninvasive+lumbar+intrathecal+injections+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">In vivo SiRNA transfection and gene knockdown in spinal cord via rapid noninvasive lumbar intrathecal injections in mice.</a> J Vis Exp. 85, e51229(2014).</li>
<li>Vulchanova, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+adeno-associated+virus-mediated+gene+transfer+to+sensory+neurons+following+intrathecal+delivery+by+direct+lumbar+puncture%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Pain%22%5BJournal%5D)">Differential adeno-associated virus-mediated gene transfer to sensory neurons following intrathecal delivery by direct lumbar puncture.</a> Mol Pain. 6, 31(2010).</li>
<li>Yaksh, T. L., Rudy, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chronic+catheterization+of+the+spinal+subarachnoid+space%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Behav%22%5BJournal%5D)">Chronic catheterization of the spinal subarachnoid space.</a> Physiol Behav. 17 (6), 1031-1036 (1976).</li>
<li>Mestre, C., Pelissier, T., Fialip, J., Wilcox, G., Eschalier, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+method+to+perform+direct+transcutaneous+intrathecal+injection+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Toxicol+Methods%22%5BJournal%5D)">A method to perform direct transcutaneous intrathecal injection in rats.</a> J Pharmacol Toxicol Methods. 32 (4), 197-200 (1994).</li>
<li>Donsante, A., Rasmussen, S. A., Fridovich-Keil, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+vector+delivery+in+juvenile+rats+via+lumbar+cistern+injection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intrathecal vector delivery in juvenile rats via lumbar cistern injection.</a> J Vis Exp. 205, e66463(2024).</li>
<li>Lu, X., Jiang, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+injection+of+newborn+mouse+for+genome+editing+and+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Intrathecal injection of newborn mouse for genome editing and drug delivery.</a> J Vis Exp. 205, e65761(2024).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+AAV9%2FAP4M1+gene+therapy+for+hereditary+spastic+paraplegia+50+shows+safety+and+efficacy+in+preclinical+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Intrathecal AAV9/AP4M1 gene therapy for hereditary spastic paraplegia 50 shows safety and efficacy in preclinical studies.</a> J Clin Invest. 133 (10), JCI164575(2023).</li>
<li>Deschenes, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemical+correction+of+GM2+ganglioside+accumulation+in+AB-variant+GM2+gangliosidosis%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Biochemical correction of GM2 ganglioside accumulation in AB-variant GM2 gangliosidosis.</a> Int J Mol Sci. 24 (11), ijms24119217(2023).</li>
<li>Hwang, S. M., Rahman, M. M., Go, E. J., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specific+transcription+factors+Ascl1+and+Lhx6+attenuate+diabetic+neuropathic+pain+by+modulating+spinal+neuroinflammation+and+microglial+activation+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Pharmacother%22%5BJournal%5D)">Specific transcription factors Ascl1 and Lhx6 attenuate diabetic neuropathic pain by modulating spinal neuroinflammation and microglial activation in mice.</a> Biomed Pharmacother. 173, 116392(2024).</li>
<li>Kagiava, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+replacement+therapy+in+two+Golgi-retained+CMT1X+mutants+before+and+after+the+onset+of+demyelinating+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Gene replacement therapy in two Golgi-retained CMT1X mutants before and after the onset of demyelinating neuropathy.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 30, 377-393 (2023).</li>
<li>Wong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS-dominant+human+FMRP+isoform+rescues+seizures%2C+fear%2C+and+sleep+abnormalities+in+Fmr1-KO+mice%5BTitle%5D)+AND+%22JCI+Insight%22%5BJournal%5D)">CNS-dominant human FMRP isoform rescues seizures, fear, and sleep abnormalities in Fmr1-KO mice.</a> JCI Insight. 8 (11), 169650(2023).</li>
<li>Laoharawee, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prevention+of+neurocognitive+deficiency+in+mucopolysaccharidosis+type+ii+mice+by+central+nervous+system-directed%2C+AAV9-mediated+iduronate+sulfatase+gene+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Prevention of neurocognitive deficiency in mucopolysaccharidosis type ii mice by central nervous system-directed, AAV9-mediated iduronate sulfatase gene transfer.</a> Hum Gene Ther. 28 (8), 626-638 (2017).</li>
<li>Aanonsen, L. M., Wilcox, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phencyclidine+selectively+blocks+a+spinal+action+of+N-methyl-D-aspartate+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Phencyclidine selectively blocks a spinal action of N-methyl-D-aspartate in mice.</a> Neurosci Lett. 67 (2), 191-197 (1986).</li>
<li>Bailey, R. M., Armao, D., Nagabhushan Kalburgi, S., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+intrathecal+AAV9+Gene+therapy+for+giant+axonal+neuropathy%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Development of intrathecal AAV9 Gene therapy for giant axonal neuropathy.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 9, 160-171 (2018).</li>
<li>Bailey, R. M., Rozenberg, A., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+high-dose+intracisterna+magna+and+lumbar+puncture+intrathecal+delivery+of+AAV9+in+mice+to+treat+neuropathies%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">Comparison of high-dose intracisterna magna and lumbar puncture intrathecal delivery of AAV9 in mice to treat neuropathies.</a> Brain Res. 1739, 146832(2020).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AAV9%2FMFSD8+gene+therapy+is+effective+in+preclinical+models+of+neuronal+ceroid+lipofuscinosis+type+7+disease%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">AAV9/MFSD8 gene therapy is effective in preclinical models of neuronal ceroid lipofuscinosis type 7 disease.</a> J Clin Invest. 132 (5), JCI146286(2022).</li>
<li>Karumuthil-Melethil, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intrathecal+administration+of+AAV%2FGALC+vectors+in+10-11-day-old+twitcher+mice+improves+survival+and+is+enhanced+by+bone+marrow+transplant%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Res%22%5BJournal%5D)">Intrathecal administration of AAV/GALC vectors in 10-11-day-old twitcher mice improves survival and is enhanced by bone marrow transplant.</a> J Neurosci Res. 94 (11), 1138-1151 (2016).</li>
<li>Ling, Q., Rioux, M., Hu, Y., Lee, M., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adeno-associated+viral+vector+serotype+9-based+gene+replacement+therapy+for+SURF1-related+Leigh+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Methods+Clin+Dev%22%5BJournal%5D)">Adeno-associated viral vector serotype 9-based gene replacement therapy for SURF1-related Leigh syndrome.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 23, 158-168 (2021).</li>
<li>Sinnett, S. E., Boyle, E., Lyons, C., Gray, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineered+microRNA-based+regulatory+element+permits+safe+high-dose+miniMECP2+gene+therapy+in+Rett+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Engineered microRNA-based regulatory element permits safe high-dose miniMECP2 gene therapy in Rett mice.</a> Brain. 144 (10), 3005-3019 (2021).</li>
<li>Rahman, M. M., Lee, J. Y., Kim, Y. H., Park, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Epidural+and+Intrathecal+Drug+Delivery+in+Rats+and+Mice+for+Experimental+Research%3A+Fundamental+Concepts%2C+Techniques%2C+Precaution%2C+and+Application%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedicines%22%5BJournal%5D)">Epidural and Intrathecal Drug Delivery in Rats and Mice for Experimental Research: Fundamental Concepts, Techniques, Precaution, and Application.</a> Biomedicines. 11 (5), 11051413(2023).</li>
<li>Allen, C. H., Ward, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evidence-based+approach+to+management+of+increased+intracranial+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Crit+Care+Clin%22%5BJournal%5D)">An evidence-based approach to management of increased intracranial pressure.</a> Crit Care Clin. 14 (3), 485-495 (1998).</li>
<li>Belov, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large-volume+intrathecal+administrations%3A+Impact+on+CSF+pressure+and+safety+implications%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Large-volume intrathecal administrations: Impact on CSF pressure and safety implications.</a> Front Neurosci. 15, 604197(2021).</li>
<li>Moazen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intracranial+pressure+changes+during+mouse+development%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomech%22%5BJournal%5D)">Intracranial pressure changes during mouse development.</a> J Biomech. 49 (1), 123-126 (2016).</li>
<li>Rieselbach, R. E., Di Chiro, G., Freireich, E. J., Rall, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Subarachnoid+distribution+of+drugs+after+lumbar+injection%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Subarachnoid distribution of drugs after lumbar injection.</a> N Engl J Med. 267, 1273-1278 (1962).</li>
<li>Pardridge, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CSF%2C+blood-brain+barrier%2C+and+brain+drug+delivery%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Opin+Drug+Deliv%22%5BJournal%5D)">CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery.</a> Expert Opin Drug Deliv. 13 (7), 963-975 (2016).</li>
<li>Ghersi-Egea, J. F., Babikian, A., Blondel, S., Strazielle, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+the+cerebrospinal+fluid+circulatory+system+of+the+developing+rat%3A+quantitative+volumetric+analysis+and+effect+on+blood-CSF+permeability+interpretation%5BTitle%5D)+AND+%22Fluids+Barriers+CNS%22%5BJournal%5D)">Changes in the cerebrospinal fluid circulatory system of the developing rat: quantitative volumetric analysis and effect on blood-CSF permeability interpretation.</a> Fluids Barriers CNS. 12, 8(2015).</li>
</ol>

הזרקת ה-IT המותני היא הליך מהיר וזעיר פולשני המעביר באופן אמין וקטור טיפול גנטי לתוך ה-CSF לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית 5,6. ההליך רלוונטי מבחינה תרגמית, והפרוטוקול המתואר כאן מפרט כיצד לבצע דרך מתן זו בעכברים וחולדות בכל הגילאים, מיילודים ועד בוגרים. חשוב להגדיר פרוטוקול זה עבור עכברים וחולדות בכל הגילאים, יחד עם מתן סרטונים תומכים, כדי לסייע לחוקרים באימוץ שיטה זו למתן ריפוי גנטי. הניסיון של המעבדה שלנו הוא שניתן ליישם פרוטוקול זה באופן עקבי על משתמשים מרובים ומחקרים לאורך זמן 18,25,26,27,28,29,30.
ישנם הבדלים חשובים בעת ביצוע הזרקת IT מותני בעכברים/חולדות צעירים יותר בהשוואה לעכברים/חולדות מבוגרים יותר, בעיקר הזווית שבה המחט מוחדרת לעמוד השדרה והנפח המומלץ המוזרק. נפחי הזרקת ה-IT המותניים המדווחים משתנים במידה ניכרת בין מחקרים ובין מינים31. התחשבות בנפח ההזרקה חשובה כדי למנוע עליות ארוכות טווח בלחץ התוך גולגולתי (ICP), שעלולות לפגוע בזרימת CSF ודם מוחי, לגרום לאי נוחות ולהוביל לסיבוכים נוירולוגיים כרוניים, כולל הידרוצפלוס, איסכמיה, פגיעה תאית ומוות32,33. ICP נקבע על ידי נפח ה-CSF, הדם המוחי ורקמת ה-CNS, שלא ניתן לתאם ישירות למשקל הגוף. בתפקוד תקין, ה-ICP מווסת אוטומטית על ידי גורמים רבים, כולל נפח CSF, נפח דם מוחי, נשימה, תנוחת גוף, קצב ייצור CSF וקצב ניקוז CSF לדם 33,34. לכן יש לקבוע את נפחי הזרקת ה-IT על סמך מאפייני CSF (טבלה 1) במקום משקל גוף 25,27,28,30. נפחים מומלצים להזרקה בכל גיל בכל מין מצוינים בהדגשה.
<table border="1" fo:font-size="8px" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td colspan="5">נפח הזרקת IT</td>
			<td colspan="4">ערכי CSF למבוגרים</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>P0-1 (מיקרוליטר)</td>
			<td>P5-7 (מיקרוליטר)</td>
			<td>P10 (מיקרוליטר)</td>
			<td>&gt;P21 (מיקרוליטר)</td>
			<td>נפח כולל (μL)</td>
			<td>קצב ייצור (מיקרוליטר לדקה)</td>
			<td>מחזור (ח)</td>
			<td>לחץ תוך גולגולתי (מ"מ כספית)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>עכברים</td>
			<td>3</td>
			<td>5</td>
			<td>5-10</td>
			<td>5-20</td>
			<td>30-4025,30</td>
			<td>0.32-0.3525,30</td>
			<td>1.7-225,30</td>
			<td>5.0 +/- 0.528</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>חולדות</td>
			<td>5</td>
			<td>5-10</td>
			<td>10-30</td>
			<td>10-200 (20-75)</td>
			<td>15025</td>
			<td>1.7-2.825</td>
			<td>2-2.6625</td>
			<td>8.6 +/- 1.7,27</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
טבלה 1: סיכום נפחי הזרקת IT מותני לעכברים וחולדות בגילאים שונים. ערכים מודגשים מומלצים ונמסרו בבטחה. הנפחים המרביים האפשריים לא הוערכו רשמית. מידע נוסף על פרמטרים ידועים של CSF - נפח כולל, קצב ייצור, תחלופה ולחץ תוך גולגולתי - בעכברים וחולדות כלול לעיון.
קיים חוסר ידע ברחבי התחום לגבי הסף העליון לנפחי הזרקת IT בולוס חד פעמיים. בבני אדם בוגרים, חולדות ועכברים שבהם נפח CSF ידוע, נראה כי עלייה של 30% בנפח ה-CSF הכולל אינה גורמת לפציעה כרונית או למחלות 31,33,35,36. היעדר נפחי CSF ידועים בעכברים צעירים או יילודים הופך אקסטרפולציה דומה לבלתי אפשרית. קבוצות מסוימות מתחילות להסתכל על נפח וייצור CSF בבעלי חיים צעיריםיותר 37. עד שיוכחו חקירות נוספות בתחומים אלה, נפח ההזרקה ימשיך להיות כפוף לערכים המדווחים על ידי החוקרים.
עכברים וחולדות, במיוחד כאשר הם מטופלים בגילאים צעירים יותר או עם נפחי הזרקה גבוהים, עלולים לעורר כיפוף שרירים, הארכת גפיים, נשימה מהירה או שיתוק זמני בגפיים האחוריות שאמור להיפתר מעצמו תוך מספר דקות. במקרים קיצוניים, עלייה חריפה ב-ICP עלולה לגרום להפרעות לב וכלי דם ונשימה, שעלולות להיות קטלניות32,33. אם חריגות כלשהן לאחר ההליך נמשכות לאחר 24 שעות, יש להוציא את העכברים/חולדות מהמחקר ולהמית אותם בהמתת חסד אנושית. שיתוק מתמשך בגפיים האחוריות יכול להתרחש אם המחט מוחדרת רחוק מדי, ומשפיעה על חוט השדרה. זה יכול לנבוע מטעות נפוצה בעת ביצוע הזרקת IT מותני: תנועת המזרק לאחר החלקת הזנב תוך כדי לחיצה על הבוכנה. יש להימנע מתנועת מזרק ומחט. אם לא ניתן להשיג את המיקום הנכון עם הפנצ'ר הראשוני, ניתן לבצע ניסיון שני באותו מיקום. אם גם הניסיון השני לא מצליח, נסה לשנות את מיקום המחט כדי למקד לחלל הבין חולייתי הבא. שימו לב שמספר דקירות מחט עלול להוביל לדליפה של הזרקה מוצלחת לאחר מכן.
להיות מיומן בהזרקת IT מותני יכול לקחת זמן. כדי לתרגל את ההזרקות כהליך טרמינלי, עקוב אחר הפרוטוקול לעיל באמצעות תמיסת צבע מאושרת, כגון כחול אוונס או צבע ירוק מקורמיק מסונן 0.2 מיקרון (איור 3) או עם התרופות המטופלות בסעיף התוצאות המייצגות. מומלץ להשתמש בצבע כדי לפתור בעיות ולשלוט בהזרקה מכיוון שקל לדעת אם ההזרקה הייתה הצלחה או כישלון תוך דקה אחת. תרגול עם צבע הוא להליכים שאינם הישרדות בלבד, מכיוון שבעלי חיים יכולים לפתח תגובה לצבע כאשר הם ניתנים ישירות למערכת העצבים המרכזית. תגובה זו יכולה להתרחש תוך דקה מהזרקה מוצלחת ומאופיינת בתנועות גירוד והתפתלות מהירות. יש להמית את בעלי החיים מיד לאחר שנצפתה תגובה זו כדי למזער את אי הנוחות. לאחר הזרקת צבע מוצלחת, הצבע יישאר ממוקם בעמוד השדרה (ללא צבע ברקמה ההיקפית הסמוכה), ויעבור במעלה עמוד השדרה אל המוח הקטן, המוח הקטן ונורות הריח. ב-P1, העור שקוף מספיק כך שניתן לראות את הצבע נע במורד עמוד השדרה בזנב. אם הצבע לא מגיע למוח תוך מספר דקות, ההזרקה נכשלת.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig03.jpg"> 
איור 3: צבע ירוק מקורמיק במוח לאחר תרגול מוצלח של הזרקות IT מותני. כל המוחות הם מעכברי P21 שהוזרקו להם צבע של 5 מיקרוליטר ומוצגים במבט הגחוני. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
למידע נוסף על פרמטרים רלוונטיים הקשורים לתכנון ניסויים פרה-קליניים, כמו טיטר ומינונים ויראליים, ראה סקירות שפורסמו בעבר 3,6,31.

<table><tbody><tr><td>מסנן 0.2 מיקרון</td><td>מדעי מיקרוסקופיה אלקטרונית</td><td>67005</td><td>משמש לסינון תמיסת צבע</td></tr><tr><td>0.5 עד 10 ומיקרו; L פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>TI13690026</td><td>משמש למדידת תמיסת הזרקה</td></tr><tr><td>1.5 מ"ל מיקרו-צינור</td><td>אפנדורף</td><td>22364111</td><td>משמש לאחסון תמיסות הזרקה</td></tr><tr><td>10 ומיקרו; L מזרק</td><td>המילטון</td><td>7635-01</td><td>נפח ההזרקה לא צריך להיות פחות מ-10% מקיבולת המזרק</td></tr><tr><td>10 עד 100 ומיקרו; L פיפטה</td><td>אפנדורף</td><td>TI13690029</td><td>משמש למדידת תמיסת הזרקה</td></tr><tr><td>10&micro; l טיפים לפיפטה</td><td>ארה"ב סיינטיפיק בע"מ</td><td>11203810</td><td>משמש למדידת תמיסת הזרקה</td></tr><tr><td>100 ומיקרו; L מזרק</td><td>המילטון</td><td>7638-01</td><td>לחולדה >21 בלבד. נפח ההזרקה לא צריך להיות פחות מ-10% מקיבולת המזרק</td></tr><tr><td>100 ומיקרו; L טיפים לפיפטה</td><td>ארה"ב סיינטיפיק בע"מ</td><td>11231840</td><td>משמש למדידת תמיסת הזרקה</td></tr><tr><td>25 ומיקרו; מזרק L</td><td>המילטון</td><td>7636-01</td><td>אידיאלי עבור 5-10 ומיקרו; זריקות L. נפח ההזרקה לא צריך להיות פחות מ-10% מקיבולת המזרק</td></tr><tr><td>27 מחטי מד</td> <td>המילטון</td><td>7803-01</td><td>לחולדה >21 בלבד. מד 27, מחט RN רכזת קטנה, 1 אינץ', סגנון נקודה 4 ב-12&deg;, 6/PK</td></tr><tr><td>30 מד מחט(ים)</td><td>המילטון</td><td>7803-17</td><td>מד 30, מחט RN רכזת קטנה, 0.5 אינץ', סגנון נקודה 4 ב-12&deg;, 6/PK</td></tr><tr><td>50 ומיקרו; L מזרק</td><td>המילטון</td><td>7637-01</td><td>לחולדה >21 בלבד. נפח ההזרקה לא צריך להיות פחות מ-10% מקיבולת המזרק</td></tr><tr><td>70% אתנול</td><td>Pharmco</td><td>111000140</td><td>משמש לחיטוי סביבת עבודה וציוד</td></tr><tr><td>70% רפידות הכנה לאלכוהול איזופרופיל</td><td>PDI</td><td>B60307</td><td>משמש להכנת משכך</td>כאבים</tr><tr><td></td><td></td><td></td> באתר הזרקה <td>לחולדה >21 בלבד.</td></tr><tr><td>הרדמה (איזופלורן)</td><td>Piramal טיפול נמרץ</td><td>66794001725</td><td>לחולדות >21 בלבד.</td></tr><tr>מוצרי <td>Betadine</td><td>Purdue</td><td>6906606</td><td>לחולדות >21 בלבד. משמש להכנת העור</td></tr><tr><td>פתרון</td><td></td><td></td> בקרת <td>תמיסת הזרקת</td></tr><tr><td>תמיסת צבע (ירוק)</td><td>מקורמיק</td><td></td><td>לתרגול, ללא הישרדות בלבד</td></tr><tr><td>כפפות</td><td>קימברלי-קלארק</td><td>19-149-863B</td><td>PPE</td></tr><tr><td>דלי קרח עם קרח</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>03-395-150</td><td>שמור על תמיסת וקטור ויראלית על קרח&nbsp;</td></tr><tr><td>מלקחיים נגד יתושים (מעוקלים או ישרים)</td> <td>כלי מדע עדינים</td><td>13009-12</td><td>לחולדה >21 בלבד. משמש למישוש החלל הבין חולייתי.</td></tr><tr><td>מחזיקי מחטים</td><td>כלים מדעיים עדינים</td><td>12002-12</td><td>לחולדה >21 בלבד. משמש לסגירת עור עם תפר</td></tr><tr><td>מגבת נייר</td><td>ברקשייר</td><td>18-998-123</td><td>משמש לריסון עכברים בוגרים במהלך ההזרקה</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td></td><td>StatLab PM996</td><td>משמש לשאיבת תמיסה למזרק</td></tr><tr><td>Retractors</td><td>Stoelting</td><td>52124P</td><td>לחולדה >21 בלבד. משמש להחזקת חתך פתוח בעור</td></tr><tr><td>Scalpel Blade</td><td>Fine Science Tools</td><td>10015-00</td><td>לחולדות >21 בלבד. משמש לחתך</td></tr><tr><td>ידית להב אזמל</td><td>Fine Science Tools</td><td>10003-12</td><td>לחולדה >21 בלבד. משמש לחתך</td></tr><tr><td>מזרק סטרילי</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-459</td><td>משמש לסינון תמיסת צבע</td></tr><tr><td>קרצוף כירורגי (הכנת עור)</td> <td>Medline Industries Inc.</td><td>MDS098720</td><td>לחולדה >21 בלבד. משמש להכנת עור</td></tr>, <tr><td>תפרים או קליפסים לפצע</td><td></td><td>50483</td><td>לחולדות >21 בלבד. משמש לסגירת העור.</td></tr><tr><td>תמיסת ניקוי מזרק / מחט</td><td>המילטון</td><td>18311</td><td>יכול להשתמש בתמיסת ניקוי חלופית</td></tr><tr><td>מלקחיים אגודל</td><td>Fine Science</td><td>Tools 11019-12</td><td>לחולדה >21 בלבד. משמש לאורך כל הגישה הכירורגית והסגירה</td></tr><tr><td>פתרון הזרקת</td> <td>פתרון וקטור</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

הזרקה תוך-מותנית של וקטורים של ריפוי גנטי למיקוד מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות

Lumbar Intrathecal Injection of Gene Therapy Vectors for Central Nervous System Targeting in Mice and Rats

למרות שגורמים רבים יכולים להשפיע על התמרת וקטור ריפוי גנטי, צביעה היסטולוגית של רקמות נותרה השיטה המדויקת ביותר לקביעת ההצלחה של זריקות תוך-מותניות (IT). פיזור רחב ואחיד של וקטור הריפוי הגנטי בתוך מערכת העצבים המרכזית (CNS) לאחר ההזרקה מעיד על הליך מוצלח. איור 2C מייצג הזרקה מוצלחת של טיפול גנטי משלים עצמי בתיווך AAV9 המניע ביטוי טרנסגנים חלש בכל מקום תחת מקדם JeT במינון של 1.3 ×10 11 vg לעכבר בעכברים יילודים (P1), 4 חודשים לאחר ההזרקה. ניתוח RNAscope, באמצעות בדיקה המכוונת לטרנסגן המועבר על ידי הטיפול הגנטי, חושף פיזור רחב בחוט השדרה המותני, חוט השדרה הצווארי והמוח. חלק מהכבד והלב כלול כדי להדגיש שאפילו עם הזרקה ישירה של נוזל המוח השדרתי (CSF), וקטור הריפוי הגנטי עדיין יכול להיות מופץ לרקמות היקפיות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67138/67138fig02.jpg"> 
איור 2: קטעי רקמה מוכתמים של 5 מיקרון של מערכת העצבים המרכזית של העכבר ורקמה היקפית 4 חודשים לאחר ההזרקה ב-P1. צביעה אדומה מצביעה על ביטוי טרנסגנים באמצעות RNAscope, וצביעה כחולה של גרעינים נעשית באמצעות המטוקסילין. (A) הזרקה עם מאגר ניסוח בקרה. (B) הזרקה תוך-פרנכימלית לא מוצלחת עם וקטור AAV9 (scAAV9_JeT-h DDX3Xopt-SpA). (C) הזרקת IT מותנית מוצלחת עם וקטור AAV9 (scAAV9_JeT-hDDX3Xopt-SpA). וקטור הריפוי הגנטי המשמש ב-(B) ו-(C) ניתן במינון רלוונטי לתרגום של 1.3E11 vg/עכבר. סרגל קנה מידה: פאנל עליון (5 מ"מ); לוח תחתון (1 מ"מ). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67138/67138fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
ביטוי מרוכז בחוט השדרה המותני בשילוב עם חוסר ביטוי במוח, כפי שמוצג באיור 2B, עשוי להצביע על הזרקה תוך-פרנכימלית של חוט השדרה ויש להתייחס אליו כזריקה כושלת. זה קורה כאשר המחט מוחדרת רחוק מדי לתוך עמוד השדרה, מעבר לחלל התוך-תקלי ולתוך חוט השדרה. בנוסף, ביטוי נמוך מאוד או ללא ביטוי בחוט השדרה ובמוח (לא מוצג) צריך להיחשב גם כזריקה כושלת מחוץ למטרה, בהנחה שנעשה שימוש בווקטור ומינון כאשר צפויה התפלגות רחבה של מערכת העצבים המרכזית. זה יכול להיות בגלל אי החדרת המחט מספיק רחוק או מהיותה לרוחב לקו האמצע.
דפוסי הביטוי שנצפו מהזרקות מוצלחות יכולים להיות שונים בשל שמונת הגורמים הבאים כדוגמאות: (1) גיל בעת ההזרקה, (2) חסינות קיימת, (3) קצב עירוי, (4) וקטור טיפול גנטי, (5) מינון של טיפול גנטי, (6) חלבונים על פני התא, (7) טרופיזם, ו-(8) אם רלוונטי, בחירת מקדם מתאימה להנעת ביטוי טרנסגנים6. בעוד שדפוסי הביטוי יכולים להיות שונים, התפוצה הרחבה, האחידה והנרחבת תהיה אוניברסלית כל עוד המינון גבוה מספיק עם וקטור יעיל, כגון AAV9.
המגבלות העיקריות של שימוש בניתוח היסטולוגי כדי לאשר את הצלחת הזרקת ה-IT המותני הן זמני ההמתנה הארוכים - המתנה לסוף המחקר, לאחר ביצוע נתיחות ואיסוף רקמות - ומשאבים נרחבים הדרושים לעיבוד רקמה מכל העכברים במחקר ריפוי גנטי גדול. למרבה הצער, הניסיון שלנו מלמד שאינדיקטורים מיידיים וישירים לזריקה חיובית או שלילית יכולים להיות לא אמינים; עם זאת, רפלקס תנועת הזנב כאשר המחט נכנסת לחלל התוך-תקלי הוא אינדיקטור טוב למיקום מוצלח בזמן אמת וככל הנראה מעיד על הזרקה מוצלחת. אל תבלבלו עווית כאשר המחט חודרת את העור בעכבר/חולדה לא מורדמת עם תגובת תנועת זנב למחט הנכנסת לחלל התוך-תקלי. דווח כי השימוש בתרופות פרמקולוגיות כגון NMDA, חומר P ולידוקאין, בין אם באימונים או בשילוב עם תמיסת ההזרקה הניסיונית, מספק אינדיקציה מיידית יותר להצלחת ההזרקה 9,11,24. אם בוחנים חומרים אלה, חשוב להעריך את תאימותם לווקטור הטיפול הגנטי.

One method to target the central nervous system for treating neurological diseases involves utilizing the lumbar intrathecal route of administration. This ...

lumbar-intrathecal-injection-gene-therapy-vectors-for-central-nervous

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

מקור: Chen, Y., et al. אספקה תוך-תקלית של אוליגונוקלאוטידים אנטיסנס במערכת העצבים המרכזית של החולדה. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את העברת תרכובת הבדיקה לנוזל המוח השדרתי (CSF) דרך קטטר המושתל בעמוד השדרה המותני של מודל חולדה. התרכובת מסתובבת לאורך ה- CSF למוח ולחוט השדרה, נכנסת לתאי עצב ומציעה פוטנציאל טיפולי.

אספקה תוך-תקלית של תרכובת בדיקה למערכת העצבים המרכזית של החולדה

מקור: Li, D., et al. הזרקה תוך-תקלית ישירה של נגיפים רקומביננטיים הקשורים לאדנו בעכברים בוגרים. J. Vis. Exp. (2019)סרטון זה מדגים את הליך ההזרקה התוך-תקלית של נגיפים הקשורים לאדנו (AAV) לנוזל המוח (CSF) של עכבר ער, המכסה הכנת מזרק, יישור עמוד השדרה והחדרת מחט מדויקת. שיטה זו מאמתת העברת גנים ממוקדת, ותומכת בפוטנציאל שלה לטיפולים במערכת העצבים המרכזית.

העברה תוך-תקלית של וירוסים במודל עכבר לטיפול במחלות מערכת העצבים המרכזית

וקטורים ויראליים לאפשר למניפולצית גן ממוקדת. אנחנו מדגימים את שיטה לביטוי גנים מותנים או אבלציה בחוט שדרת העכבר, באמצעות הזרקת stereotaxic של וקטור ויראלי לקרן האחורית, אתר בולט של קשר הסינפטי בין afferents החושיים הראשוניים ועצב של מערכת העצבים המרכזית.

הזרקת Stereotaxic של וקטור ויראלי למניפולציה גנטית מותנית בחוט השדרה המאוס

דו"ח זה מתאר טכניקה פשוטה ומהירה של נקב מחט intrathecal עבור transfection מקומי של siRNA בחוט השדרה המותני בעכבר תחת הרדמה קצרה אור בר קיימא.

בVivo siRNA Transfection וג&#39;ין מציאה בחוט השדרה באמצעות ראפיד פולשנית מותני intrathecal זריקות בעכברים

כאן אנו מציגים טכניקה הזרקה ישירה במחלה באמצעות הידרוכלוריד לידוקאין 1% פתרון ויראלי להבטיח משלוח וירוס יעיל adeno-הקשורים לבעלי חיים קטנים ולהקים מערכת הניקוד לחזות התמרה חושית יעילות המרכזי מערכת העצבים על פי מידת חולשה חולפת הנגרמת על ידי לידוקאין.

במחלה ישירה הזרקה של וירוסים Adeno-הקשורים רקומביננטי בעכברים מבוגרים

פרוטוקול זה מדגים הזרקה של וקטור ויראלי יביל retrogradely לתוך רקמות חוט השדרה חולדה. וקטור שצולמו הסינפסה, מועברים לגוף התא של נוירונים היעד. מודל זה מתאים רטרוגרדית העקיבה של מסלולים בעמוד השדרה חשוב או תאים מיקוד ליישומים טיפול גנטי.

הזרקה ישירה של וקטור Lentiviral מדגיש מספר מסלולים מוטוריים בחוט השדרה עכברוש

כאן, אנו מתארים שיטה להעברת תרופות למערכת העצבים המרכזית העכברוש על ידי שתילת קטטר לתוך החלל המותני הפנימי של עמוד השדרה. אנו מתמקדים במסירת מחלת האנטי-הגיונית, למרות ששיטה זו מתאימה גם לאספקה של שיטות טיפוליות אחרות.

משלוח פנימי של אנטי-סנס וליגונו, במערכת העצבים המרכזית של חולדה

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

מאמר זה מפרט את שיטות המתן התוך-אתקלית לטיפולים ממוקדים במערכת העצבים המרכזית בעכברים בוגרים, תוך התמקדות בדיוק בפרוטוקול ובאפשרות הזרקה חוזרת. הוא כולל ממצאים ממחקר אימות שבו אוליגונוקלאוטידים אנטיסנסיים הפחיתו ביטוי SOD1 מוטנטי בעכברי מודל SOD1-ALS, מה שתומך בתועלת הגישה במחקר פרה-קליני במחלות נוירודגנרטיביות.

הזרקה תוך-ראשית מותנית של SOD1-ASO למטרות מיקוד מדויק במערכת העצבים המרכזית (CNS) ויעילות חיזוי בעכברי ALS בני אדם עם SOD1-G93A

מאמר זה מתאר רצף של אירועים אופטימיזציה עבור דימות multimodal של שתלי הסלולר מכרסם במוח באמצעות: (i) ביולומינציה vivo ו הדמיה באמצעות תהודה מגנטית, ו (ב) הודעה מורטם ניתוח היסטולוגית. השילוב בין שיטות הדמיה על חיה אחת מאפשר הערכה שתל נייד עם רגישות גבוהה רזולוציה, וספציפיות.

Multimodal הדמיה של השתלת תא גזע במערכת העצבים המרכזית של עכברים

חקור שיטת הזרקה תוך-מותנית לטיפול גנטי במחלות נוירולוגיות נדירות בעכברים וחולדות. הפרוטוקול מאפשר מסירה יעילה של וקטורים לתוך מערכת העצבים המרכזית למחקר טרום-קליני.

הזרקה תוך-מותנית של וקטורים של ריפוי גנטי למיקוד מערכת העצבים המרכזית בעכברים וחולדות

גלה סרטונים נוספים