שימוש בבדיקת הזזה תרמית לבדיקת קשירת מצע לסלנופרוטאין O
9 באוגוסט 2024
כאן, אנו מציגים את מבחן השינוי התרמי, טכניקה מבוססת פלואורסצנטיות בעלת תפוקה גבוהה המשמשת לחקר הקישור של מולקולות קטנות לחלבונים בעלי עניין.
אנו שואפים לחקור את הפעילות הביוכימית של חלבונים בעלי תפקידים לא ידועים. קשירת קו-פקטור חיונית לא רק לפעילותם של חלבונים מסוימים, אלא גם עשויה לשנות את יציבותם התרמית. אחד היישומים המעשיים של תופעה זו טמון בניצול השינוי ביציבות התרמית כפי שהיא נמדדת על ידי טמפרטורת ההתכה של החלבון כדי לנתח את קשירת הליגנד.
בדיקת הזזה תרמית היא כלי רב-תכליתי לחקר אינטראקציות חלבונים עם גורמים משלימים או תרופות פוטנציאליים, ולזיהוי תנאי ייצוב לקריסטלוגרפיה. חלק מיתרונותיו על פני שיטות סינון אחרות הם ההתקנה הפשוטה יחסית שלו והתפוקה הגבוהה שלו עם 96 או 384 לוחות באר. Selenoprotein O, או SelO, הוא פסאודוקינאז שמור אבולוציונית המעביר אדנוזין מונופוספט מ- ATP למצעים חלבוניים בשינוי שלאחר התרגום המכונה AMPylation.
בפרוטוקול זה, אנו משתמשים ב-TSA כדי לנתח נוקלאוטיד וקשירת מתכות ל-SelO.
סקירה כללית
מאמר זה מציג את בדיקת ההסחה התרמית (TSA), טכניקה מבוססת פלואורסצנציה עם תפוקה גבוהה לחקר קישור של מולקולות קטנות לחלבונים. ה-TSA שימושית במיוחד לניתוח קישור ליגנדים ולקביעת תנאים מייצבים עבור קריסטלוגרפיה.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- ביוכימיה
- אינטראקציות בין חלבונים
- ניתוח יציבות תרמית
רקע
- קישור של קופקטור חיוני לפעילותם של חלבונים מסוימים.
- שינויים ביציבות תרמית עשויים להעיד על קישור של ליגנד.
- טמפרטורת ההמסה של חלבונים היא מדד מרכזי ב-TSA.
- Selenoprotein O (SelO) הוא פסאודו-קינאז המעורב בתהליך של AMPylation.
מטרת המחקר
- לבחון את הפעילות הביוכימית של חלבונים בעלי תפקודים לא ידועים.
- להשתמש ב-TSA לצורך ניתוח קישור נוקלאוטידים ומתכות ל-SelO.
- לזהות תנאים מייצבים עבור קריסטלוגרפיה של חלבונים.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- בדיקת הסטה תרמית (TSA)
- גילוי מבוסס פלואורסצנציה
- סריקה בסביבה של תפוקה גבוהה עם פלטות של 96 או 384 בארות
- ניתוח קישור ליגנדים באמצעות שינויים ביציבות תרמית
תוצאות עיקריות
- TSA מודדת ביעילות קישור של ליגנדים לחלבונים.
- ניתוח האינטראקציות של SelO עם נוקלאוטידים ומתכות.
- שינויים ביציבות התרמית נמצאו במתאם עם קישור ליגנדים.
- השיטה הדגימה יתרונות על פני טכניקות סריקה מסורתיות.
מסקנות
- בדיקת התזוזה התרמית (thermal shift assay) היא כלי רב-שימושי למחקרי אינטראקציה של חלבונים.
- היא מספקת תובנות לגבי הפעילות הביוכימית של חלבונים.
- TSA יכולה לסייע בזיהוי תנאים מייצבים עבור קריסטלוגרפיה.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית להנהלה
בדיקת תזוזת תרמית (TSA) מאפשרת הערכה מהירה ובעלת תפוקה גבוהה של קישור ליגנדים ויציבות חלבונים, ובכך תומכת באופן ישיר בתהליכי תיקוף יעדים בשלבים מוקדמים ובצמצום סיכונים מכניסטיים בגילוי תרופות בביופארמה. באמצעות כימות האינטראקציות של סובסטרטים וקו-פקטורים עם Selenoprotein O, בדיקת ה-TSA מספקת מידע הן עבור אנוטציה פונקציונלית והן עבור זיהוי תנאים מייצבים למחקרי מבנה המשכיים. גישה זו מגבירה את רמת הוודאות החזויה בנקודות תפנית קריטיות בצינור הגילוי, ובמיוחד עבור חלבונים שפונקציותיהם לא היו ידועות עד כה.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בדיקה ישירה של קישור ליגנדים וקו-פקטורים לחלבונים שאינם מאופיינים.
- תומך בהסרת סיכונים מכניסטית על ידי חשיפת ספציפיות של סובסטרט ותלויות קישור.
- מקל על תיקוף פונקציונלי של מטרות באמצעות שינויים כמותיים ביציבות תרמית.
- מספק נתונים ברי-יישום לצורך מיון תיקים של מטרות חלבון חדשות.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay Development)
- מספק סריקה בthroughput גבוה, מבוססת פלטות, של תנאי ליגנדים מרובים.
- סטנדרטיזציה של פלטי בדיקה באמצעות מדידות כמותיות של טמפרטורת ההמסה.
- מאפשר הערכה הדירה של אינטראקציות בין חלבון לליגנד לצורך מוכנות הבדיקה.
- תומך בזיהוי תנאים אופטימליים למחקרים מבניים ותפקודיים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה ממצאים ביוכימיים לתפקוד חלבון הרלוונטי למחלה כאשר סגוליות הסובסטרט נקבעה.
- מספקת רצף מהשלב של גילוי ועד לתיקוף פרה-קליני עבור מטרות חדשניות.
- מפחיתה את הסיכון לכישלון בשלבים מאוחרים על ידי הבהרת המנגנונים המולקולריים בשלב מוקדם.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
TSA ממוקמת בממשק שבין הגילוי המוקדם לזיהוי המועמד המוביל (lead identification), ובכך היא מאפשרת תיקוף מטרות מונחה-היפותזה ותומכת בפיתוח בדיקות (assays) ובזרימות עבודה של ביולוגיה מבנית בשלבים הבאים.
- ביולוגיה של הגילוי: מכמתה את קישור הליגנד ואת דרישות הקופקטור כדי להבהיר את תפקוד החלבון.
- סריקה: מספקת פלט הניתן להרחבה ולשחזור להערכת תרכובות ותנאים.
- אנליטיקה: מייצרת נתוני טמפרטורת התכה לצורך ניתוח השוואתי בין תנאים ניסיוניים.
- מחקר תרגומי: מגשרת בין אפיון ביוכימי לבחירת מודל פרה-קליני כאשר הדבר רלוונטי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה בעלת יישום רחב עבור מגוון מטרות חלבון ומחלקות ליגנדים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החזוי ומפחית עמימות מכניסטית בבחירת מטרות.
- ערך תפעולי: מייעל את הגדרת הבדיקה, משפר את השחזוריות ותומך בתהליכי עבודה בעלות תפוקה גבוהה.
- ערך אסטרטגי: משפר את קבלת החלטות go/no-go ואת הקצאת ההון על ידי הבהרת הקשרים בין המטרה לליגנד.
- השפעה על פורטפוליו: מאפשר תעדוף של מטרות חדשות מותאם לסיכון, בהתבסס על נתוני קישור כמותיים.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביוכימיה של חלבונים ובתכנון תבחינים מבוססי פלואורסצנציה.
- נדרשת גישה למכשיר real-time PCR או למחזורים תרמיים וקוראי לוחות תואמים.
- דורש פרוטוקולים סטנדרטיים לצורך הדירות בין צוותים ויכולת השוואה של נתונים.
- עשוי לדרוש התאמה למשפחות חלבונים או לסוגי ליגנדים שונים.
- תלוי בטוהר וביציבות החלבון לצורך השגת מדידות מהימנות.
