הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

ייצור עוברים ברי קיימא הוא תהליך מורכב. המטרה הכוללת שלנו היא להגדיר את האותות התאיים המתאמים את המעבר מביצית לעובר. מדווח CaFE הוא כלי חדש שפותח כדי להמחיש אותות סידן המתרחשים בעת ההפריה ובמהלך האמבריוגנזה המוקדמת.

באמצעות מדווח CaFE, גילינו גל סידן מושהה בביציות שביוץ בטרם עת. גילינו גם נוכחות של ארעי סידן חד-תאיים במהלך האמבריוגנזה המוקדמת. שני הממצאים ממחישים את התועלת של אינדיקטור סידן מקודד גנטית במהלך ההתפתחות המוקדמת.

טכניקות קודמות להדמיית ביציות סידן הסתמכו על הזרקת צבע לתוך בלוטת המין. טכניקה זו עתירת עבודה ודורשת ציוד מיקרו-הזרקה מיוחד. מדווח CaFE מאפשר הדמיה קלה של גל הסידן בביציות ובעוברים עם ציוד זמין באופן נרחב.

כתב CaFE מקל על חקירה של התזמון והוויסות של איתות סידן בביציות ובעוברים. ניתן לשלב מדווח זה בקלות עם מוטציות קיימות, סמנים ונוקדאונים של RNAi כדי לחשוף את התנהגות הסידן ביחס לאירועים היסטוריים אחרים במהלך האמבריוגנזה המוקדמת, כגון התבגרות מיוטית. כדי להתחיל, החזק את ידית קיסם התולעים ושחרר את צווארון הכסף לכיוון ראשו כך שארבעת החלקים יתפרקו.

הנח חוט פלטינה בגודל 1.5 אינץ 'באמצע ארבעת החלקים. החזק את החוט במרכז תוך הידוק הצווארון כדי להפגיש את ארבעת החלקים. בעזרת זוג צבת אף שטוח, עצב בזהירות את החוט והדק שוב ושוב את קצה החוט כדי ליצור כמטר של שניים עד שלושה מילימטרים.

השתמש ברגל זו כדי להרים את התולעים. הכינו תמיסה של 3% אגרוז במים וחממו אותה במיקרוגל עד שהאגרוז נמס לחלוטין. הנח שקופית מיקרוסקופ ריקה בין שתי שקופיות מיקרוסקופ אחרות שיש להן שכבה אחת של סרט מעבדה על פני הציר הארוך.

בעזרת פיפטה של מיליליטר אחד, זרוק את תמיסת האגרוז המחוממת של 3% למרכז השקופית הריקה. הנח במהירות שקופית מיקרוסקופ חדשה על טיפת האגרוז, בניצב לשקופית הריקה, כאשר הטיפה מונחת על פני השקופיות המודבקות הסמוכות, ולאחר מכן הפרד בעדינות את השקופיות, תוך שמירה על הרפידה שלמה. בעזרת פיפטה של 20 מיקרוליטר, הוסף טיפה קטנה של לבאמיסול של מילי-מולרית במאגר M9 למרכז כרית האגרוז כדי לשתק את התולעים.

בחר לפחות חמש תולעים מסונכרנות וגע בעדינות ברגל ידית קוטף התולעים לטיפה של הלבמיסול כדי להעביר את התולעים. מכסים בזהירות את כרית האגרוז עם פתק כיסוי. בדוק את מיקום התולעים, מכיוון שהחלקת הכיסוי עלולה לגרום לפיזור התולעים.

סמן את שקופית המיקרוסקופ בפרטים המתאימים, כגון שם זן התולעת. אתר את התולעים באמצעות מטרה בעלת עוצמה נמוכה במיקרוסקופ באמצעות תאורת שדה בהיר. השתמש במינימום של מטרת אוויר של פי 20 או יעד טבילה של פי 40 להמחשה ברורה של גל הסידן בביציות.

להדמיה אופטימלית של המדווחים הפלואורסצנטיים, התאם את זמן הרווח או החשיפה עבור ערוצי GFP ו-RFP. בדוק כל ביצית מינוס אחת בזרועות בלוטת המין של התולעת כדי לקבוע אם אירוע הפריה קרוב. לאחר פירוק המעטפת הגרעינית, השלד הציטולוגי של הביצית הפרוקסימלית ביותר מינוס אחד יתארגן מחדש, יקבל מראה מעוגל וייפרד מהביצית מינוס שתיים.

כאשר הביוץ מתרחש בקרוב, התחל מיד להקליט את הסרטון בשדה רחב. הביצית הפרוקסימלית מסומנת במינוס-אחד ישירות לפני הזרע, שם מאוחסן הזרע. העובר האחרון ממוקם הכי קרוב לזרע, אך בתוך הרחם.

גל הסידן הציג דפוס דו-פאזי, שמתחיל בהתפרצות מהירה ואחריה גל פלואורסצנטי שנע מנקודת הכניסה לכיוון הקוטב הנגדי. אות סידן נצפה מיד עם הכניסה לזרע בביצית המובילה מינוס אחת, אך לא בביצית מינוס שתיים. עוברים ברחם ומחוץ לרחם הראו אות פלואורסצנטי בתא בודד במהלך האמבריוגנזה.