Name: הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-07-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 11 s
Description: למד הדמיה של גלי סידן בהפריה ובהתפתחות מוקדמת ב-C. elegans באמצעות דוחף CaFE. השיטה מאפשרת לחקור אותות תאיים ביצירת עוברים ולהבין תהליכי התפתחות ביולוגיים.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>מעקב אחר סידן בשלבי ההתפתחות המוקדמים של C. elegans

<ol><li>Stein, P., Savy, V., Williams, A. M., Williams, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulators+of+calcium+signalling+at+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Open+Biol%22%5BJournal%5D)">Modulators of calcium signalling at fertilization.</a> Open Biol. 10 (7), 200118(2020).</li>
<li>McAvey, B. A., Wortzman, G. B., Williams, C. J., Evans, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+calcium+signaling+and+the+actin+cytoskeleton+in+the+membrane+block+to+polyspermy+in+mouse+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Biolo+Reprod%22%5BJournal%5D)">Involvement of calcium signaling and the actin cytoskeleton in the membrane block to polyspermy in mouse eggs.</a> Biolo Reprod. 67 (4), 1342-1352 (2002).</li>
<li>Takayama, J., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+sperm+TRP-3+channel+mediates+the+onset+of+a+Ca+2%2B+wave+in+the+fertilized+C.+elegans+oocyte%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The sperm TRP-3 channel mediates the onset of a Ca 2+ wave in the fertilized C. elegans oocyte.</a> Cell Rep. 15 (3), 625-637 (2016).</li>
<li>Yamamoto, I., Kosinski, M. E., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Start+me+up%3A+Cell+signaling+and+the+journey+from+oocyte+to+embryo+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Start me up: Cell signaling and the journey from oocyte to embryo in C. elegans.</a> Dev Dyn. 235 (3), 571-585 (2006).</li>
<li>Hubbard, E. J. A., Greenstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Caenorhabditis+elegans+gonad%3A+A+test+tube+for+cell+and+developmental+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">The Caenorhabditis elegans gonad: A test tube for cell and developmental biology.</a> Dev Dyn. 218 (1), 2-22 (2000).</li>
<li>Korta, D. Z., Hubbard, E. J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soma-germline+interactions+that+influence+germline+proliferation+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Dyn%22%5BJournal%5D)">Soma-germline interactions that influence germline proliferation in Caenorhabditis elegans.</a> Dev Dyn. 239 (5), 1449-1459 (2010).</li>
<li>Toperzer, K. M., Brennan, S. J., Carroll, D. J., Guisbert, E. A., Kim Guisbert,, S, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+the+biphasic+calcium+wave+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans+using+a+genetically+encoded+calcium+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Visualization of the biphasic calcium wave during fertilization in Caenorhabditis elegans using a genetically encoded calcium indicator.</a> Biol Open. 12 (9), 059832(2023).</li>
<li>Samuel, A. D., Murthy, V. N., Hengartner, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+dynamics+during+fertilization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium dynamics during fertilization in C. elegans.</a> BMC Dev Biol. 1 (1), 8(2001).</li>
<li>Dana, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+calcium+sensors+for+imaging+activity+in+neuronal+populations+and+microcompartments%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">High-performance calcium sensors for imaging activity in neuronal populations and microcompartments.</a> Nat Methods. 16 (7), 649-657 (2019).</li>
<li>Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Standardized+methods+for+measuring+induction+of+the+heat+shock+response+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Standardized methods for measuring induction of the heat shock response in Caenorhabditis elegans.</a> J Vis Exp. (161), e61030(2020).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Kamath, R., Ahringer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+RNAi+screening+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Genome-wide RNAi screening in Caenorhabditis elegans.</a> Methods. 30 (4), 313-321 (2003).</li>
<li>Kachur, T. M., Audhya, A., Pilgrim, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UNC-45+is+required+for+NMY-2+contractile+function+in+early+embryonic+polarity+establishment+and+germline+cellularization+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">UNC-45 is required for NMY-2 contractile function in early embryonic polarity establishment and germline cellularization in C. elegans.</a> Dev Biol. 314 (2), 287-299 (2008).</li>
<li>Takayama, J., Fujita, M., Onami, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+live+imaging+of+calcium+waves+and+other+cellular+processes+during+fertilization+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Protoc%22%5BJournal%5D)">In vivo live imaging of calcium waves and other cellular processes during fertilization in Caenorhabditis elegans.</a> Bio Protoc. 7 (7), e2205(2017).</li>
<li>Fire, A., Xu, S., Montgomery, M. K., Kostas, S. A., Driver, S. E., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potent+and+specific+genetic+interference+by+double-stranded+RNA+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans.</a> Nature. 391 (6669), 806-811 (1998).</li>
<li>Conte, D., MacNeil, L. T., Walhout, A. J. M., Mello, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+Interference+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">RNA Interference in Caenorhabditis elegans.</a> Curr Protoc Mol Biol. 109, 1-30 (2015).</li>
<li>Kamath, R. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+functional+analysis+of+the+Caenorhabditis+elegans+genome+using+RNAi%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic functional analysis of the Caenorhabditis elegans genome using RNAi.</a> Nature. 421 (6920), 231-237 (2003).</li>
<li>Reboul, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((elegans+ORFeome+version+1.1%3A+experimental+verification+of+the+genome+annotation+and+resource+for+proteome-scale+protein+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">elegans ORFeome version 1.1: experimental verification of the genome annotation and resource for proteome-scale protein expression.</a> Nat Genet. 34 (1), 35-41 (2003).</li>
<li>Bui, Y. K., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Caenorhabditis+elegans+inositol+5-phosphatase+homolog+negatively+regulates+inositol+1%2C4%2C5-triphosphate+signaling+in+ovulation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Caenorhabditis elegans inositol 5-phosphatase homolog negatively regulates inositol 1,4,5-triphosphate signaling in ovulation.</a> Mol Biol Cell. 13 (5), 1641-1651 (2002).</li>
<li>Muto, A., Kume, S., Inoue, T., Okano, H., Mikoshiba, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+waves+along+the+cleavage+furrows+in+cleavage-stage+Xenopus+embryos+and+its+inhibition+by+heparin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Calcium waves along the cleavage furrows in cleavage-stage Xenopus embryos and its inhibition by heparin.</a> J Cell Biol. 135 (1), 181-190 (1996).</li>
<li>Paudel, S., Sindelar, R., Saha, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signaling+in+vertebrate+development+and+its+role+in+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Calcium signaling in vertebrate development and its role in disease.</a> Int J Mol Sci. 19 (11), 3390(2018).</li>
<li>Paudel, S., Yue, M., Nalamalapu, R., Saha, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deciphering+the+calcium+code%3A+A+review+of+calcium+activity+analysis+methods+employed+to+identify+meaningful+activity+in+early+neural+development%5BTitle%5D)+AND+%22Biomolecules%22%5BJournal%5D)">Deciphering the calcium code: A review of calcium activity analysis methods employed to identify meaningful activity in early neural development.</a> Biomolecules. 14 (1), 138(2024).</li>
<li>Goldstein, B., Hird, S. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Specification+of+the+anteroposterior+axis+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Specification of the anteroposterior axis in Caenorhabditis elegans.</a> Development. 122 (5), 1467-1474 (1996).</li>
<li>Johnston, W. L., Dennis, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+eggshell+in+the+C.+elegans+oocyte-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genesis%22%5BJournal%5D)">The eggshell in the C. elegans oocyte-to-embryo transition.</a> Genesis. 50 (4), 333-349 (2012).</li>
<li>Stevenson, Z. C., Moerdyk-Schauwecker, M. J., Jamison, B., Phillips, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+self-selecting+and+clone-free+integration+of+transgenes+into+engineered+CRISPR+safe+harbor+locations+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22G3%22%5BJournal%5D)">Rapid self-selecting and clone-free integration of transgenes into engineered CRISPR safe harbor locations in Caenorhabditis elegans.</a> G3. 10 (10), Bethesda. 3775-3782 (2020).</li>
<li>Zacharias, A. L., Walton, T., Preston, E., Murray, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+differences+in+nuclear+%CE%B2-catenin+and+TCF+pattern+embryonic+cells+in+C.+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">Quantitative differences in nuclear β-catenin and TCF pattern embryonic cells in C. elegans.</a> PLoS Genet. 11 (10), e1005585(2015).</li>
<li>Webb, S. E., Miller, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+signalling+during+zebrafish+embryonic+development%5BTitle%5D)+AND+%22BioEssays%22%5BJournal%5D)">Calcium signalling during zebrafish embryonic development.</a> BioEssays. 22 (2), 113-123 (2000).</li>
<li>Wiseman, E., Carroll, D. J., Fowler, S. R., Guisbert, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Iteration+in+an+inquiry-based+undergraduate+laboratory+strengthens+student+engagement+and+incorporation+of+scientific+skills%5BTitle%5D)+AND+%22J+Scholarsh+Teach+Learn%22%5BJournal%5D)">Iteration in an inquiry-based undergraduate laboratory strengthens student engagement and incorporation of scientific skills.</a> J Scholarsh Teach Learn. 20 (2), 99-112 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>אגר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0140-07-4</td><td>2 ק"ג; האבקה מתמוססת בקלות רבה יותר מפתיתי</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>MidSci</td><td>BE-A125</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>מנורת אלכוהול</td><td>Fisher Scientific</td><td>S13475</td><td>השתמש עם 95% אתנול</td></tr><tr><td>אמוניום כלוריד (NH4Cl)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>AAA1500030</td><td>250 גרם</td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-5</td><td>5 גרם</td></tr><tr><td>AMSCO 400 Series Small Steam</td><td>Sterilizer Steris בריאות</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>בקטו-פפטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1420-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>בקטו-טריפטון</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>DF0123-17-3</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>סידן כלורי (CaCl2)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>C69-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>כולסטרול</td><td>תרמו סיינטיפיק</td><td>A11470.18</td><td>50 גרם</td></tr><tr><td>שפירית 200 דיסק מסתובב קונפוקלי</td><td>Oxford Instruments Andor</td><td>N/A</td><td>בשימוש עם מיקרוסקופ Leica</td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Cytogenics מיקרוסקופ שקופיות</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>22-035-900</td><td>144 שקופיות לחבילה</td></tr><tr><td>צבת אף שטוחה, לסת חלקה</td><td>הום דיפו</td><td>305530604</td><td>ודא שהצבת חלקה לסת איזופרופיל</td></tr><tr><td>ובטא;- d-1-thiogalactopyranoside&nbsp;( IPTG)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1755-10 10</td><td>גרם; סרט מעבדה ללא דיאוקסאן</td></tr><tr><td></td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>15-901-10R</td><td>סרט 0.5 אינץ' משמש להדבקת שקופיות מיקרוסקופ</td></tr><tr><td>Levamisole</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC187870100</td><td>10 גרם</td></tr><tr><td>מגנזיום גופרתי (MgSO4)</td> <td>פישר סיינטיפיק</td><td>M63-500 500</td><td>גרם</td></tr><tr><td>כיסוי מיקרוסקופ זכוכית</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12541016</td><td>חבילת 1 אונקיות</td></tr><tr><td>Nikon ECLIPSE Ti2 סריקת לייזר קונפוקלי</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Nikon NIS Elements תוכנה</td><td>Nikon</td><td>N/A</td><td>Confocal</td></tr><tr><td>OP50 Escherichia coli</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td> <td>OP50</td><td></td></tr><tr><td>Platinum Wire</td><td>TriTech</td><td>PT-9010</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן פוספט dibasic (K2HPO4)</td> <td>Fisher Scientific</td><td>P288-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>אשלגן פוספט מונו-בסיסי (KH2PO4)</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA1159436</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>נתרן כלורי (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-500</td><td>500 גרם</td></tr><tr><td>נתרן פוספט דו-בסיסי heptahydrate (Na2HPO4)Fisher</td> <td>Scientific</td><td>S471-3</td><td>3 ק"ג</td></tr><tr><td>מיקרוסקופ סטריאו</td><td>Leica</td><td>KL300 LED</td><td></td></tr><tr><td>פטרי סטרילי צלחת (35 מ"מ x 10 מ"מ)</td><td>CellTreat</td><td>229638</td><td>960 צלחות פטרי למארז</td></tr><tr><td>צלחת פטרי סטרילית (60 מ"מ x 15 מ"מ)</td><td>CellTreat</td><td>229665</td><td>500 צלחות פטרי למארז</td></tr><tr><td>זן EAG16 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG16</td><td>נוצר על ידי Kim Guisbert</td></tr><tr><td>Lab Strain EAG25 spn-4p::jGCaMP7s:: פאי-1u; ujIs113 II.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG25</td><td>נוצר על ידי Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain EAG28 spn-4p::jGCaMP7s::p ie-1u; unc-119(ed3) III; ltIs44 V.</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>EAG28</td><td>נוצר על ידי Kim Guisbert Lab</td></tr><tr><td>Strain JIM113 ujIs113 II [pie-1p::mCherry::H2B::p ie-1 3'UTR + nhr-2p:: his-24::mCherry::let-858 3'UTR + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>JIM113</td><td>נוצר על ידי E. Preston - Murray Lab</td></tr><tr><td>Strain OD70 unc-119(ed3) III; ltIs44 V [pie-1p::mCherry::P H(PLC1delta1) + unc-119(+)]</td><td>Caenorhabditis Genetics Center (CGC)</td><td>OD70</td><td>נוצר על ידי Audhya/Oegema - Greenstein Lab</td></tr><tr><td>Tritech Worm Pick Handle</td><td>TriTech</td><td>TWPH1</td><td></td></tr><tr><td>תמצית שמרים</td><td>IBI Scientific</td><td>IB49160</td><td>500 גרם</td></tr></tbody></table>

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - c. elegans

In Vivo Visualization of Calcium Transients during Fertilization and Early Development in C. elegans

באמצעות הפרוטוקולים המתוארים בכתב יד זה, הדפוסים הדינמיים של איתות סידן בהפריה ובאמבריוגנזה נצפו ב - C. elegans.
רצף הפריה טיפוסי בתולעים המכילות את מדווח ה-CaFE מוצג באיור 2. כדי להקל על הניתוח, נעשה שימוש בזן EAG28 המשלב את מדווח CaFE עם תחום הומולוגיה של pleckstrin (PH-mCherry) טרנסגן13. סמן PH-mCherry מתמקם בקרום הפלזמה ומאפשר הדמיה קלה יותר של גבולות התא, במיוחד בזרוע בלוטת המין. זן EAG28 נוצר על ידי הכלאה של זן EAG16 המכיל את מדווח CaFE עם זן OD70 PH-mCherry reporter13. ב - C. elegans, ביוץ והפריה מתרחשים בו זמנית. זמן 0 של הפריה נחשב למסגרת הראשונה שבה מזוהה אות פלואורסצנטי בביצית הביוץ (איור 2). פרץ בהיר של פלואורסצנטיות מתרחש באתר איחוי הזרע ברגע שהקצה המוביל של הביצית נכנס לזרע, איבר האחסון של הזרע7. האות מופיע לפני השלמת הביוץ. גל הסידן הוא דו-פאזי, עם התפרצות ראשונית מהירה ואחריה גל של פלואורסצנטיות מנקודת הכניסה לכיוון הקוטב הנגדי. הביצית כולה הופכת פלואורסצנטית תוך &lt;30 שניות.
שימו לב שמדווח ה-CaFE נמצא בעותק יחיד, ולכן האות אינו בהיר כמו טרנסגנים אחרים. Z-stack זמן-lapse אינו מומלץ במהלך הביוץ אלא אם כן דיסק מסתובב קונפוקלי זמין ומותאם. ניתן להשיג תמונות מחסנית Z לפני או אחרי סרט כדי ללכוד שינויים תלת מימדיים במורפולוגיה של בלוטת המין. למרות שהתמונות כאן צולמו במיקרוסקופ קונפוקלי, הארעיות נצפו גם באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי רחב שדה שהוא נפוץ וזול יותר מאשר קונפוקלי. באמצעות קונפוקל סריקת לייזר, קצב הפריימים הוא כ-1 פריימים לשנייה. באמצעות קונפוקל דיסק מסתובב, קצב הפריימים הוא 10 פריימים לשנייה או מהיר יותר. אות הרקע של מדווח CaFE מספיק כדי להאיר את הביציות המתבגרות בזרוע בלוטת המין. עם ההפריה, נצפית בדרך כלל עלייה של פי 1.5-2 בעוצמת אות GFP.
קיימות מספר שיטות חלופיות לכימות לדוגמה, לתוכנת ניתוח התמונות של Imaris, שנוצרה על ידי Oxford Instruments (אותה חברת אם של המיקרוסקופ הקונפוקלי של הדיסק המסתובב Andor Dragonfly), יש את היכולת לכמת את האות בכל פריים רק מהביצית החולפת במקום החזר ROI גדול יותר. עם זאת, תוכנת Imaris אינה חינמית. בנוסף, אסטרטגיית ניתוח תמונה מפורטת למדידת גלי סידן בביצית תוארה בפירוט מצוין על ידי טקיאמה, פוג'יטה ואונאמי ומשתמשת ב-ImageJ, הזמין בחינם14. לחלופין, קימוגרפים להמחשת גל האות הפלואורסצנטי על פני ביצית בודדת דורשים מניפולציה נרחבת יותר של התמונה ממה שמתואר כאן, אך מתוארים ב-Takayama ו-Onami3.
יתרון מובהק של C. elegans הוא יכולתו להפיל את הביטוי של כמעט כל גן על ידי הזנת חיידקי התולעים המבטאים dsRNA כדי להפעיל RNAi אנדוגני15,16. לביטוי dsRNA אופטימלי, גם לוחות ה-RNAi וגם תרבית ה-RNAi הרוויה מכילים IPTG. ה-dsRNA מיוצר על ידי ביטוי הגן המעניין עם מקדמים מאגפים. כאן, השתמשנו בספריית Ahringer המכוונת לרוב הגנום של התולעת באמצעות שימוש ב-16,256 זני חיידקים17. לחלופין, ORFeome של ~11,000 שיבוטי RNAi נוצר על ידי מעבדת Vidal באמצעות מערכת Gateway וזמין לרכישה דרך Horizon Discovery18.
כדי להדגים את התועלת של מדווח CaFE בשילוב עם RNAi, בדקנו ביוץ מוקדם. מחיקה חלקית ב-ipp-5 גורמת לאירוע ביוץ כפול שבו גם הביצית -1 וגם הביצית -2 נכנסות לזרע הזרע במהלך אותו ביוץ19. IPP-5 הוא פוספטאז הפועל על IP3 ומפחית ביעילות את רמות השליח השני IP3. מצאנו כי הפלת RNAi של ipp-5 מעוררת פנוטיפ ביוץ כפול הדומה למוטנט.
ניתוח של מדווח CaFE במהלך הביוץ הכפול שנגרם על ידי נוקדאון ipp-5 RNAi חשף היבטים חדשים של ה-OET. ראשית, אות סידן נצפה מיד עם הכניסה לתוך הזרע בביצית המובילה -1 אך לא בביצית -2 הנגררת (איור 3). למרות ש-2 ביציות מבייצות, הביצית -1 היא עדיין הביצית היחידה שמראה סימני התבגרות תקינה, בפרט, פירוק המעטפת הגרעינית (NEBD). נתונים אלה מצביעים על כך שלמרות שהביצית -2 נמצאת בנוכחות זרע, היא אינה כשירה להפריה מכיוון שהיא עדיין לא הבשילה כראוי. שנית, הביצית -2 מציגה גל סידן מושהה, בדרך כלל כאשר הביצית יוצאת מהזרע לרחם. למרות שהבשלת הביציות היא בדרך כלל תנאי מוקדם לביוץ, נתונים אלה מצביעים על כך שהבשלת הביצית והיכולת להפריה עדיין יכולים להתרחש לאחר הביוץ. ההדמיה של גל הסידן המושהה במהלך נוקדאון ipp-5 מדגישה את היתרונות של מדווח CaFE לחקירת יכולת ההפריה והתזמון.
יתר על כן, גילינו כי מדווח ה-CaFE ניתן לזיהוי בביצים מוטלות וחושף מעברי סידן חד-תאיים במהלך האמבריוגנזה המוקדמת ב-C. elegans. עוברים מיום 1 בוגר מסונכרן EAG28 (CaFE; תולעי PH-mCherry) צולמו באמצעות הפרוטוקולים מחלקים 1-5 עם דיסק מסתובב של Andor Dragonfly קונפוקלי באמצעות מצלמת Zyla (איור 4). ארעי הסידן מוגבלים לתאים בודדים ולוקח פחות זמן מגל הסידן להפריה להשלים (~9 שניות, n=11). עם זאת, נראה שגל הסידן במהלך האמבריוגנזה אינו דו-פאזי. מעברי סידן לא נצפו לפני שלב 8 התאים. יש לציין כי סידן אינו מתמקם בתלם המחשוף ב-C. elegans, כפי שניתן לראות באורגניזמים רבים אחרים, כולל בני אדם ו-Xenopus 20,21,22. מעברי סידן חד-תאיים נצפו זמן רב לאחר הקיבה (~200 דקות לאחר ההפריה) ובביצים מטילות. עובר בודד מציג מספר מעברי סידן לאורך זמן אך בתאים שונים ובדרך כלל תא אחד בכל פעם. שימו לב שחשיפה מתמשכת לגירוי לייזר תפגע בעוברים. מומלץ להשתמש בעוצמת LED/לייזר נמוכה יותר או בחשיפה לא רציפה. עם זאת, מכיוון שגלי הסידן קצרים יחסית ב-~9 שניות, איננו ממליצים על איטיות מ-2 שניות בין אירועי גירוי LED/לייזר.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig01.jpg"> 
איור 1: זרוע בלוטת המין C. elegans . תמונה של זרוע בלוטת מין אחת מזן התולעת EAG25, המציגה את מדווח CaFE GFP (ירוק) ואת סמן ההיסטון 2B-mCherry (אדום), המדגיש גרעינים בקו הנבט. הביצית הפרוקסימלית מסומנת על ידי -1 ישירות לפני הזרע, שם מאוחסן הזרע (חץ). העובר הממוקם הכי קרוב לזרע הזרע אך בתוך הרחם הוא העובר האחרון. התמונה צולמה באמצעות קונפוקל סריקת הלייזר Nikon ECLIPSE Ti2. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig02.jpg"> 
איור 2: הדמיה של גל הסידן במהלך ההפריה. תמונות סדרות זמן של פלואורסצנטיות המשקפות סידן תוך תאי במהלך הפריה בזן התולעת EAG28. זן EAG28 מכיל גם את מדווח CaFE (ירוק) וגם את היתוך הדומיין של פלקסטרין-הומולוגיה (צהוב), המדגיש את ממברנות הפלזמה. זמן 0 מציין את המסגרת הראשונה המתארת עלייה ברורה באות הפלואורסצנטי בביצית. זמן 24.4 שניות משקף את המסגרת הראשונה המציגה פלואורסצנטיות ביצית שלמה. תמונות מסדרות הזמן צולמו באמצעות הדיסק המסתובב של Andor Dragonfly עם מצלמת Zyla. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig03.jpg"> 
איור 3: גלי סידן במהלך אירוע ביוץ כפול המושרה על ידי ipp-5 RNAi. תמונות זמן-lapse של גלי סידן עוקבים של הביצית -1 והביצית -2 בזן EAG16 (CaFE בירוק GFP) שנחשפו ל-ipp-5 RNAi. מסגרת ה-40.0 s כוללת תוויות עבור הביצית -1 (-1), -2 ביצית (-2), זרע זרע (*) ועובר +1 (+1). זמן 0 שניות מציג את העלייה הראשונית בקרינה של גל הסידן של הביצית -1. זמן 4.5 שניות מראה את גל הסידן מתפשט לעבר הקוטב הנגדי בביצית -1. זמן 70.5 שניות מציג פלואורסצנטיות של תא שלם בביצית -1 מלווה בביצית -2 באות GFP הבסיסי; שתי הביציות נמצאות בזרעונים. הביצית המופרית -1 והביצית הלא מופרית -2 נכנסות לרחם בזמן 158.3 שניות. ב-219.3 שניות, הביצית -2 מציגה גל סידן פלואורסצנטי מאוחר. התמונות צולמו באמצעות הדיסק המסתובב של Andor Dragonfly עם מצלמת Zyla. סרגל קנה מידה = 30 מיקרומטר <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67141/67141fig04.jpg"> 
איור 4: מעברי סידן חד-תאיים באמבריוגנזה מוקדמת. (A) עוברים ברחם ו- (B) מחוץ לרחם (ביצה מטילה) הראו אות פלואורסצנטי בתא בודד במהלך האמבריוגנזה. התמונות צולמו באמצעות הדיסק המסתובב של Andor Dragonfly עם מצלמת Zyla. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67141/67141fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

Calcium is an important signaling molecule during the oocyte-to-embryo transition (OET) and early embryogenesis. The hermaphroditic nematode ...

in-vivo-visualization-calcium-transients-during-fertilization-early

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

ביולוגיה התפתחותית

מאמר זה מתאר טכניקה להדמיה של האירועים הראשונים של העובר בתוך...

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

סרטון זה מציג את המושגים מאחורי דימות סידן וכולל פרוטוקול לדוגמה להדמיית הילוך מהיר של תולעים הכלולות בבארות אגרוז יצוקות.

הדמיית סידן: שיטה להמחשת פעילות עצבית ב- C. elegans חי

סרטון זה מדגים טכניקה להדמיית סידן בתאי עצב בודדים של Caenorhabditis elegans המתנהגים באמצעות חלבוני כתב פלואורסצנטיים מקודדים גנטית. הוא מתאר את השלבים המעורבים בהדמיית תנועת תולעים ומדידת יחסי פלואורסצנטיות של כתב מתאי עצב כדי לקשר בין רמות הסידן התוך-תאיות לפעילות עצבית ושינויים התנהגותיים במהלך הטלת ביצים.

הדמיית סידן בתאי עצב בודדים המווסתת את התנהגות הטלת הביצים ב- Caenorhabditis elegans

מקור: } בנקרופט, א.א., . כימות Ca ספונטני2+{{}} שטפים והשפעותיהם במורד הזרם בתאי עצב ראשוניים במוח התיכון של עכבר. J. Vis. exp. (2020){{}}{{TAG_ 46}}סרטון זה מדגים את ההדמיה בזמן אמת של זרימת סידן בתאי עצב גחוניים במוח התיכון שמקורם בעוברי עכברים. באמצעות וקטור ויראלי כדי לבטא אינדיקטור סידן, הנוירונים מצולמים תחת מיקרוסקופ קונפוקלי כדי לעקוב אחר שינויים בעוצמת הקרינה במהלך פעילות סידן ספונטנית ומושרה על ידי נוירוטרנסמיטרים.

הדמיה של זרם סידן בנוירונים במוח התיכון הגחוני שמקורם בעוברי עכברים

מקור: Doser, R., et al. הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי in vivo. J. Vis. Exp. (2023)סרטון זה מדגים הדמיה in vivo של שטף סידן תת-תאי בנוירונים של חוט העצב הגחוני של זני Caenorhabditis elegans טרנסגניים. נעשה שימוש בשני מדדי סידן נפרדים: אינדיקטור ציטופלזמי בזן אחד ואינדיקטור מיטוכונדריאלי באחר. נוירונים נצפים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי כדי לנטר שינויים בזמן אמת בעוצמת הקרינה בתוך הציטופלזמה העצבית והמיטוכונדריה, המשקפים שטף סידן במהלך פעילות עצבית ספונטנית.

הדמיית דינמיקת סידן תת-תאית בתאי עצב של Caenorhabditis elegans

עם גוף מערך עצביה הקטנים שקוף, מתועד היטב ומגוון הרחב של טכניקות גנטיות מתאימים...

בהדמיה עצבית סיד vivo ב C. elegans

פרוטוקול זה מתאר את השימוש Ca2 + כתבים מקודדים גנטית כדי לרשום שינויים בפעילות העצבית מתנהג Caenorhabditis elegans תולעים.

סידן רציומטרי הדמיה של נוירונים בודדים ב מתנהג Caenorhabditis Elegans

שיטה זו מספקת דרך לזוג אלקטרואופטיקה וחיישני סידן מקודד גנטית לתמונה בסיסית ציטוסולג רמות סידן ושינויים בארעיות הסידן מעורר בשרירי הגוף של האורגניזם מודל ג. אלגיה.

בשנת הדמיה Vivo סידן בג. אלגיה שרירי הגוף

השיטות הנוכחיות מתארות גישה לא רציומטרית להדמיית סידן ברזולוציה גבוהה, תת-מדורית in vivo ב- Caenorhabditis elegans באמצעות מדדי סידן מקודדים גנטית זמינים.

הדמיה תת-תאית של טיפול בסידן עצבי ב-Vivo

בעוברי קסנופוס, תאים מגג הבלסטוקואל הם פלוריפוטנטיים וניתן לתכנת אותם ליצירת רקמות שונות. כאן, אנו מתארים פרוטוקולים לשימוש בצמחי גג בלסטוקואל דו-חיים כמערכת בדיקה לחקירת תכונות מפתח in vivo  ו-in vitro של התפתחות עצבית מוקדמת.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

למד הדמיה של גלי סידן בהפריה ובהתפתחות מוקדמת ב-C. elegans באמצעות דוחף CaFE. השיטה מאפשרת לחקור אותות תאיים ביצירת עוברים ולהבין תהליכי התפתחות ביולוגיים.

הדמיה in vivo של מעברי סידן במהלך הפריה והתפתחות מוקדמת ב - C. elegans

גלה סרטונים נוספים