Name: זיהוי תאים נגועים ב-EcoHIV בעכברים טרנסגניים שעברו מניפולציה במיקרוגליה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: למדו לזהות תאים נגועים ב-EcoHIV במיקרוגליה של עכברים טרנסגניים Tmem119-EGFP. שיטה זו מאפשרת חקירת מחסניות ויראליות במערכת העצבים המרכזית ובהבנת הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל-HIV.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>זיהום EcoHIV בעכברי Tmem119-EGFP לחקר שינויים במיקרוגליה

<ol><li>Vigorito, M., Lashomb, A. L., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+learning+and+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Spatial learning and memory in HIV-1 transgenic rats.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 2, 319-328 (2007).</li>
<li>Moran, L. M., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Time+and+time+again%3A+Temporal+processing+demands+implicate+perceptual+and+gating+deficits+in+the+HIV-1+transgenic+rat%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">Time and time again: Temporal processing demands implicate perceptual and gating deficits in the HIV-1 transgenic rat.</a> J. Neuroimmune Pharmacol. 8 (4), 988-997 (2013).</li>
<li>Repunte-Canonigo,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+changes+consistent+with+neuroAIDS+and+impaired+working+memory+in+HIV-1+transgenic+rats%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Neurodegener%22%5BJournal%5D)">Gene expression changes consistent with neuroAIDS and impaired working memory in HIV-1 transgenic rats.</a> Mol Neurodegener. 9, 26(2014).</li>
<li>Reid, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+HIV-1+transgenic+rat+that+develops+HIV-related+pathology+and+immunologic+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">An HIV-1 transgenic rat that develops HIV-related pathology and immunologic dysfunction.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (16), 9271-9276 (2001).</li>
<li>McLaurin, K. A., Li, H., Booze, R. M., Mactutus, C. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Disruption+of+timing%3A+NeuroHIV+progression+in+the+post-cART+era%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Disruption of timing: NeuroHIV progression in the post-cART era.</a> Sci Rep. 9, 827(2019).</li>
<li>Roscoe, R. F., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+female+rat%3A+Synaptodendritic+alterations+of+medium+spiny+neurons+in+the+nucleus+accumbens%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmune+Pharmacol%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic female rat: Synaptodendritic alterations of medium spiny neurons in the nucleus accumbens.</a> J Neuroimmune Pharmacol. 9 (5), 642-653 (2014).</li>
<li>Denton, A. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+monoaminergic+and+histaminergic+circuit+dysregulation+following+long-term+HIV-1+protein+exposure%5BTitle%5D)+AND+%22J+NeuroVirol%22%5BJournal%5D)">Selective monoaminergic and histaminergic circuit dysregulation following long-term HIV-1 protein exposure.</a> J NeuroVirol. 25 (4), 540-550 (2019).</li>
<li>Peng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+HIV-1+transgenic+rat+as+a+model+for+HIV-1+infected+individuals+on+HAART%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuroimmunol%22%5BJournal%5D)">The HIV-1 transgenic rat as a model for HIV-1 infected individuals on HAART.</a> J Neuroimmunol. 218 (1-2), 94-101 (2010).</li>
<li>Abbondanzo, S. J., Chang, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV-1+transgenic+rats+display+alterations+in+immunophenotype+and+cellular+responses+associated+with+aging%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">HIV-1 transgenic rats display alterations in immunophenotype and cellular responses associated with aging.</a> PLoS ONE. 9, e105256(2014).</li>
<li>Potash, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mouse+model+for+study+of+systemic+HIV-1+infection%2C+antiviral+immune+responses%2C+and+neuroinvasiveness%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A mouse model for study of systemic HIV-1 infection, antiviral immune responses, and neuroinvasiveness.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 102 (10), 3760-3765 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Illenberger, J. M., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglial+HIV-1+expression%3A+Role+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">Microglial HIV-1 expression: Role in HIV-1 associated neurocognitive disorders.</a> Viruses. 13 (5), 924(2021).</li>
<li>Kaiser, T., Feng, G. Tmem119-EGFP and Tmem119-CreERT2 transgenic mice for labeling and manipulating microglia. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aKaiser%2C+T+%22eNeuro%22">eNeuro</a>. 6 (4), (2019).</li>
<li>Bennett, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+tools+for+studying+microglia+in+the+mouse+and+human+CNS%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci.+USA%22%5BJournal%5D)">New tools for studying microglia in the mouse and human CNS.</a> Proc Natl Acad Sci. USA. 113 (12), E1738-E1746 (2016).</li>
<li>Satoh, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TMEM119+marks+a+subset+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropathology%22%5BJournal%5D)">TMEM119 marks a subset of microglia in the human brain.</a> Neuropathology. 36 (1), 39-49 (2016).</li>
<li>Li, H., Aksenova, M., Bertrand, S. J., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+filamentous+actin+%28F-actin%29+puncta+in+rat+cortical+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantification of filamentous actin (F-actin) puncta in rat cortical neurons.</a> J Vis Exp. (108), e53697(2016).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rat+model+of+EcoHIV+brain+infection%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A rat model of EcoHIV brain infection.</a> J Vis Exp. (167), e62137(2021).</li>
<li>Alfar, H. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocol+for+optimizing+production+and+quality+control+of+infective+EcoHIV+virions%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Protocol for optimizing production and quality control of infective EcoHIV virions.</a> STAR Protoc. 4 (3), 102368(2023).</li>
<li>Malatesta, P., Hartfuss, E., Götz, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+radial+glial+cells+by+fluorescent-activated+cell+sorting+reveals+a+neuronal+lineage%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Isolation of radial glial cells by fluorescent-activated cell sorting reveals a neuronal lineage.</a> Development. 127 (24), 5253-5263 (2000).</li>
<li>Parpura, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Glutamate-mediated+astrocyte-neuron+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Glutamate-mediated astrocyte-neuron signaling.</a> Nature. 369 (6483), 744-747 (1994).</li>
<li>Wahl, A., Al-Harthi, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((HIV+infection+of+non-classical+cells+in+the+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Retrovirology%22%5BJournal%5D)">HIV infection of non-classical cells in the brain.</a> Retrovirology. 20 (1), 1(2023).</li>
<li>Pandey, H. S., Seth, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Friends+turn+foe-astrocytes+contribute+to+neuronal+damage+in+NeuroAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Mol.+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Friends turn foe-astrocytes contribute to neuronal damage in NeuroAIDS.</a> J. Mol. Neurosci. 69 (2), 286-297 (2019).</li>
<li>Minagar, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+macrophage%2Fmicroglia+and+astrocytes+in+the+pathogenesis+of+three+neurologic+disorders%3A+HIV-associated+dementia%2C+Alzheimer%27s+disease%2C+and+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurol+Sci%22%5BJournal%5D)">The role of macrophage/microglia and astrocytes in the pathogenesis of three neurologic disorders: HIV-associated dementia, Alzheimer's disease, and multiple sclerosis.</a> J Neurol Sci. 202 (1-2), 13-23 (2002).</li>
<li>Borrajo, A., Spuch, C., Penedo, M. A., Olivares, J. M., Agís-Balboa, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Important+role+of+microglia+in+HIV-1+associated+neurocognitive+disorders+and+the+molecular+pathways+implicated+in+its+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Med%22%5BJournal%5D)">Important role of microglia in HIV-1 associated neurocognitive disorders and the molecular pathways implicated in its pathogenesis.</a> Ann Med. 53 (1), 43-69 (2021).</li>
<li>González-Scarano, F., Martín-García, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+neuropathogenesis+of+AIDS%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">The neuropathogenesis of AIDS.</a> Nat Rev Immunol. 5 (1), 69-81 (2005).</li>
<li>Li, H., McLaurin, K. A., Mactutus, C. F., Booze, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microglia+proliferation+underlies+synaptic+dysfunction+in+the+prefrontal+cortex%3A+Implications+for+the+pathogenesis+of+HIV-1-associated+neurocognitive+and+affective+alterations%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neurovirol%22%5BJournal%5D)">Microglia proliferation underlies synaptic dysfunction in the prefrontal cortex: Implications for the pathogenesis of HIV-1-associated neurocognitive and affective alterations.</a> J. Neurovirol. 29 (4), 460-471 (2023).</li>
<li>Kim, B. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EcoHIV+infection+of+primary+murine+brain+cell+cultures+to+model+HIV+replication+and+neuropathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Viruses%22%5BJournal%5D)">EcoHIV infection of primary murine brain cell cultures to model HIV replication and neuropathogenesis.</a> Viruses. 16 (5), 693(2024).</li>
<li>Réu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+lifespan+and+turnover+of+microglia+in+the+human+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">The lifespan and turnover of microglia in the human brain.</a> Cell Rep. 20 (4), 779-784 (2017).</li>
<li>Jones, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+of+glial+cell+modulators+in+the+management+of+substance+use+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22CNS+Drugs%22%5BJournal%5D)">Potential of glial cell modulators in the management of substance use disorders.</a> CNS Drugs. 34 (7), 697-722 (2020).</li>
<li>Kaalund, S. S., Johansen, A., Fabricius, K., Pakkenberg, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Untreated+patients+dying+with+aids+have+loss+of+neocortical+neurons+and+glial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Untreated patients dying with aids have loss of neocortical neurons and glial cells.</a> Front Neurosci. 13, 1398(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>293FT תאים</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R70007</td><td></td></tr><tr><td>33 G, מחט RN רכזת קטנה, (סגנון נקודה: 3, אורך מחט: 19.25 מ"מ)</td> <td>המילטון</td><td>7803-05</td><td></td></tr><tr><td>תמיסה אנטיביוטית-אנטי-פטרייתית</td><td>Cellgro</td><td>30004CI</td><td>100x</td></tr><tr><td>C57BL/6-Tmem119em2Gfng/J</td><td>זן מעבדת ג'קסון</td><td>#:031823</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג BioCoat ג'לטין 75 ס"מ&sup2; בקבוק תרבית תאים מלבני עם כובע מאוורר</td> טכנולוגיות <td>חיים</td><td>354488</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג&nbsp; DMEM עם L-גלוטמין, 4.5 גרם/ליטר גלוקוז ונתרן פירובט</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>10013CV</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי זכוכית</td><td>VWR</td><td>637-137</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 מלקחיים</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>14095</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #7 מלקחיים</td><td>מכשירים מדויקים עולמיים</td><td>14097</td><td></td></tr><tr><td>ערכת מקסי פלסמיד EndoFree פלסמיד (10)</td><td>Qiagen</td><td>12362</td><td></td></tr><tr><td>אפנדורף&nbsp; Snap-Cap Microcentrifuge Biopur Safe-Lock Tubes</td><td>Life Technologies</td><td>22600028</td><td></td></tr><tr><td>להבי פלדת פחמן דו-צדדיים Ted</td><td>Pella, inc.</td><td>121-9</td><td></td></tr><tr><td>פישר ביו-ריאגנטס&nbsp; מיקרוביולוגיה מדיה: מרק LB, מילר</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>BP1426-500</td><td></td></tr><tr><td>נוגדן רקומביננטי אנושי נגד CD11b</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-120-214</td><td>1:50 דילול</td></tr><tr><td>מזרק מזרק תוך עיני (6.5 ומיקרו; L), מחט נשלפת</td><td>המילטון</td><td>6609071-01</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; ליפופקטמין 3000 מגיב טרנספקציה&nbsp;</td><td>טכנולוגיות חיים</td><td>L3000015</td><td></td></tr><tr><td>Invitrogen&nbsp; One Shot TOP10 Electrocomp&nbsp;E. coli</td><td>Fisher Scientific</td><td>C404052</td><td></td></tr><tr><td>Iris Forceps</td><td>World Precision Instruments</td><td>15914</td><td></td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>World Precision Instruments</td><td>500216</td><td></td></tr><tr><td>Lentivirus-Associated p24 ELISA Kit</td><td>Cell Biolabs, inc.</td><td>VPK-107-5</td><td></td></tr><tr><td>רכז Lenti-X</td><td>Takara</td><td>PT4421-2</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I סרום מופחת</td><td>טכנולוגיות חיים בינוניות</td><td>11058021</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>158127-500G</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldehyde&nbsp;</td><td>סיגמא</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>PELCO קל לפורס&nbsp; פורס רקמות רטט</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>11000</td><td></td></tr><tr><td>פלקו&nbsp; דבק רקמות Pro CA44</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>10033</td><td></td></tr><tr><td>פלקו&nbsp; פרו דגימה רטריבר</td><td>טד פלה, בע"מ</td><td>101-33</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold</td><td>Fisher Scientific</td><td>P36930</td><td></td></tr><tr><td>ארנב חד שבטי אנטי-Iba1 נוגדן</td><td>Abcam</td><td>ab178847</td><td>1:500 דילול</td></tr><tr><td>RN התאמת דחיסה 1 מ"מ</td><td>המילטון</td><td>55750-01</td><td></td></tr><tr><td>Sevoflurane</td><td>Merritt אספקה וטרינרית</td><td>347075</td><td></td></tr><tr><td>Sprague Dawley חולדה בהריון</td><td>Inotiv</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus Slides</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>12-550-154%&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>To-Pro-3</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>T3605</td><td>ערכת צביעת גרעין</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA (0.25%), פנול אדום</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Vannas מספריים</td><td>מכשירי דיוק עולמיים</td><td>500086</td><td></td></tr></tbody></table>

זיהוי תאים נגועים ב-ecohiv בעכברים טרנסגניים שעברו מניפולציה במיקרוגליה

Identification of EcoHIV-Infected Cells in Microglia-Manipulated Transgenic Mice

שבר של mScarlet (1858 bp) המכיל אתרי אנזימים של "Cla1" בקצה 3' ו-"Not1" בקצה 5' הוכנס לווקטור lentiviral pNL4-3-EcoHIV (איור 1). כדי לאמת את הביטוי של EcoHIV-mScarlet, תאי מוח ראשוניים שבודדו מקליפת המוח של עוברי חולדה E18 טופלו ב-EcoHIV-mScarlet (60 מיקרוליטר, 1.26 × 106 TU/mL) במשך 6 ימים במבחנה. הנתונים באיור 2 הראו כי אותות פלואורסצנטיים אדומים של mScarlet היו ממוקמים בעיקר בסוגי תאים גליאליים בהתבסס על המורפולוגיה השונה של התאים. יתר על כן, תיוג CD11b/c ו-Iba1 (סמני תאים למיקרוגליה) הראה כי אותות mScarlet היו ממוקמים במשותף עם תאי CD11b/c + ו/או Iba1 +. הנתונים הצביעו על כך שמיקרוגליה הייתה סוג התא העיקרי של התפלגות EcoHIV-mScarlet במבחנה. לא היה זיהום עצבי משמעותי בתאים המתורבתים (איור משלים 1). 
לאחר מכן, ההדבקה של EcoHIV-mScarlet נבדקה על תאי גליה מעורבים ראשוניים של עכברים בוגרים. לשם כך, תאי גליה מעורבים בודדו וטוהרו תחילה מעכברים בוגרים (חודשיים) ונדבקו ב-EcoHIV-mScarlet (8 מיקרוליטר, 1.26 ×-106 TU/mL) למשך יומיים. התמונות באיור 3 הראו ש-EcoHIV-mScarlet הדביק בהצלחה גליה של עכברים בוגרים.
כדי לטפל עוד יותר בדפוס ההתפלגות של EcoHIV-mScarlet במוח העכבר, במיוחד לזיהוי סוג התא הנגוע, EcoHIV-mScarlet הוזרק רטרו-אורביטלי לקו העכברים Tmem119-EGFP שבו מיקרוגליה סומנה באופן ספציפי עם אותות EGFP ללא כל סוגי מקרופאגים אחרים של קונפליקטים5. התוצאות באיור 4 (גם באיור משלים 2) מראות כי אותות פלואורסצנטיים אדומים mScarlet נצפו בתאים חיוביים ל-EGFP, מה שמרמז על מיקרוגליה כסוג התא העיקרי של ביטוי EcoHIV במוחות עכברים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig01.jpg"> 
איור 1: מפת הווקטור של EcoHIV-NL-4-3-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig02.jpg"> 
איור 2: זיהום EcoHIV-mScarlet בתאי מוח ראשוניים של חולדות. (A,E) תמונות מייצגות של צביעת CD11b/c בתאי מוח ראשוניים. תאי המוח בודדו מעוברי חולדות E18 ונדבקו בנגיף EcoHIV-mScarlet למשך 6 ימים. (ב,ו) תמונות מייצגות של אותות פלואורסצנטיים mScarlet מתאי מוח במבחנה . (ג,ז) תמונות מייצגות של צביעת Iba1 בתאי מוח ראשוניים. (ד,ח) תמונות ממוזגות של תיוג משולש של CD11b/c, mScarlet ו-Iba1. פסי קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig03.jpg"> 
איור 3: זיהום EcoHIV-mScarlet בתאי גליה מעורבים ראשוניים של עכבר. (A,B) תמונות קונפוקליות מייצגות של התפלגות mScarlet במבחנה. תאי הגליה המעורבים הראשוניים בודדו מעכברי C57BL6 בוגרים (בני חודשיים) ותורבו במשך שבועיים לפני ההדבקה הוויראלית. ה-EcoHIV-mScarlet התווסף למדיום התרבית למשך יומיים וצילם את התמונות תחת המטרה של 60× של המיקרוסקופ הקונפוקלי. סרגל קנה מידה: 10 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה מוגדלת של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67150/67150fig04.jpg"> 
איור 4: התפלגות EcoHIV-mScarlet בקו העכבר Tmem119-EGFP . (א,ב) תמונות ממוזגות של אותות mScarlet/EGFP/ToPro3 בחלקי מוח. המסגרת הצהובה מציינת את אזור היעד של (B). סרגל קנה מידה: 300 מיקרומטר. (C) תמונה מייצגת של התפלגות mScarlet בשכבת הפרספקס החיצונית של אזור הריח של קו העכבר Tmem119-EGFP . (D) תמונה מייצגת של התפלגות EGFP. האותות הפלואורסצנטיים היו ממוקמים בתאי מיקרוגליה בקו העכברים Tmem119-EGFP . (E) תמונה מייצגת של צביעת גרעין TO-PRO-3. פסי קנה מידה: 300 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/67150fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: צביעת MAP2 ו-MOG של תאי מוח ראשוניים של חולדות שנדבקו בנגיף EcoHIV-mScarlet. מוטות קנה מידה: 50 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%201.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
איור משלים 2: תמונות קונפוקליות של זיהום EcoHIV-mScarlet בקו עכברים Tmem119-EGFP . מוטות קנה מידה: 75 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20Figure%202.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>
קובץ משלים 1: רצף DNA פלסמיד EcoHIV-mScarlet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67150/Supplementary%20data%20-%20EcoHIV-mScarlet%20plasmid%20DNA%20sequence.zip" target="_blank">אנא לחץ כאן להורדת קובץ זה.</a>

זיהוי תאים נגועים ב-EcoHIV בעכברים טרנסגניים שעברו מניפולציה במיקרוגליה

Combined antiretroviral therapy (cART) has dramatically improved the quality of life for people living with HIV (PLWH). However, over 4 million PLWH are ...

identification-ecohiv-infected-cells-microglia-manipulated-transgenic

Research

JoVE Journal

Neuroscience

מדעי המוח

Microglia תושב מקרופאגים הם המספקים את השורה הראשונה של מעקב ההגנה החיסונית של מערכת העצבים המרכזית. מיקרו RNA הם מולקולות רגולטוריות כי לשחק תפקיד חשוב בתהליכים פיזיולוגיים רבים, כולל הפעלת והבחנה של מקרופאגים. במאמר זה נתאר את שיטת המדידה של מיקרו RNA ב microglia.

זיהוי של מיקרו RNA ב microglia על ידי Real-time PCR ב CNS רגיל ובמהלך Neuroinflammation

אנו מתארים שיטות לבידוד היעילה ומהיר / התרבות של microglia קיימא מקליפת המוח וחוט השדרה בילוד מבוגר. הנתיחה והציפוי של microglia קליפת המוח יכולים להיות מושלמת תוך 90 דקות, עם קציר microglial שלאחר מכן מתקיים ~ 10 ימים לאחר הנתיחה הראשונית.

Microglia culturing ממערכת העצבים המרכזי וילודים למבוגרים

מפתח אחד לחקירה מוצלחת של הביולוגיה microglial הוא שימור immunofunction microglial vivo לשעבר במנותק מרקמת מערכת העצבים המרכזית. בידוד מיקרוגליה דרך תוצאות רועדות סיבוביות בתרביות תאים טהורות וimmunofunctional מאוד כפי שהוערך על ידי הדמיה ניאון, immunocytochemistry, והפעלת מיקרוגליה הבאות ELISA עם lipopolysaccharide מעודדי דלקת הגירויים (LPS) ופאם 3 צסק"א 4 (פאם).

בידוד של קליפת המוח Microglia עם immunophenotype משומר ופונקציונאלי מילודי Murine

הפעלת המיקרוגלים וmicrogliosis הן תגובות מפתח לניוון של מערכת עצבים כרוניות. כאן, אנו מציגים שיטות לin vivo, הדמיה לטווח הארוך של תאים ברשתית microglial CX3CR1-GFP + על ידי ophthalmoscopy confocal, ולסף וmorphometric מנתח לזהות ולכמת ההפעלה שלהם. אנו עוקבים אחר שינויי microglial בגלאוקומה הקשורות לגיל שלבים מוקדמים.

בVivo הדינמיקה של רשתית microglial הפעלה במהלך מוחיה: Confocal Ophthalmoscopic הדמיה וMorphometry הסלולרי בעכבר גלאוקומה

פרוטוקול עבור בידודו של ראשי מיקרוגלייה מן המוח מאתר מוצג. טכניקה זו מסייעת בהבנה הנוכחי של מחלות נוירולוגיות. צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות הפרדה מגנטית משולבים כדי לייצר תשואה מספקת של מדגם מאוד טהור. יתר על כן, אנו חלוקה לרמות את השלבים עבור אפיון מיקרוגלייה.

אפיון ובידוד של העכבר מיקרוגלייה העיקרי על ידי צנטריפוגה הדרגתיות צפיפות

הפרוטוקול המוצג כאן מאפשר השתלה של מיקרוגליה אנושית (iPSMG) שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים במוח דרך מסלול טרנסנסאלי בעכברים מדוכאי חיסון. השיטה להכנת והשתלת טרנסנסאל של תאים וניהול תערובת ציטוקינים לשמירה על iPSMG מוצגת.

השתלה של מיקרוגליה שמקורה בתאי גזע פלוריפוטנטיים המושרים על ידי בני אדם במוח עכברים מדוכאי חיסון דרך נתיב טרנסנסאלי לא פולשני

עבודה זו מתארת פרוטוקול לכימות שינויים גלובליים בהיסטון באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח. העבודה מכילה גם את פרוטוקול בידוד תאי המיקרוגליה ששימש לאיסוף נתונים.

כימות שינויים גלובליים בהיסטון לאחר תרגום באמצעות ציטומטריית זרימה תוך-גרעינית במיקרוגליה מבודדת במוח עכבר

אנו מתארים פרוטוקול לבידוד תאי מיקרוגליאה מההיפותלמוס של העכבר (או מבני מוח קטנים מקבילים) באמצעות מיון תאים מופעל מגנטית (MACS), בזמן קצר יחסית. מיקרוגליה היפותלמית ממוינת MACS יכולה לשמש לניתוח ex vivo וניתן לצפות אותה לביצוע בדיקות חוץ גופיות .

בידוד של תאי מיקרוגליה היפותלמיים ממוח עכבר בוגר שזה עתה מחורר על ידי מיון תאים המופעלים על ידי מגנטית  

מאמר זה מדגים שיטה לדמיון וכימות תנועתיות מיקרוגליה ומגע עם פונקטות פוסט-סינפטיות ברשתית באמצעות מיקרוסקופיה קונפוקלית של דיסק מסתובב.

הדמיה חיה ואפיון של דינמיקת מיקרוגליה ואינטראקציות עם סינפסות ברשתית עכברים חולים

פרוטוקול זה משלב זרימה ציטומטרית וריצוף RNA של תא בודד כדי לבודד ולאפיין מצבי תאי מיקרוגליה במוח הקטן של מוחות עכברים מוקדמים לאחר הלידה. הוא משתמש בדיסוציאציה אנזימטית, צנטריפוגה פרקול וצביעה חיסונית כדי לחשוף הטרוגניות של מיקרוגליה ולשפר את ההבנה של תפקידיהם בהתפתחות המוח הקטן ובמחלות.

זרימה ציטומטרית וניתוח תא בודד לאפיון הפעלת מיקרוגליה בהתפתחות מוח מוקדמת של עכבר לאחר לידה

למדו לזהות תאים נגועים ב-EcoHIV במיקרוגליה של עכברים טרנסגניים Tmem119-EGFP. שיטה זו מאפשרת חקירת מחסניות ויראליות במערכת העצבים המרכזית ובהבנת הפרעות נוירוקוגניטיביות הקשורות ל-HIV.

זיהוי תאים נגועים ב-EcoHIV בעכברים טרנסגניים שעברו מניפולציה במיקרוגליה

גלה סרטונים נוספים