הקרנת שבר קוולנטי באמצעות בדיקת קשירה כמותית בלתי הפיכה

אנו עובדים בין המחלקות לכימיה ומדעי החיים, ומפתחים ליגנדות קוולנטיות, חדשניות המסייעות לליגנדות קוולנטיות, למגוון מטרות תרופתיות אנטי-סרטניות. יש לקוות כי מולקולות אלה ישמשו בעתיד, בין אם כטיפולים או אולי כבדיקות כימיות. לכן קיימות מספר טכנולוגיות לסינון ליגנדות קוולנטיות.

ניתן לפצל אותם באופן כללי לטכניקות פרוטאומיות שבהן תרכובות מודגרות באמצעות תאים בתרבית וספקטרומטריית מסות המשמשת לקביעת החלבונים שהמולקולות מתייגות, ושיטות מבוססות מטרה שבהן ספריות של אלקטרופילים מודגרות עם חלבונים בודדים. אתגר ניסיוני משמעותי קשור לתגובתיות של ליגנדות קוולנטיות. מולקולות תגובתיות מדי יופיעו לעתים קרובות כפגיעות במהלך בדיקות סקר, אך אינן מתאימות מכיוון שהן יתייגו באופן לא סלקטיבי חלבונים רבים ושונים בתא.

לכן, תרכובת של פעילות היא קריטית שיש לקחת בחשבון בכל שלב של גילוי תרופות קוולנטיות. לכן, קבוצות מאן וארמסטרונג באימפריאל פיתחו שיטה חדשה לסינון אלקטרופילים כנגד מטרה חלבונית הנקראת קשירה כמותית בלתי הפיכה או בדיקת qIT. הפרוטוקול שלנו מספק שיטה חדשה ונחוצה מאוד לסינון אלקטרופילים כנגד מטרה חלבונית, שהיא ניתנת להרחבה, אינה דורשת ספקטרומטריית מסות, ובקרות לתגובתיות פנימית מורכבת.

כדי להתחיל, הכינו את כל תמיסות המלאי הנדרשות והשאירו אותן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפני הניסוי. קשירה כמותית, בלתי הפיכה או חיץ בדיקת qIT עם גז ארגון למשך כ-30 דקות. להחלפת חיץ ביצועית, דלל את תמיסת החלבון מעבר למאגר בדיקת qIT נטול גז ביחידת מסנן ספין, וסחרור ב -4, 000 גרם במשך 15 דקות בארבע מעלות צלזיוס כדי לרכז את החלבון.

לאחר מכן דללו את תמיסת חלבון המטרה לריכוז של 15 מיקרו טוחנות במאגר בדיקת qIT נטול גז כדי להכין תשעה מיליליטר של התמיסה. יש לחלק תמיסת TCEP-agraose, מאגר qIT ומלאי גלוטתיון לבארות המתאימות של לוחות 384 הקידוחים. העבירו 1.8 מיקרוליטר מכל באר מקבילה של צלחת ספריית הפרגמנטים ליצירת צלחת דילול מורכבת המדללת כל תרכובת ל-1.5 מילימולר במאגר בדיקת qIT, בתוספת 3% DMSO.

השתמש בתחנת צנרת 384 כדי להעביר 20 מיקרוליטר של תמיסת תרכובת מכל באר של צלחת דילול התרכובת לשני לוחות התגובה. כדי להתחיל, הגדר את קשירה כמותית בלתי הפיכה או בדיקת qIT עם החלבון הרצוי וגלוטתיון. יש לחלק מלאי CPM של 500 מיקרומולר לתוך אליציטוטים של 111.2 מיקרוליטר בצינורות מיקרוצנטריפוגות ולאחסן אותם בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס.

לאחר הפשרת מלאי CPM, הוסף אותו ל- 40 מיליליטר של מאגר מרווה לבדיקת qIT כדי להכין תמיסה של 1.4 מיקרומולרית שחררו 27 מיקרוליטר של תמיסת CPM Quench לכל באר של שתי צלחות טריות של 384 בארות. צנטריפוגה את צלחת התגובה החלבונית ב 200 גרם במשך שלוש דקות כדי pellet TCEP-agarose. בנקודות זמן קבועות מראש, השתמש בתחנת צנרת 384 כדי להעביר שלושה מיקרוליטרים של דגימה מכל באר של צלחת התגובה החלבונית לצלחת המרווה CPM.

הסר את הדגימה מהחלק העליון של הבאר הימנעות שאיפה TCEP-agarose בתחתית. לדגור על לוחות המרווה CPM בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת, ולמדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות עם עירור ב 384 ננומטר ופליטה ב 470 ננומטר. כדי להתחיל, לבצע קשירה כמותית-בלתי הפיכה או את בדיקת qIT עם החלבון הרצוי ולהרוות את הדגימות בצלחת CPM.

עבור כל מרווה, חשב Z prime כמדד לאיכות המבחן. לאחר מכן חשב את ערכי הפלואורסצנטיות הממוצעים עבור בארות הבקרה השליליות בעמודות אחת ושתיים ובארות הבקרה החיוביות בעמודות 23 ו- 24. נרמלו היטב כל תגובה לערכי הפלואורסצנטיות הממוצעים של קבוצת הבקרה החיובית והשלילית, וקשרו בנפרד את אחוז השינוי לעומת הזמן עבור כל תרכובת המגיבה עם גלוטתיון ועם חלבון המטרה.

באמצעות GraphPad, התאם נתוני אחוז מנורמל לעומת נתוני זמן למודל דעיכה מעריכית חד פאזית עבור שתי התגובות באמצעות המשוואה, AE בחזקת KT C.השתמש בקצב שבו מקטעים מגיבים עם חלבון וגלוטתיון כדי לחשב את גורם שיפור הקצב או ערך REF עבור כל מקטע. לבסוף, כדי לבחור קטעי Hit, הגדר סף REF, קצב פגיעה שרירותי, או בחר מקטעים עם REF שלוש סטיות תקן גדולות מהממוצע הגיאומטרי. תרכובת אחת הגיבה עם שאריות ציסטאין על חלבון המטרה בקצב גדול פי שישה מאשר עם גלוטתיון, ועמדה בקריטריון Hit של REF גדול משלושה.

תרכובת שתיים לא הראתה קצב תגובה מואץ עם שאריות ציסטאין המטרה בהשוואה לגלוטתיון, מה שמצביע על היעדר אינטראקציות לא קוולנטיות, ולכן לא נבחרה כלהיט.