Name: הקרנת שבר קוולנטי באמצעות בדיקת קשירה כמותית בלתי הפיכה (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T12:10:00.000+00:00
Duration: 6 min 17 s
Description: למדו את פרוטוקול בדיקת הקשירה הכמותית הבלתי הפיכה (qIT) לזיהוי ליגנדים קוולנטיים סלקטיביים. שיטת פלואורסצנית זו מאפשרת סינון סקלאבילי של אלקטרופילים מבלי להשתמש בספקטרומטריית מסה.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. בניית ספריית פרגמנטים
<ol>
	<li>עצבו ספרייה של שברים אלקטרופיליים וסנתז או רכשו אותם. ספריות מקטעים אלקטרופיליים מורכבות בדרך כלל מאלקטרופילים בעלי תגובתיות קלה (כגון אקרילאמידים, כלורואצטמידים וויניל סולפונאמיד) המצורפים למגוון רחב של פיגומים כימיים. ספריות שברים אלקטרופיליים זמינות באופן נרחב מספקים מסחריים, ופרטים נוספים על התכנון והבנייה שלהם נסקרים במקום אחר 5,11.</li>
	<li>ממיסים כל תרכובת ב-DMSO לריכוז של 50 מילימול, ואז מפיצים תרכובת שונה לכל באר של עמודות 3 עד 22 של צלחת מאגר של 384 בארות, המכונה צלחת ספריית הפרגמנטים.<ol>
		<li>חלק DMSO לכל באר של עמודות 1, 2, 23 ו- 24 עבור הפקדים החיוביים והשליליים. פריסת הלוחות יכולה להשתנות בהתאם למספר התרכובות שנבדקות (איור 2). הנפח שיתווסף ללוח הספרייה יהיה תלוי במספר המסכים שיש לבצע, בהתחשב בכך שנדרש כ-1.8 מיקרוליטר מכל באר לכל מסך qIT. הכינו מראש את צלחת ספריית הפרגמנטים ואחסנו אותה בטמפרטורה של 4°C.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig02.jpg"> 
איור 2: פריסת לוחות. סקירה כללית של פריסת צלחת qIT assay 384-well. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
2. הגדרת Assay (איור 3)
<ol>
	<li>הכן את הפתרונות הבאים: תמיסת חלבון רקומביננטי (חלבון מטרה בכל חיץ), מאגר בדיקת qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 8)), מאגר מרווה לבדיקת qIT (150 mM NaCl, 25 mM Hepes (pH 7.5)), ותמיסות מלאי מורכבות (מקטע אלקטרופילי (50 mM) ב- DMSO). הערה: pH של 8 משמש במאגר התגובה כדי להאיץ את התגובה בין שאריות ציסטאין המטרה לבין שברים, המאפשר למדוד את קצב התגובה אפילו עבור מקטעים תגובתיים קלים מאוד. pH מעט נמוך יותר של 7.5 משמש במאגר המרווה מכיוון שקשר התיואטר שנוצר בין המאלימיד של CPM לבין תיול הציסטאין נוטה להידרליזה ב- pHs בסיסי יותר (לדוגמה, עבודה קודמת מצאה שמצומדים של ציסטאין-מלימיד יציבים הרבה יותר ב- pH 7.3 מאשר pH 812).</li>
	<li>הסר את תמיסות מלאי חלקי DMSO מהאחסון והשאר אותן בטמפרטורת החדר למשך שעתיים לפחות כדי לאפשר למלאי המורכב להפשיר.</li>
	<li>חיץ בדיקת qIT של דגה על ידי בעבוע עם גז ארגון במשך כ -30 דקות.</li>
	<li>החליפו ביסודיות את תמיסת חלבון המטרה במאגר בדיקת qIT נטול גזים. באופן מכריע, חומרים מחזרים כגון DTT ו-TCEP חייבים להיות מוסרים ביסודיות לריכוזים &lt; 100 ננומטר, שכן הם יפריעו לכימות תיול. שלב זה יכול להתבצע באמצעות סדרה חוזרת ונשנית של חילופי חיץ, כמתואר להלן.<ol>
		<li>יש לדלל את תמיסת החלבון מעבר למאגר בדיקת qIT נטול גז ביחידת מסנן ספין, להתרכז באמצעות צנטריפוגה (4000 x גרם, 4°C, 15 דקות) ולחזור על הפעולה. בדרך כלל, נדרשים 4 סבבים של 1 מתוך 15 דילולים כדי להסיר מספיק DTT (1 מ"ל) מ-1 מ"ל של תמיסת מלאי חלבונים רקומביננטיים, אם כי ניתן להתאים שלב זה בהתאם לריכוז חומר ההפחתה בתמיסת החלבון הרקומביננטי המקורית. הערה: לחלופין, חידוד תמיסת חלבון המטרה כנגד עודף גדול של מאגר בדיקת qIT נטול גז יכול להשיג את אותה תוצאה.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>דללו את תמיסת חלבון המטרה (המיוצרת בשלב 2.1) לריכוז חלבון של 15 מיקרומטר במאגר בדיקת qIT נטול גזים. כ-9 מ"ל של תמיסת חלבון מטרה נדרשים כדי למלא צלחת של 384 בארות עם נפח מת מספיק.</li>
	<li>הכן השעיה של 1.5% (v/v) של TCEP-agarose במאגר בדיקת qIT degassed. כ -9 מ"ל של תרחיף TCEP-agarose נדרש לכל צלחת הקרנה.</li>
	<li>יש לפזר 20 מיקרוליטר של תמיסת TCEP-agarose לכל באר של שתי צלחות 384 בארות.</li>
	<li>הכינו מלאי גלוטתיון של 15 מיקרומטר במאגר בדיקת qIT נטול גזים. יש להכין אותו מיד לפני הציפוי, שכן גלוטתיון מתחמצן במהירות בתמיסה ללא חומר מחזרים.</li>
	<li>יש לחלק 20 μL של מאגר בדיקת qIT לעמודות 1 ו-2 של שני לוחות 384 הקידוחים.</li>
	<li>יש לפזר 20 μL של 15 מיקרומטר חלבון או תמיסת גלוטתיון (בהתאם לצלחת המיועדת) לעמודות 3-24 של צלחת 384 בארות. אלה מכונים צלחת התגובה החלבונית וצלחת התגובה של גלוטתיון. השאר להפחית ב- RT למשך שעה אחת.</li>
	<li>יש לוותר על 58.2 μL של חיץ בדיקת qIT נטול גז לכל באר של צלחת 384 בארות, ולאחר מכן להעביר 1.8 μL מכל באר מקבילה של צלחת ספריית הפרגמנטים כדי ליצור לוח דילול מורכב, שבו כל תרכובת מדוללת לריכוז של 1.5 mM במאגר בדיקת qIT בתוספת 3% DMSO. הערה: שלב זה נעשה קל יותר עם תחנת צנרת 384, המאפשרת העברת מלאי מורכב עבור כל באר בפעולה אחת.</li>
	<li>לאחר דגירה של שעה אחת של חלבון וגלוטתיון עם TCEP-agarose, העבירו 20 מיקרוליטר של תמיסת תרכובת מכל באר של צלחת דילול התרכובת הן לפלטת התגובה של החלבון והן ללוחית התגובה של גלוטתיון כדי להתחיל את הבדיקה. שלב זה נעשה קל יותר גם עם תחנת צנרת 384. שלבי הבדיקה מסוכמים באיור 3. הערה: ניתן לשנות את ריכוז המקטע לפי הצורך, וניתן לחזור על מבחני qIT עבור הפגיעות בריכוזים נמוכים יותר, אם רוצים, כדי לאשר שהזיקה החלבונית אינה תוצר של ריכוז המקטע הגבוה. ריכוז המקטעים הגבוה יחסית משמש להעלאת kpro ו- kGSH כדי להבטיח ששיעורים מדויקים ניתנים לקביעה עבור תרכובות תגובתיות קלות (שיכולות להציג t1/2 (GSH) &gt; 24 שעות בתנאי הבדיקה). יתר על כן, למרות שריכוז מקטעים של 500 מיקרומטר הוא גבוה, ריכוזי מיקרומטר גבוהים עד mM נמוכים שימשו בסינון מקטעים, למשל13.</li>
	<li>הפעל טיימר - הבדיקה החלה, ויש לבצע מרווה בנקודות זמן קבועות בהתאם לסעיף להלן.</li>
</ol>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig03v2.jpg"> 
איור 3: סיכום בדיקת qIT. סיכום הממחיש את השלבים העיקריים של תגובת בדיקת qIT מוגדרת היטב. (נוצר באמצעות BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig03largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
3. CPM מרווה
הערה: מרווה CPM מבוצעת כדי לכמת את כמות התיול הבלתי מגיב שנותרה בלוחות התגובה של החלבונים והגלוטתיון. אלה צריכים להתבצע בנקודות זמן נפרדות (לדוגמה, נקודות הזמן הבאות משמשות בדרך כלל: 7, 15, 30, 60, 120, 240, 360, 1220 ו- 1440 דקות) כדי לאפשר ניטור קינטיקה של תגובה.
<ol>
	<li>הכן פתרונות מלאי CPM (500 מיקרומטר) ב- DMSO, חלק אותם לתוך 111.2 μL aliquots בצינורות מיקרוצנטריפוגה, ואחסן אותם ב -20 ° C. מניות CPM אלה ניתן להכין מראש, ו 1 aliquot יידרש לכל נקודת זמן מרווה.</li>
	<li>הכן תמיסת מרווה CPM (1.4 מיקרומטר) על ידי הפשרת תמיסת מלאי CPM קפואה (500 מיקרומטר) והוספתה למאגר מרווה של 40 מ"ל qIT assay.</li>
	<li>יש לפזר 27 מיקרוליטר של תמיסת מרווה CPM לכל באר של שתי צלחות 384 בארות - שתיים נדרשות להרוות הן את צלחות התגובה של החלבון והן של הגלוטתיון. אלה נקראים CPM-Quench Plates, להכין אותם מקסימום של 30 דקות לפני השימוש.</li>
	<li>צנטריפוגה את צלחת התגובה החלבונית ב 200 x גרם במשך 3 דקות כדי להבטיח TCEP-agarose הוא כדור.</li>
	<li>בנקודות זמן שנקבעו מראש, העבירו דגימה של 3 מיקרוליטר מכל באר של צלחת תגובת החלבונים לצלחת קוונץ 'CPM ממולאת מראש. שלב זה הוא גם פשוט באמצעות תחנת צנרת 384.</li>
	<li>ערבבו את צלחת ה-CPM Quench Plate על ידי שאיפה וניפוק של 3 x 25 μL. חשוב להסיר את הדגימה מראש הבאר כדי למנוע שאיפה של TCEP-agarose בתחתית, אשר יפריע CPM מרווה.</li>
	<li>חזור על שלבים 3.4-3.6 עם צלחת התגובה של גלוטתיון.</li>
	<li>דגרו על צלחות ה-CPM Quench (שהוכנו ב-3.4-3.6) בטמפרטורת החדר למשך שעה אחת.</li>
	<li>מדוד את עוצמת הפלואורסצנטיות של לוח המרווה CPM (עירור ב- 384 ננומטר ופליטה ב- 470 ננומטר).</li>
</ol>
4. ניתוח נתונים ובחירת להיטים
<ol>
	<li>עבור כל מרווה, חשב Z' כמדד לאיכות המבחן. יש להתעלם מכל CPM מרווה עם Z' &lt; 0.5. Z' = 1 - ((3σ שליטה חיובית +3σ שליטה שלילית) / (μשליטה חיובית - שליטהשלילית μ)) כאשר σ = עוצמת פלואורסצנטיות סטיית תקן ו- μ = ממוצע עוצמת הפלואורסצנטיות</li>
	<li>חישוב ערכי פלואורסצנטיות ממוצעים עבור בארות הבקרה השליליות והחיוביות (עמודות 1 ו- 2, ו- 23 ו- 24, בהתאמה).</li>
	<li>לנרמל כל תגובה היטב לערכי הפלואורסצנטיות הממוצעים של הבקרות החיוביות והשליליות: % שונה = 100 x (פלואורסצנטיות באר מורכבת - פלואורסצנטיות בקרה שלילית) / (פלואורסצנטיות בקרה חיובית - פלואורסצנטיות בקרה שלילית)</li>
	<li>בנפרד, יש לרשום % שינוי לעומת הזמן עבור כל תרכובת המגיבה עם גלוטתיון ועם חלבון המטרה.</li>
	<li>התאמת נתוני % שינוי לעומת זמן מנורמל למודל דעיכה מעריכית חד פאזית הן עבור התגובה עם חלבון והן עם גלוטתיון באמצעות המשוואה: % שונה = ae - kt + c כאשר a = טווח הערכים % שהשתנו, k = קצב התגובה, t = זמן, c = הערך % שהשתנה בזמן אינסופי. התאמת עקומה וקביעת פרמטרים יכולה להתבצע באמצעות תוכנה מסחרית (כגון Graphpad).</li>
	<li>השתמש בקצב שבו מקטעים מגיבים עם חלבון (kpro) וגלוטתיון (kGSH) כדי לחשב את הערך Rate Enhancement Factor (REF) עבור כל מקטע: REF = kpro / kGSH</li>
	<li>השתמש בערכי REF כדי לבחור קטעי פגיעה. ניתן לבצע זאת על ידי הגדרת סף REF (לדוגמה, REF &gt; 3), שיעור פגיעה שרירותי (למשל, 2% העליון), או על ידי בחירת מקטעים עם סטיות תקן REF 3 הגדולות מהממוצע הגיאומטרי.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>קשירה כמותית-בלתי הפיכה: סינון ליגנדות אלקטרופיליות ביעילות

<ol><li>Boike, L., Henning, N. J., Nomura, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+covalent+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Drug+Discov%22%5BJournal%5D)">Advances in covalent drug discovery.</a> Nat Rev Drug Discov. 21, 881-898 (2022).</li>
<li>Gehringer, M., Laufer, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+and+re-emerging+warheads+for+targeted+covalent+inhibitors%3A+Application+in+medicinal+chemistry+and+chemical+biology%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Emerging and re-emerging warheads for targeted covalent inhibitors: Application in medicinal chemistry and chemical biology.</a> J Med Chem. 62, 5673-5724 (2019).</li>
<li>Strelow, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+perspective+on+the+kinetics+of+covalent+and+irreversible+inhibition%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A perspective on the kinetics of covalent and irreversible inhibition.</a> SLAS Discov. 22 (1), 3-20 (2016).</li>
<li>Burger, J. A., Buggy, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bruton+tyrosine+kinase+inhibitor+Ibrutinib+%28PCI-32765%29%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">Bruton tyrosine kinase inhibitor Ibrutinib (PCI-32765).</a> Leukemia Lymphoma. 54 (11), 2385-2391 (2013).</li>
<li>Hocking, B., Armstrong, A., Mann, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery+-+Design%2C+synthesis+and+screening+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Prog+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery - Design, synthesis and screening methods.</a> Prog Med Chem. 62, 105-146 (2023).</li>
<li>Lucas, S. C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+hits+and+where+to+find+them%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">Covalent hits and where to find them.</a> SLAS Discov. 29 (3), 100142(2024).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+kinetic+analysis+for+target-directed+covalent+ligand+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Angewandte+Chemie%22%5BJournal%5D)">High-throughput kinetic analysis for target-directed covalent ligand discovery.</a> Angewandte Chemie. 130, 5355-5359 (2018).</li>
<li>Kathman, S. G., Xu, Z., Statsyuk, A. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Fragment-based+method+to+discover+irreversible+covalent+inhibitors+of+cysteine+proteases%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">A Fragment-based method to discover irreversible covalent inhibitors of cysteine proteases.</a> J Med Chem. 57 (11), 4969-4974 (2014).</li>
<li>Hallenbeck, K. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+liquid+chromatography%2Fmass+spectrometry+method+for+screening+disulfide+tethering+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22SLAS+Discov%22%5BJournal%5D)">A liquid chromatography/mass spectrometry method for screening disulfide tethering fragments.</a> SLAS Discov. 23 (2), 183-192 (2019).</li>
<li>Craven, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiparamter+kinetic+analysis+for+covalent+fragment+optimization+by+using+quantitative+irreversible+tethering+%28qIT%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Multiparamter kinetic analysis for covalent fragment optimization by using quantitative irreversible tethering (qIT).</a> Chem Bio Chem. 21, 3417-3422 (2020).</li>
<li>Keeley, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent+fragment+libraries+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Discov+Today%22%5BJournal%5D)">Covalent fragment libraries in drug discovery.</a> Drug Discov Today. 25 (6), 983-996 (2020).</li>
<li>Gober, I. N., Sharan, R., Villain, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Improving+the+stability+of+thiol-maleimide+bioconjugates+via+the+formation+of+a+thiazine+structure%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pept+Sci%22%5BJournal%5D)">Improving the stability of thiol-maleimide bioconjugates via the formation of a thiazine structure.</a> J Pept Sci. 29 (10), e3495(2023).</li>
<li>Olp, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalent-fragment+screening+of+BRD4+identifies+a+ligandable+site+orthogonal+to+the+acetyl-lysine+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Covalent-fragment screening of BRD4 identifies a ligandable site orthogonal to the acetyl-lysine binding sites.</a> ACS Chem Biol. 15 (4), 1036-1049 (2020).</li>
<li>Qin, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Acrylamide+fragment+inhibitors+that+induce+unprecedented+conformational+distorions+in+Entereovirus+71+3C+and+SARS-CoV-2+main+protease%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Pharmaceutica+Sinica+B%22%5BJournal%5D)">Acrylamide fragment inhibitors that induce unprecedented conformational distorions in Entereovirus 71 3C and SARS-CoV-2 main protease.</a> Acta Pharmaceutica Sinica B. 12 (10), 3924-3999 (2022).</li>
<li>Jamshidiha, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+the+first+structurally+validated+covalent+ligands+of+the+small+GTPase+RAP27A%5BTitle%5D)+AND+%22RSC+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Identification of the first structurally validated covalent ligands of the small GTPase RAP27A.</a> RSC Med Chem. 13 (2), 150-155 (2022).</li>
<li>Flanagan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+and+computational+methods+for+the+characterization+of+covalent+reactive+groups+for+the+prospective+design+of+irreversible+inhibitors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Med+Chem%22%5BJournal%5D)">Chemical and computational methods for the characterization of covalent reactive groups for the prospective design of irreversible inhibitors.</a> J Med Chem. 57, 10072-10079 (2014).</li>
</ol>

ליגנדות קוולנטיות-תגובתיות ממוקדות ציסטאין (מולקולות המפעילות השפעה ביולוגית על ידי תגובה עם שאריות ציסטאין נבחרות על חלבון מסוים) הפכו פופולריות יותר ויותר ככלים כימיים וטיפולים במהלך העשורים האחרונים1. אלה מורכבים בדרך כלל מאלקטרופיל תגובתי קל (כגון אקרילאמיד, כלורואצטמיד או ויניל סולפון) המצורף לליגנד מואטי עם זיקה גבוהה למטרה חלבונית2. באופן אידיאלי, אינטראקציה ליגנד-חלבון מתקדמת באמצעות מנגנון דו-שלבי הכולל קשירת ליגנד לא קוולנטית ראשונית, ואחריה היווצרות קשר קוולנטי בלתי הפיך בין ציסטאין המטרה ואלקטרופיל3.
מספר ליגנדות קוולנטיות, כולל מעכב טירוזין קינאז איברוטיניב של ברוטון, פותחו על ידי אספקת ליגנד הפיך שזוהה בעבר עם ידית אלקטרופילית4. עם זאת, גישה זו לא תמיד מצליחה, וניסיונות אחרים מצאו כי התקנת אלקטרופילים דורשת אופטימיזציה משמעותית5. במקום זאת, גישות אלקטרופיליות תחילה, במיוחד באמצעות מקטעים אלקטרופיליים, הפכו פופולריות יותר בשנים האחרונות. אלה בדרך כלל כוללים דגירה של ספרייה של אלקטרופילים עם חלבון ולאחר מכן בחירת תרכובות עם קצב מוגבר של תגובה כלפי ציסטאין, אשר מניחים כי נגרמת על ידי אינטראקציות לא קוולנטיות, פרודוקטיבי בין ליגנד וכיס קשירה6. יש לציין כי שיטות אלה יושמו בהצלחה במהלך הפיתוח של מעכב KRAS (G12C) Sotorasib1.
סינון אלקטרופיל ראשון מציב מספר אתגרים ייחודיים בהשוואה לסינון ליגנד לא קוולנטי מסורתי, בעיקר בשל השונות הגבוהה בתגובתיות בתוך ובין מחלקות ראשי קרב7. רוב האלקטרופילים המגיבים לציסטאין יגיבו, לאורך זמן, עם כל שאריות הציסטאין החשופות לממס, ללא קשר לאינטראקציה סלקטיבית כלשהי עבור חלבון המטרה. לפיכך, תפוסת הליגנדים תגדל עם הזמן עבור כמעט כל האלקטרופילים, וללא בקרה על תגובתיות, בחירת הפגיעות תהיה לעתים קרובות מוטה לכיוון מקטעים תגובתיים יותר הפוגעים במטרה במהירות רבה יותר8.
יתר על כן, שיטות סינון אלקטרופיל ראשונות משתמשות לעתים קרובות בספקטרומטריית מסות כדי לזהות היווצרות של ליגנד חלבון, אשר מוגבלת בתפוקה9. דגימת תגובה סדירה נדרשת לאורך פרק זמן ממושך (שעות עד ימים) כדי לאפיין כראוי קינטיקה של תגובה עבור ספרייה של תרכובות עם אלקטרופיליות מגוונת10. מסך של 300 מקטעים שנדגמו ב-10 נקודות זמן ידרוש לפיכך ביצוע של 3000 ספקטרום מסה, מעבר לתפוקה של רוב מערכות ספקטרומטריית מסות החלבון. לכן, רצוי להשתמש בשיטות בעלות תפוקה גבוהה יותר לניטור היווצרות ליגנד חלבון.
הגישה המתוארת כאן, בדיקת קשירה בלתי הפיכה כמותית (qIT), היא שיטת סינון אלקטרופילית ראשונה השולטת בתגובתיות פנימית ומשתמשת בקריאה פלואורסצנטית פשוטה7. חלבון, או גלוטתיון (טריפפטיד לא מובנה המכיל תיול המשמש כבקרה לתגובתיות פנימית) מודגרים עם ספרייה של מקטעים אלקטרופיליים, ודגימות רגילות שנלקחות למרווה לתמיסה של CPM (7-Diethylamino-3-(4'-Maleimidylphenyl)-4-Methylcoumarin, סוכן פלואורוגני לכימות תיול). היווצרות האדוקציה בין הציסטאין למקטע האלקטרופילי מפחיתה את כמות התיול הזמין לתגובה עם CPM, ומפחיתה את הפלואורסצנטיות המתקבלת במרווים. פלואורסצנטיות CPM פועלת אפוא כפרוקסי לתיול שלא מגיב, ומאפשרת לקבוע את הקינטיקה של תגובת תיול עם כל מקטע אלקטרופילי. מקטעים אלקטרופיליים עם תגובתיות חלבון משופרת משמעותית על פני גלוטתיון נבחרים כפגיעות ומקבלים עדיפות להמשך הפיתוח (איור 1).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig01.jpg"> 
איור 1: סכמה של qIT. סקירה סכמטית של בדיקת qIT. (נוצר באמצעות BioRender). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
בחירת פגיעות באמצעות ערכי REF שולטת בתגובתיות פנימית ומבטיחה שמקטעים ייבחרו כפגיעות רק אם הם יוצרים אינטראקציות לא קוולנטיות, פרודוקטיביות, עם יעד חלבוני. קריאת הפלואורסצנטיות הפשוטה פירושה גם שבדיקת qIT ניתנת להרחבה מאוד ואינה דורשת שיטות מבוססות ספקטרומטריית מסות לניטור תגובה.
כאן, מתואר הליך מקיף עבור בדיקת qIT, עם תוצאות לדוגמה הכלולות כדי להמחיש את ביצועי הבדיקה ואת בחירת הפגיעה.

<table><tbody><tr><td>ארגון גז</td><td>BOC</td><td>I1149</td><td></td></tr><tr><td>קורנינג 384 בארות, אוגן נמוך, לוחות בדיקה תחתונים שטוחים</td><td>קורנינג</td><td>3575</td><td></td></tr><tr><td>CPM</td><td>Invitrogen</td><td>D346</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>D8418</td><td></td></tr><tr><td>משותק TCEP-agarose</td><td>פירס</td><td>77712</td><td></td></tr><tr><td>קורא צלחות מיקרו</td><td>CLARIOstar</td><td></td><td></td></tr><tr><td>אטמי צלחת PCR</td><td>BioRad</td><td>MSA5001</td><td></td></tr><tr><td>L-גלוטתיון מופחת</td><td>סיגמא-אולדריץ</td>' <td>G4251</td><td></td></tr><tr><td>נתרן כלורי</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>S9888</td><td></td></tr><tr><td>נתרן הפס</td><td>סיגמא-אולדריץ'</td><td>RES6007H-A7</td><td></td></tr></tbody></table>

הקרנת שבר קוולנטי באמצעות בדיקת קשירה כמותית בלתי הפיכה

Covalent Fragment Screening Using the Quantitative Irreversible Tethering Assay

בדיקת qIT משמשת כאן לזיהוי פגיעות מקטע קוולנטי עבור חלבון ציסטאין יחיד ללא שם. MgCl2 (10 mM) נוסף למאגרי התגובה מכיוון שחלבון המטרה ידוע להיקשר ליוני Mg2+ . הבדיקה בוצעה בטריפליקט, ונקבע הקצב שבו כל מקטע הגיב הן עם חלבון המטרה (kpro) והן עם גלוטתיון (kGSH). ערכי Z היו גדולים מ-0.5 עבור כל צלחות המרווה והיו בממוצע 0.75 עבור מרווה חלבונית ו-0.79 עבור מרווה גלוטתיון, מה שמצביע על ביצועי בדיקה מצוינים. לאחר מכן חושבו ערכי REF עבור כל מקטע, והכניסות נבחרו כאשר REF &gt;- 3.
התוצאות המייצגות (איור 4), מספקות דוגמה לבחירת פגיעות באמצעות בדיקת qIT. תרכובת 1 הגיבה בקצב גבוה פי 6.0 עם שאריות ציסטאין על חלבון המטרה מאשר עם גלוטתיון, ובאמצעות קריטריון של REF &gt; 3, נבחרה להיט (איור 4B). תאוצת קצב זו מצביעה על נוכחות של אפקט טמפלציה, לפיו אינטראקציות לא קוולנטיות, מציבות 1 בכיוון הנכון עבור הציסטאין על חלבון המטרה להגיב עם ראש הקרב כלורואצטמיד. לעומת זאת, 2 הוא דוגמה למקטע שאינו נפגע מכיוון שהתגובה בין 2 לשאריות ציסטאין המטרה אינה מואצת ביחס לתגובה בין 2 לגלוטתיון. חוסר תאוצת הקצב מצביע על כך שאין אינטראקציות לא קוולנטיות, הממקמות את 2 בכיוון הנכון כדי להגיב עם שאריות ציסטאין המטרה.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67178/67178fig04v2.jpg"> 
תרשים 4: תוצאות מייצגות. התוצאות מראות ניטור תגובת חלבון וגלוטתיון על ידי qIT עבור (A) תגובתיות פנימית גבוהה, מקטע פגיעה חיובי כוזב אפשרי, ו-(B) מקטע פגיעה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67178/67178fig04largev2.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>

Compounds that form covalent bonds with specific target proteins offer a variety of advantages&#160;as chemical probes and therapeutic agents. Most ...

covalent-fragment-screening-using-quantitative-irreversible-tethering

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

האינטראקציה בין ערוצי HCN ו למקטע העזר שלהם זוהה כיעד טיפולי הפרעת דיכאון מג'ורית. כאן, שיטת קרינה מבוססת קיטוב לזיהוי מעכבי מולקולה קטנים של אינטראקציה בין חלבונים זה, מוצגת.

שיטה לזיהוי מולקולה קטנה מעכבים של האינטראקציה בין החלבונים בין HCN1 ו TRIP8b

במאמר זה, פרוטוקול מפורט לכימות אורך הטלומרים באמצעות ניתוח מסוף שונה מגבלה ניתוח נדון המספק מדידה ישירה ויעילה ישירה של אורך הטלומרים. טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על מגוון רחב של מקורות התא של DNA עבור כימות אורך הטלומרים.

שינוי מסוף הגבלת שבירת ניתוח לכימות אורך הטלומרים באמצעות הכלאה ב-ג&#39;ל

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

שיטה מקבילה מאוד למדידת המחשוף הספציפי לאתר של ה-DNA ברמת מולקולה אחת מתוארת. פרוטוקול זה מדגים את הטכניקה באמצעות ההגבלה אנדונוקלאז Nde. ניתן לשנות את השיטה בקלות כדי ללמוד כל תהליך שתוצאות מחשוף DNA ספציפי לאתר.

תפוקה גבוהה מקבילה מולקולה קינטית Assay עבור מחשוף DNA ספציפי לאתר

באמצעות DNA המסומן בנקודות קוונטיות ומיקרוסקופ פלואורסצנטי של השתקפות פנימית כוללת, אנו יכולים לחקור את מנגנון התגובה של אנדונוקלאזות הגבלה תוך שימוש בחלבון ללא תווית. טכניקה זו של מולקולה בודדת מאפשרת תצפית מאסיבית מרובבת של אינטראקציות חלבון-דנ"א בודדות, וניתן לאסוף נתונים כדי ליצור התפלגות זמן מגורים מאוכלסת היטב.

ניתוח זמן שהייה של מולקולה בודדת של מחשוף DNA בתיווך אנדונוקלאז הגבלה

הקרנת שברים קריסטלוגרפיים במלון הלמהולץ-זנטרום ברלין מתבצעת באמצעות זרימת עבודה עם ספריות מורכבות ייעודיות, כלי טיפול בגבישים, מתקני איסוף נתונים מהירים וניתוח נתונים אוטומטי ברובו. הפרוטוקול שהוצג מתכוון למקסם את התפוקה של ניסויים כאלה כדי לספק נקודות התחלה מבטיחות לתכנון ליגנד מבוסס מבנה במורד הזרם.

זרימת עבודה וכלים להקרנת שברים קריסטלוגרפיים בהלמהולץ-זנטרום ברלין

סינון מבוסס מקטעים על ידי NMR הוא שיטה חזקה לזיהוי מהיר של קושרי מולקולות קטנות לביומקרומולקולות (DNA, RNA או חלבונים). מוצגים פרוטוקולים המתארים הכנת דגימות מבוססת אוטומציה, ניסויי NMR ותנאי רכישה ותהליכי עבודה של ניתוח. הטכניקה מאפשרת ניצול אופטימלי של גרעינים פעילים של 1H ו-19F NMR לצורך גילוי.

סינון מקטעים מבוסס NMR במדגם מינימלי אך במצב אוטומציה מקסימלי

מאמר זה מתאר את תהליך XChem המלא לסינון מקטעים מבוסס גביש, החל מהגשת בקשה לגישה וכל השלבים הבאים להפצת נתונים.

השגת סינון מקטעים יעיל במתקן XChem ב-Diamond Light Source

ניטור שינויים בטמפרטורת ההיתוך של חלבון יעד (כלומר,בדיקת משמרות תרמית, TSA) היא שיטה יעילה לבדיקת ספריות שברים של כמה מאות תרכובות. אנו מציגים פרוטוקול TSA המיישם פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית בסיוע רובוטיקה (nano-DSF) לניטור פלואורסצנטיות טריפטופן מהותית ופיזור גב אור להקרנת שברים.

פלואורימטריה סריקה ננו-דיפרנציאלית להקרנה בתגלית עופרת מבוססת שבר

כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי משותף חיידקי של חלבונים מתויגים באופן דיפרנציאלי באמצעות קבוצה של וקטורים תואמים, ואחריה טכניקות משיכה קונבנציונליות לחקר קומפלקסים חלבוניים שאינם יכולים להרכיב במבחנה.

בדיקת משיכה בשילוב עם ביטוי משותף בתאי חיידקים ככלי חסכוני בזמן לבדיקת אינטראקציות חלבון-חלבון מאתגרות

במאמר זה אנו מתארים פרוטוקולים לאפיון ביופיזיקלי של היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה המכוונת לכימרות (PROTACS) המערבות את ליגאזות היוביקוויטין, Von Hippel-Lindau, E3 ligase (VHL) ו-Cereblon (CRBN).  שיטות ביופיזיקליות המודגמות כאן כוללות תהודה פלסמונית פני השטח (SPR), אינטרפרומטריה ביו-שכבתית (BLI) וקלורימטריה טיטרציה איזותרמית (ITC).

פיתוח ויישום של בדיקות ביופיזיקליות להערכת היווצרות קומפלקס טרינרי המושרה על ידי פרוטאוליזה מכוונת כימרות (PROTACS)

למדו את פרוטוקול בדיקת הקשירה הכמותית הבלתי הפיכה (qIT) לזיהוי ליגנדים קוולנטיים סלקטיביים. שיטת פלואורסצנית זו מאפשרת סינון סקלאבילי של אלקטרופילים מבלי להשתמש בספקטרומטריית מסה.

הקרנת שבר קוולנטי באמצעות בדיקת קשירה כמותית בלתי הפיכה

גלה סרטונים נוספים