כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים
8 בנובמבר 2024
נשימה מיטוכונדריאלית בתאים שלמים של שמרים היא אינדיקטור רב ערך לביו-אנרגטיקה של התאים. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לכימות פנוטיפ זה הרלוונטי למיני שמרים שונים.
נשימה מיטוכונדריאלית היא מחולל עיקרי של אנרגיה תאית ברוב הנסיבות, ואינדיקטור חשוב לחילוף החומרים והכושר התאי. לפיכך, תפקודי המיטוכונדריה תוחמים את המצב התאי הביו-אנרגטי. פרוטוקול זה מתאר טכניקה לכימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאים חיים G כפרמטר ביו-אנרגטי.
הטכניקה המתוארת בפרוטוקול זה מסייעת לנו להגדיר את המנגנון הביו-אנרגטי של פוליפנולים מסוימים, כמו רזברטרול וקוארציטן. הוא משמש גם ככלי למדידת חילוף החומרים של הפנטוז, גם של PTSPT ושינוי ביו-אנרגטי מוסבר מאחורי עץ תא הנהג והשפעות עבודת הקרקע. אנו מעוניינים לפענח כיצד תאים רוכשים פנוטיפים מסוימים, כמו עץ תא ואפקטים של עבודת קרקע, עם שינויים משמעותיים בביו-אנרגטיקה התאית.
נשימה מיטוכונדריאלית היא כלי חיוני להבהרת המנגנונים המולקולריים מאחורי תופעה מטבולית זו. כדי להתחיל, יש לחסן מבחנה מזכוכית בנפח 10 מיליליטר המכילה שלושה מיליליטר של מדיום YPD עם 250 מיקרוליטר של תאי שמרים משומרים גליצרול. דגרו את המבחנה למשך הלילה בטמפרטורה של 30 מעלות צלזיוס עם תסיסה מתמדת ב -200 סיבובים לדקה.
לאחר מכן, באמצעות לולאה סטרילית, פס צלחת מקדחה YPD עם תאי השמרים הגדלים במבחנה מזכוכית של 10 מיליליטר. דגרו על צלחת הפטרי בחום של 30 מעלות צלזיוס עד להופעת מושבות מבודדות. להכנת חיסון מקדים, יש לחסן שלושה מיליליטר של מדיום YPD ב-2% גלוקוז עם שתיים או שלוש מושבות שמרים מבודדות ולדגור.
לאחר מכן השג 100 מיליליטר של מדיום שלם סינטטי סטרילי בבקבוק ארלנמאייר בנפח 500 מיליליטר. חסנו את המדיה עם תרבית שמרים לפני חיסון הלילה בצפיפות אופטית ראשונית של 0.1 ב-600 ננומטר. הוסיפו את האתגר הכימי כמו 100 מיקרו-מולארי רסברטרול כדי לבדוק את הנשימה המיטוכונדריאלית.
לאחר מכן, שפכו את תאי שלב היומן האמצעי לתוך צינור חרוטי ריק שנשקל מראש בנפח 15 מיליליטר, וצנטריפוגה את התאים ב-4,000 גרם למשך חמש דקות. לאחר השלכת הסופרנטנט, יש לשטוף את הכדור שלוש פעמים עם 25 מיליליטר מים נטולי יונים. שקלו את הצינור החרוטי המכיל את הגלולה השטופה כדי לקבל את המשקל הרטוב על ידי הפחתת משקל הצינור הריק.
לאחר מכן השעו מחדש את הכדור השטוף בשני מיליליטר מים נטולי יונים. כדי להתחיל, השג את תאי השמרים המטופלים בתרופות מתאימות, כגון רזברטרול. הנח חמישה מיליליטר של מאגר MES-TEA של 10 מילי-מולרי ו-50 מיליגרם של תאים רטובים לתוך תא השתל הקוטבי.
מקם בעדינות, מקם את אלקטרודת החמצן מסוג קלארק, וודא שלא נוצרות בועות. הפעל את צג YSI 5300A ואת מחשב רכישת הנתונים. בחר את חוגת ההגדרה של ערוץ אחד לשידור, והתאם את הערוץ הראשון ל-100% עם חוגת הכיול של הערוץ האחד.
התחל להקליט את הנתונים והתחל למדוד זמן באמצעות כרונומטר. בעזרת מזרק כרומטוגרפיה, הוסף את המצע הניתן לחמצון לריכוז סופי של 10 מילימולר, ושמור על החדר סגור בתסיסה מתמדת. לאחר מכן, באמצעות מזרק כרומטוגרפיה, הוסף אוליגו מיצין כדי לקבל ריכוז סופי של 0.01 מילימולר בתא האוקסימטר ולרשום את צריכת אחוזי האוויר.
באופן דומה, הוסף CCCP לריכוז סופי של 0.015 מילימולר בתא האוקסימטר כדי לקבוע את יכולת הנשימה המקסימלית. לאחר מכן, הוסף מעכבי שרשרת הובלת אלקטרונים, טריפלורוזיטון שיניים ושמן, או TTFA, במילימולר אחד, ואחריו אנטימיצין A במיליגרם אחד למיליליטר. שטפו את התא שלוש פעמים כל אחת עם אתנול 70%, ואחריו מים נטולי יונים, לפני שתמשיכו למקור הפחמן הבא.
כדי להתחיל, בצע בדיקת צריכת חמצן עם תאי שמרים, תוך שימוש במקורות פחמן ובקרות שונות. צור קובץ פרויקט חדש בתוכנה הסטטיסטית ובחר XY בקטע היצירה. לאחר מכן בחר Enter או ייבא נתונים לטבלה חדשה במקטע טבלת הנתונים.
במקטע האפשרויות, בחר מספרים במקטע המשנה X ובתת-המקטע Y. לחץ על הזן שלושה ערכים משוכפלים בעמודות משנה זו לצד זו. הזן נתוני זמן בעמודות X והזן את נתוני אחוז האוויר בעמודות Y.
כדי לבצע ניתוח רגרסיה ליניארית, לחץ על נתח בשורת התפריטים ותחת ניתוח, בחר רגרסיה ליניארית פשוטה בניתוח XY ולאחר מכן לחץ על אישור. השג את ערך השיפוע ממקטע התוצאות בטבלאות נתונים. העתק את ערכי השיפוע המחושבים לגליון נתונים.
הפחיתו את ערך השיפוע המתקבל מתערובת מעכבי הנשימה Mix מאלה של המצע המחמצן, אוליגומיצין ו-CCCP כדי להשליך מקורות צריכת חמצן אחרים. כעת, הכפל את ערכי השיפוע ב-237 מיקרו-מולר של חמצן, המייצג את מסיסות החמצן במצב זה, וחוצץ. המר את הערכים למיקרומולר של חמצן לדקה, תוך התאמה בהתאם לאופן שבו הזמן מתוכנן.
חלקו את התוצאות ב-50, המייצגות את המיליגרם של התאים ששימשו בניסוי. לבסוף, צריכת החמצן מתבטאת כמיקרומולר של חמצן למיליגרם תאים לדקה. תאים שגדלו ב-0.5% גלוקוז הראו צריכת חמצן גבוהה משמעותית בנשימה הבסיסית, נשימה מקושרת ל-ATP ויכולת נשימה מקסימלית, בהשוואה לאלו שגדלו ב-5% גלוקוז.
קוורצטין הפחית באופן משמעותי את הנשימה המיטוכונדריאלית בתאים שגודלו עם 0.5% גלוקוז, מה שהשפיע על הנשימה הבסיסית, הקשורה ל-ATP והמקסימלית. מצד שני, קוורצטין לא השפיע באופן משמעותי על הנשימה המיטוכונדריאלית בתאים, שגדלו ב-5% גלוקוז.
סקירה כללית
פרוטוקול זה מתאר טכניקה לכימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים, המשמשת כאינדיקטור בעל ערך לביואנרגטיקה תאית. ניתן להחיל את השיטה על מיני שמרים שונים, והיא מסייעת להבהיר את המנגנונים הביואנרגטיים של תרכובות כגון פוליפנולים.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום המדע
- מטבוליזם תאי
- ביואנרגטיקה
- פיזיולוגיה של שמרים
רקע
- נשימה מיטוכונדריאלית חיונית להפקת אנרגיה תאית.
- הוא משמש כסמן חשוב למטבוליזם תאי ולכושר (fitness).
- הבנת תפקודי המיטוכונדריה יכולה לסייע בהגדרת המצב הביואנרגטי של תאים.
- מחקר זה מתמקד בהשפעות של פוליפנולים על נשימה מיטוכונדריאלית.
מטרת המחקר
- לכימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים חיים.
- לבחינת מנגנונים ביו-אנרגטיים של פוליפנולים כגון resveratrol.
- לחקירת שינויים בביו-אנרגטיקה התאית הקשורים לפנוטיפים ספציפיים.
שיטות שהושתמשו
- כימות של נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים.
- יישום של הטכניקה על מיני שמרים שונים.
- ניתוח של פרמטרים ביואנרגטיים הקשורים לפוליפנולים.
- מדידה של מטבוליזם של פנטוז והשפעותיו.
תוצאות עיקריות
- הפרוטוקול מכמת ביעילות את הנשימה המיטוכונדריאלית.
- הוא מספק תובנות לגבי ההשפעות הביואנרגטיות של פוליפנולים.
- נצפו שינויים משמעותיים בביואנרגטיקה התאית.
- ניתן להשתמש בשיטה זו כדי לחקור מסלולים מטבוליים שונים.
מסקנות
- טכניקה זו היא כלי בעל ערך לחקר ביואנרגטיקה תאית.
- היא משפרת את ההבנה לגבי האופן שבו תרכובות ספציפיות משפיעות על תפקוד המיטוכונדריה.
- הממצאים תורמים לידע רחב יותר על חילוף החומרים של שמרים.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
כימות נשימה מיטוכונדריאלית בתאי שמרים שלמים מאפשר הערכה ישירה של הביואנרגטיקה התאית בתנאים רלוונטיים פיזיולוגית. גישה זו תומכת בהפחתת סיכונים מכניסטיים בשלבי גילוי מוקדמים על ידי קישור פנוטיפים מטבוליים להתערבויות מולקולריות ולמשתנים סביבתיים. השיטה משפרת את הביטחון החזוי לאישוש מטרות ולסריקת תרכובות בתיקי מחקר מטבוליים ומיטוכונדריאליים.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר בחינה של תפקוד מסלולים מטבוליים והסתגלות בתאים חיים.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות על ידי מדידת תפוקות ביואנרגטיות ישירות.
- מסייע בהפחתת סיכונים מכניסטיים של תרכובות המשפיעות על תפקוד המיטוכונדריה.
- מספק נתונים כמותיים למיון מטרות מטבוליות בתהליכי גילוי.
סריקה ופיתוח בדיקה
- מכין מערכות שמרים מתוקפות לסריקת תרכובות תחת מצבים מטבוליים מוגדרים.
- מספק שיעורי צריכת חמצן כמותיים הניתנים לשחזור לצורך סטנדרטיזציה של הבדיקה.
- מאפשר הערכה של השפעות תרכובות על נשימה תלוית-ATP ונשימה מקסימלית.
- תומך בתהליכי עבודה הניתנים להרחבה להערכת מודולטורים מטבוליים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאימה פנוטיפים מטבוליים לאסטרטגיות של סממנים ביולוגיים תרגומיים במודלים של שמרים.
- מספקת רצף משלב הגילוי ועד לתיקוף פרה-קליני של מטרות מיטוכונדריאליות.
- מאפשרת קידום מותאם סיכונים של מודולטורים מטבוליים בהתבסס על תוצאות פונקציונליות.
- תומכת בהפחתת סיכונים חזויה עבור תרכובות בעלות פגיעה מיטוכונדריאלית.
שילוב תהליכי עבודה וצינור עיבוד
שיטת כימות זו משלבת שלבים החל מגילוי מוקדם ועד לזיהוי מובילים (lead identification), ותומכת הן בבדיקת השערות והן בהערכת תרכובות במסגרת זרימות עבודה של מחקר מטבולי.
- ביולוגיה של גילוי: מאפשר בדיקה מבוססת היפותזות של הסתגלות מטבולית והשפעות של תרכובים בתאים חיים.
- סריקה (Screening): מספקת נתוני צריכת חמצן כמותיים וסטנדרטיים לפיתוח מהימן של בדיקות.
- אנליטיקה: מייצרת מדידות מבוססות רגרסיה ליניארית להשוואה חסונה של תנאי ניסוי.
- מחקר תרגומי: מקשר בין ממצאים במודל שמרים להקשרים רחבים יותר של מחקר מטבולי ומיטוכונדריאלי.
- שימוש חוזר ארגוני: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר להערכת תרכובים והתערבויות מטבוליות מגוונות על פני מיני שמרים שונים.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון החיזוי ומפחית עמימות מכניסטית בתיקוף של מטרות מטבוליות.
- ערך תפעולי: מספק כימות סטנדרטי, הניתן לשחזור ובעל יכולת התרחבות של נשימה מיטוכונדריאלית.
- ערך אסטרטגי: משפר החלטות של go/no-go ויעילות הון באמצעות אספקת מדדים מטבוליים פונקציונליים.
- השפעה על הפורטפוליו: מאפשר תיעוד בעדיפות מותאמת סיכון של מטרות מטבוליות ומיטוכונדריאליות לצורך קידום.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בטיפול בשמרים, בבדיקות מטבוליות ובהפעלת מכשירים של אלקטרודות חמצן.
- נדרשת גישה לתאי אוקסימטריה, לאלקטרודות קלארק (Clark) ולתוכנה לניתוח סטטיסטי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין-צוותית של תנאי הבדיקה ושל פרוטוקולי ניתוח הנתונים.
- עשוי לדרוש התאמה של פאנלים של מעכבים עבור מיני שמרים שונים או הקשרים מטבוליים שונים.
- תלוי בשליטה מדויקת במשתנים סביבתיים ותזונתיים לצורך הדירות (reproducibility).
שאלות נפוצות בנושא ביו-פרמה
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:10
Preparation of Yeast Cultures for Oximeter‐Based Quantification of Mitochondrial Respiration
2:58
Oxygen Consumption Assay (Polarography) to Analyze Yeast Mitochondrial Respiration in Intact Cells Under Nutritional Variations
4:41
Processing Oxygen Consumption Data to Evaluate Mitochondrial Respiration in Intact Yeast Cells Under Various Environmental Conditions
6:30
Results
