Name: הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:20:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: חקור מנגנוני שכפול DNA אאוקריוטי בזמן אמת באמצעות הדמיית מולקולה בודדת של פעילות מנחת CMG ב-Drosophila melanogaster. שיטה זו חושפת דינמיקות חלבוניות ותורמת להבנת תהליכי שכפול גנום.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

<meta charset="utf8"></head><body>התרת DNA בתיווך CMG שנצפתה על ידי צמיחת דרכי ssDNA-RPA

<ol><li>Bell, S. P., Labib, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromosome+Duplication+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Chromosome Duplication in Saccharomyces cerevisiae.</a> Genetics. 203 (3), 1027-1067 (2016).</li>
<li>Costa, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+structural+basis+for+MCM2-7+helicase+activation+by+GINS+and+Cdc45%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The structural basis for MCM2-7 helicase activation by GINS and Cdc45.</a> Nat Struct Mol Biol. 18 (4), 471-477 (2011).</li>
<li>Jones, M. L., Baris, Y., Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+a+human+replisome+shows+the+organisation+and+interactions+of+a+DNA+replication+machine%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Structure of a human replisome shows the organisation and interactions of a DNA replication machine.</a> EMBO J. 40 (23), e108819(2021).</li>
<li>Moyer, S. E., Lewis, P. W., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+Cdc45%2FMcm2-7%2FGINS+%28CMG%29+complex%2C+a+candidate+for+the+eukaryotic+DNA+replication+fork+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Isolation of the Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) complex, a candidate for the eukaryotic DNA replication fork helicase.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (27), 10236-10241 (2006).</li>
<li>Douglas, M. E., Ali, F. A., Costa, A., Diffley, J. F. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+eukaryotic+CMG+helicase+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">The mechanism of eukaryotic CMG helicase activation.</a> Nature. 555 (7695), 265-268 (2018).</li>
<li>Ilves, I., Petojevic, T., Pesavento, J. J., Botchan, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+MCM2-7+helicase+by+association+with+Cdc45+and+GINS+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Activation of the MCM2-7 helicase by association with Cdc45 and GINS proteins.</a> Mol Cell. 37 (2), 247-258 (2010).</li>
<li>Dewar, J. M., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+DNA+replication+termination%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of DNA replication termination.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 18 (8), 507-516 (2017).</li>
<li>Burnham, D. R., Kose, H. B., Hoyle, R. B., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+DNA+unwinding+by+the+eukaryotic+replicative+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The mechanism of DNA unwinding by the eukaryotic replicative helicase.</a> Nat Commun. 10 (1), 2159(2019).</li>
<li>Kose, H. B., Larsen, N. B., Duxin, J. P., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamics+of+the+eukaryotic+replicative+helicase+at+lagging-strand+protein+barriers+support+the+steric+exclusion+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Dynamics of the eukaryotic replicative helicase at lagging-strand protein barriers support the steric exclusion model.</a> Cell Rep. 26 (8), 2113-2125.e6 (2019).</li>
<li>Kose, H. B., Xie, S., Cameron, G., Strycharska, M. S., Yardimci, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplex+DNA+engagement+and+RPA+oppositely+regulate+the+DNA-unwinding+rate+of+CMG+helicase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Duplex DNA engagement and RPA oppositely regulate the DNA-unwinding rate of CMG helicase.</a> Nat Commun. 11 (1), 3713(2020).</li>
<li>Tanner, N. A., Van Oijen, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualizing+DNA+replication+at+the+single-molecule+level%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Visualizing DNA replication at the single-molecule level.</a> Methods Enzymol. 475, 259-278 (2010).</li>
<li>Swoboda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzymatic+oxygen+scavenging+for+photostability+without+ph+drop+in+single-molecule+experiments%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Enzymatic oxygen scavenging for photostability without ph drop in single-molecule experiments.</a> ACS Nano. 6 (7), 6364-6369 (2012).</li>
<li>Baris, Y., Taylor, M. R. G., Aria, V., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+efficient+DNA+replication+with+purified+human+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Fast and efficient DNA replication with purified human proteins.</a> Nature. 606, 204-210 (2022).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tunability+of+DNA+polymerase+stability+during+eukaryotic+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Tunability of DNA polymerase stability during eukaryotic DNA replication.</a> Mol Cell. 77 (1), 17-25.e5 (2020).</li>
<li>Li, Z., Xu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Post-translational+modifications+of+the+mini-chromosome+maintenance+proteins+in+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Genes%22%5BJournal%5D)">Post-translational modifications of the mini-chromosome maintenance proteins in DNA replication.</a> Genes. 10 (5), 331(2019).</li>
<li>Lewis, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+replication+origin+melting+nucleated+by+CMG+helicase+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mechanism of replication origin melting nucleated by CMG helicase assembly.</a> Nature. 606 (7916), 1007-1014 (2022).</li>
<li>Zeman, M. K., Cimprich, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Causes+and+consequences+of+replication+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Causes and consequences of replication stress.</a> Nat Cell Biol. 16 (1), 2-9 (2014).</li>
<li>Sparks, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CMG+helicase+bypasses+DNA-protein+cross-links+to+facilitate+their+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The CMG helicase bypasses DNA-protein cross-links to facilitate their repair.</a> Cell. 176 (1-2), 167-181.e21 (2019).</li>
<li>Taylor, M. R. G., Yeeles, J. T. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+initial+response+of+a+eukaryotic+replisome+to+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The initial response of a eukaryotic replisome to DNA damage.</a> Mol Cell. 70 (6), 1067-1080.e12 (2018).</li>
<li>Amunugama, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Replication+fork+reversal+during+DNA+interstrand+crosslink+repair+requires+CMG+unloading%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Replication fork reversal during DNA interstrand crosslink repair requires CMG unloading.</a> Cell Rep. 23 (12), 3419-3428 (2018).</li>
<li>Wu, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TRAIP+is+a+master+regulator+of+DNA+interstrand+crosslink+repair%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">TRAIP is a master regulator of DNA interstrand crosslink repair.</a> Nature. 567 (7747), 267-272 (2019).</li>
<li>Vrtis, K. B., Dewar, J. M., Chistol, G., Wu, R. A., Graham, T. G. W., Walter, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-strand+DNA+breaks+cause+replisome+disassembly%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Single-strand DNA breaks cause replisome disassembly.</a> Mol Cell. 81 (6), 1309-1318.e6 (2021).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>2-מרקפטואנול</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>M3148-25ML</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide / Bis Solution 40%&nbsp;</td><td>BioRad</td><td>1610148</td><td></td></tr><tr><td>אגרוז אולטרה-פיור&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td>משמש להכנת בופר טריס (pH 8)</td></tr><tr><td>&Auml; KTA Pure&nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>-</td><td>שימש עם Fraction Collector F9-C; מערכת טיהור חלבונים</td></tr><tr><td>ג'ל זיקה M2 נגד דגלים</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>A2220</td><td></td></tr><tr><td>APS 10%&nbsp;</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>A3678-25G</td><td></td></tr><tr><td>ATP (200 מ"מ)</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>A7699-5G</td><td></td></tr><tr><td>ATP-g-s (100 מ"מ)</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>11162306001</td><td></td></tr><tr><td>כיסוי ביוטין-PEG</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>הוכן כפי שתואר: https://doi.org/10.1016/j.ymeth.2012.03.033</td></tr><tr><td>נוגדן אנטי-דיגוקסיגנין ביוטינילated&nbsp;</td><td>פרקין אלמר</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>בלו טאק</td><td>בושטיק</td><td>לא זמין</td><td>פלסטלינה דביקה</td></tr><tr><td>חומצה בורית</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>B/3800/53</td><td></td></tr><tr><td>BSA; 33 מ"ג/מ"ל</td><td>סיגמה-אלדריץ'</td><td>A3858-10G</td><td>מדולל מהמלאי</td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>C7902</td><td></td></tr><tr><td>CaptoHiRes Q (5/50)</td><td>ציטיבה</td><td>29275878</td><td>מחובר למערכת טיהור החלבונים AKTA; עמודת כרומטוגרפיית חילוף יונים ברזולוציה גבוהה</td></tr><tr><td>קזאין (5% במים, 50 מ"ג/מ"ל)</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>C4765-10ML</td><td></td></tr><tr><td>מערכת ChemiDoc</td><td>ביו-ראד</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>קטעים</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>קרש חיתוך</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>צינורות דיאליזה (3.5 kDa)</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>11425859</td><td></td></tr><tr><td>digoxigenin-11-dUTP</td><td>רוש</td><td>11209256910</td><td></td></tr><tr><td>צבע טעינת DNA 6x&nbsp;</td><td>NEB</td><td>B7024S</td><td></td></tr><tr><td>dNTP 10 mM</td><td>NEB</td><td>N0447S</td><td></td></tr><tr><td>סרט דו-צדדי (עובי 0.14 מ"מ)</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>פלואורוכם בע"מ</td><td>M02712-10G</td><td></td></tr><tr><td>DYKDDDDK פפטיד&nbsp;</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>מסונתז על ידי ה-STP בביולוגיה כימית של מכון פרנסיס קריק</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>D/0700/68</td><td></td></tr><tr><td>EGFP-RPA&nbsp;</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>מטוהר כפי שתואר ב' ניתוח מולקולה יחידה', סדרת שיטות בביולוגיה מולקולרית, כרך 783 (2011), פטרמן, א. ג'. ג. וווייט ג'. ג'. ל. עורך, Humana Press. מידע חלבון: 2 מילימטר, אנושי, מבוטא ב-E. coli.</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>03779-10G</td><td></td></tr><tr><td>אפוקסי - 5 דקות</td><td>Devcon</td><td>20845</td><td></td></tr><tr><td>Fujifilm FLA-5000&nbsp;</td><td>פוג'יפילם</td><td>&nbsp; FLA-5000&nbsp;</td><td>מנתח תמונות פלואורסצנטי</td></tr><tr><td>גוון חומצה גרעינית GelRed; 10000x</td><td>קיימברידג' ביוסיינס</td><td>41003-BT</td><td>דוגמה לצביעה בחומצה גרעינית שהיא חלופה בטוחה יותר לאתידיום ברומיד.</td></tr><tr><td>סלייד זכוכית או קוורץ עם חורים לצינורות &nbsp;</td><td>דרמל מודל 395</td><td></td><td>סלייד בעובי 1 מ"מ, חתוך ל-2.4 ס"מ על 1 ס"מ, שני חורים נקדחים במרחק 1.4 מ"מ. יש לקדוח את החורים בגדלים שונים כדי להתאים לצינורות שונים בכל קצה.</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>G/0650/17</td><td></td></tr><tr><td>גליצין HCl, pH 3.5</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>G8898</td><td></td></tr><tr><td>מזרק Hamilton, סדרת 1000 GASTIGHT, מנעול לואר PTFE 1010TLL, מנעול PTFE Luer (עם חריצים), נפח 10 מ"ל</td><td>מרק</td><td>26211-U</td><td></td></tr><tr><td>pH של HEPES 7.5</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>H4034</td><td></td></tr><tr><td>I-CeuI</td><td>NEB</td><td>R0699L</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>P/4280/53</td><td></td></tr><tr><td>מגנזיום אצטט</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>M2545</td><td></td></tr><tr><td>ערכת הדיאליזה Maxi GeBaFlex-tube; MWCO 14 kDa&nbsp;</td><td>ג'נרון</td><td>D055</td><td></td></tr><tr><td>מרית מתכת</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מתכתית</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>M2393</td><td></td></tr><tr><td>מילקס-GP (מסנני מזרק) 0.22 ומיקרו; m&nbsp;</td><td>מרק</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>מחט</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>NotI-HF</td><td>NEB</td><td>R3189L</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4%&ndash; 12% ג'לים לחלבון ביס-טריס</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>10247002;</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE MOPS SDS רץ Buffer&nbsp;</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>NP0001</td><td></td></tr><tr><td>מחמם אובייקטיבי</td><td>אוקולאב</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>מיקס PCR - 2x</td><td></td><td></td><td>הוכן מ-Phusion DNA polymerase (20 ומיקרו; L), dNTPs של 10 mM (40 ומיקרו; L), 5x בופר Phusion HF (400 ומיקרו; L) ומים (540 ומיקרו; L).</td></tr><tr><td>פפטיד NH2-CHHHHHHHHHLPETGG-COOH, מסומן ב-LD655-MAL&nbsp;</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>פפטיד NH2-CHHHHHHHHLPETGG-COOH, שסומן ב-LD655-MAL (טכנולוגיות לומידין) על שארית הציסטאין, סונתז וטוהר על ידי כימיית הפפטידים STP של מכון פרנסיס קריק</td></tr><tr><td>pGC261 פלסמיד</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>https://doi.org/10.1016/j.cell.2018.10.053</td></tr><tr><td>פולימראז DNA באיכות גבוהה של Phusion</td><td>NEB</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>פינצטה מפלסטיק</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>צינור פוליאתילן PE20 (קוטר פנימי 0.015", קוטר חיצוני 0.043")</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>427406</td><td></td></tr><tr><td>צינור פוליאתילן PE60 (קוטר פנימי 0.03", קוטר חיצוני 0.048")</td><td>בקטון דיקינסון</td><td>427416</td><td></td></tr><tr><td>עמודות כרומטוגרפיה פולי-פרפ; 10 מ"ל ו-20 מ"ל;</td><td>ביו-ראד</td><td>7311550</td><td></td></tr><tr><td>אשלגן גלוטמט (L-גלוטמית, מלח אשלגן מונוהידראט)</td><td>סיגמא</td><td>G1501-1KG</td><td></td></tr><tr><td>קוקטייל מעכב פרוטאז (cOmplete, ללא EDTA)</td><td>רוש</td><td>5056489001</td><td></td></tr><tr><td>מזרק יחיד מתוכנת Pump 11 Elite Infusion/Withdrawal</td><td>מנגנון הרווארד</td><td>70-4504</td><td></td></tr><tr><td>ערכת טיהור PCR של QIAquick</td><td>QIAGEN</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>להב סכין גילוח</td><td>VWR אינטרנשיונל בע"מ</td><td>233-0156</td><td></td></tr><tr><td>rCutSmart Buffer; 10 פעמים</td><td>NEB</td><td>B6004S</td><td></td></tr><tr><td>נתרן אצטט</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S/2120/53</td><td></td></tr><tr><td>סורטזה (פנטמוטנט)</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td>מטוהר על בסיס: https://doi.org/10.1073/pnas.1101046108</td></tr><tr><td>מסנני צינורות צנטריפוגה Spin-X; 0.22 ומיקרו; מ. אצטט תאית &nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק</td><td>10310361</td><td></td></tr><tr><td>סכין סטרילית</td><td>לא זמין</td><td>לא זמין</td><td></td></tr><tr><td>מערכת סינון חד-פעמית מונעת בוואקום עם סטיריטופ; 0.22 אממ; PES; &nbsp;</td><td>מיליפור</td><td>S2GPT05RE</td><td></td></tr><tr><td>סטרפטווידין (1 מ"ג/מ"ל) ב-1x PBS buffer</td><td>סיגמא</td><td>S4762-10MG</td><td>20 ומיקרו; L aliquotes</td></tr><tr><td>SYBR Gold</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S11494</td><td>צבע חומצות גרעין רגיש מאוד השתמשנו בו כדי להמחיש את מצע המזלג של DNA.</td></tr><tr><td>SYTOX תפוז; 5 ומיקרו; M ב-DMSO</td><td>תרמו פישר סיינטיפיק</td><td>S11368</td><td></td></tr><tr><td>ליגאז DNA של T4</td><td>NEB</td><td>M0202M</td><td></td></tr><tr><td>בופר תגובת DNA ליגאז T4 &nbsp;</td><td>NEB</td><td>B0202S</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>T9281-25ML&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TEV פרוטאז (1 מ"ג/מ"ל); EZCut&nbsp;</td><td>ביוויז'ן</td><td>7847-10000</td><td></td></tr><tr><td>מטחנות טישו, סוג Dounce (40 מ"ל, Wheaton)</td><td>DWK מדעי החיים</td><td>432-1273</td><td></td></tr><tr><td>בסיס טריס</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>T1503</td><td>משמש להכנת בופר טריס (pH 8)</td></tr><tr><td>טריס HCl</td><td>סיגמא-אלדריץ'</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>טווין-20</td><td>פרומגה בריטניה בע"מ</td><td>H5152</td><td></td></tr></tbody></table>

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור dna על ידי מנחת מסוקים cmg

Single-Molecule Real-Time Visualization of DNA Unwinding by CMG Helicase

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

Faithful genome duplication is essential for preserving the genetic stability of dividing cells. DNA replication is carried out during the S phase by a ...

single-molecule-real-time-visualization-dna-unwinding-cmg

Research

JoVE Journal

Biochemistry

ביוכימיה

פרוטוקול זה מדגים במיקרוסקופ פשוט מולקולה בודדת פלואורסצנציה טכניקה חזותי שכפול ה-DNA על ידי replisomes הפרט בזמן אמת.

חזותי יחיד מולקולת הדנ&quot;א שכפול עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי

אנו מתארים שיטה התבוננות שכפול בזמן אמת של מולקולות דנ"א בודדות מתווכת על ידי חלבונים של מערכת שכפול bacteriophage.

תצפית ישירה של ה-DNA אנזימים שכפול באמצעות DNA מולקולה בודדת מתיחה Assay

אנו מדווחים על אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לצלם ולכמת ישירות את התנועה של מנחת מסוקים Cdc45/Mcm2-7/GINS (CMG) המסומן באופן פלואורסצנטי ומשוחזר במלואו על מולקולות דנ"א ליניאריות המוחזקות במקומן במלכודת אופטית.

אנסמבל היברידי ובדיקת מולקולה בודדת כדי לדמות את התנועה של CMG משוחזר במלואו

פרוטוקול זה מתאר בדיקת שכפול DNA חד-מולקולה מבוססת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית, המאפשרת הדמיה בזמן אמת של אינטראקציות בין פולימראזות DNA ומכשולים כגון מבני G-quadruplex.

הדמיה פלואורסצנטית של מולקולה אחת של דינמיקת DNA פולימראז ב-G-quadruplexes

פרוטוקול זה מדגים תפוקה גבוהה, עמיד ופשוט מולקולה בודדת מתיחה-זרימה assay עבור לומדת מימדי דיפוזיה (1 ד) של מולקולות לאורך הדנ א.

מולקולה בודדת פשוטה, חסון וגבוה התפוקה זרימה מתיחה Assay יישום לימוד התחבורה של מולקולות לאורך הדנ א

ג 'ל מסורתי ג' ל אלקטרופורזה (SGE) ניסויים דורשים מנגנון מסובך וצריכה כימית גבוהה. עבודה זו מציגה פרוטוקול המתאר שיטה זולה להפריד שברי DNA בתוך פרק זמן קצר.

מעקב בזמן אמת של הפרדת ה- DNA הפרדה על ידי הטלפון החכם

פלטפורמה פינצטה מגנטי יחיד מולקולה לתמרן G-quadruplexes מדווח, מה שמאפשר לחקר G4 יציבות ורגולציה על חלבונים שונים.

מולקולה בודדת מניפולציה של G-quadruplexes על ידי פינצטה מגנטי

פרוטוקול זה מתאר את הנייח קוולנטיות של חלבונים עם heterobifunctional silane זיווג סוכן תחמוצת סיליקון משטחים המיועדים ספקטרוסקופיה בכוח כוח אטומי מבוסס מיקרוסקופיה מולקולה בודדת אשר הוא כשניסחתי האינטראקציה של RrgA (pilus-1 עצה adhesin של ס pneumoniae) עם fibronectin.

קיבעון קוולנטיות של חלבונים על ספקטרוסקופיה כוח מולקולה בודדת

קרינה פלואורסצנטית תהודה אנרגיה המבוסס על העברת בזמן אמת התבוננות במערכות ה-dna לנטישה של exchange התגובה מתווכת על-ידי Rad51 פותחו. באמצעות פרוטוקולים המובאת כאן, אנחנו מסוגלים לזהות את היווצרות התגובה intermediates, המרה שלהם לתוך מוצרים, במהלך ניתוח גם את קינטיקה אנזימטי של התגובה.

תצפית בזמן אמת של התגובה Exchange גדיל DNA מתווכת על-ידי Rad51

כאן, אנו מציגים פרוטוקול כדי להעריך את ההומוגניות תיוג עבור כל המינים חלבון במדגם חלבונים מורכבים ברמת מולקולה בודדת.

פרוטאום ברוחב כימות של תיוג הומוגניות ברמת מולקולה בודדת

חקור מנגנוני שכפול DNA אאוקריוטי בזמן אמת באמצעות הדמיית מולקולה בודדת של פעילות מנחת CMG ב-Drosophila melanogaster. שיטה זו חושפת דינמיקות חלבוניות ותורמת להבנת תהליכי שכפול גנום.

הדמיה בזמן אמת של מולקולה בודדת של שחרור DNA על ידי מנחת מסוקים CMG

גלה סרטונים נוספים