Name: קביעת יציבות הסרום של האנזים אדנוזין דמינאז 1 אנושי (וידאו) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-09-27T14:25:00.000+00:00
Duration: 4 min 17 s
Description: חקור שיטות להערכת יציבות סרום של אנזימים לחיזוק פרופילים פרמקוקינטיים ויעילות טיפולית בסרטן. מחקר זה מנחה מהנדסת חלבונים עתידית לשיפור תרופות ביולוגיות.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

1. דגירה בסרום
<ol><li>הכינו מלאי של 10x HsADA1 ב-1x PBS pH 7.4 (1x PBS) בריכוז סופי של 10 מיקרומטר. הפשירו אליקוט של 15 מ"ל של סרום אנושי מאוגד וחממו אותו מראש ל-37°C. לחמם מראש aliquot 50 מ"ל של 1x PBS ל 37 ° C.</li>
	<li>הכינו את תערובות הדגירה של האנזים-סרום על ידי הוספת 100 μL של ציר HsADA1 10x ל-900 μL של סרום אנושי בצינור מיקרוצנטריפוגה בעל קישור נמוך, המכונה תערובת אנזים + סרום. בצינור מיקרוצנטריפוגה נפרד בעל קשירה נמוכה, הוסף 100 μL של מלאי 10x HsADA1 ל- 900 μL של 1x PBS לשם השוואה לבקרה שאינה בסרום, המכונה תערובת אנזים + 1x PBS. הריכוז הסופי של HsADA1 בכל תערובת יהיה 1 מיקרומטר.</li>
	<li>הכינו בקרה נוספת בצינור מיקרוצנטריפוגה בעל קשירה נמוכה המורכב מ-100 μL של 1x PBS מעורבב עם 900 μL של סרום אנושי מאוגם. זה ישמש כבקרה ללא אנזים עבור תערובת אנזים + סרום. בנוסף, בצע בקרה המורכבת מ -1 מ"ל של PBS 1x. זה ישמש כבקרה שאינה אנזים עבור תערובת האנזים + 1x PBS.</li>
	<li>Aliquot 100 μL של כל תערובת משלב 1.2 לתוך צינורות נפרדים בעלי קישור נמוך לדלל 1: 1 עם 100 μL של 30% (v/v) גליצרול ב 1x PBS. יש להקפיא במהירות הבזק עם חנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. דגימות אלה יהיו נקודת הזמן של יום 0, וריכוז HsADA1 בהן יהיה 500 ננומטר. חזור על שלב זה עבור תערובות הבקרה שאינן אנזימים מ-1.3. אוטמים את כל האנזימים ושולטים בתערובות עם סרט שקוף ומניחים אותם באינקובטור של 37°C.</li>
	<li>לאחר 24 שעות, aliquot 100 μL של כל דגימה מודגרת לדלל 1: 1 עם 100 μL של 30% (v/v) גליצרול ב 1x PBS. יש להקפיא במהירות הבזק עם חנקן נוזלי ולאחסן בטמפרטורה של -80°C. דגימות אלה יהיו נקודת הזמן של היום הראשון. החזירו את כל תערובות האנזימים והבקרה לאינקובטור של 37°C. חזור על שלב זה ב- 72 שעות וב- 120 שעות. הערה: דגימות עלי-מצוטטות אינן חייבות בהכרח להיות קפואות באמצעות הבזק. לחלופין, המשתמש יכול לבצע את הבדיקה מבוססת המיקרו-צלחת מיד לאחר לקיחת כל דגימה, אם כי יש להכין עקומות סטנדרטיות טריות ומלאי מצע אדנוזין בכל פעם שהדגימה נבדקת.</li>
</ol>2. בדיקה מבוססת מיקרופלייט
<ol><li>הכינו את קורא המיקרו-לוחות על-ידי הגדרת פרוטוקול קריאה קינטית (איור 2) כדי למדוד את הספיגה ב-260 ננומטר עם מרווח הקריאה הקצר ביותר למשך 30 דקות, ולחמם את הקורא לנקודת קבע של 37°C.</li>
	<li>הפשירו את כל הדגימות שנאספו על קרח. יש לדלל כל דגימה מופשרת ביחס 1:10 באמצעות 1x PBS שחומם מראש ל-37°C כמדלל בצינורות מיקרוצנטריפוגות בעלות קישור נמוך. ריכוז HsADA1 החדש בדגימות אלה יהיה 50 ננומטר.</li>
	<li>בצע דילול של 10x ל-1x PBS גם מדגימת הבקרה של סרום שאינו אנזים. בנוסף, הכינו מלאי אדנוזין של 5 מ"מ על ידי הוספת 66.8 מ"ג אדנוזין ל-50 מ"ל של 1x PBS. הכינו דילול אדנוזין של 250 מיקרומטר על ידי הוספת 400 מיקרוליטר של מלאי האדנוזין ל-7,600 מיקרוליטר של 1x PBS וחממו אותו מראש ל-37 מעלות צלזיוס באינקובטור.</li>
	<li>למיקרו-צלחת תואמת UV של 96 בארות, הוסף 160 μL של דילול אדנוזין של 250 μM ו- 40 μL של כל דגימת חלבון מדולל בטריפליקט לקבלת נפח כולל של 200 μL. זה יניב ריכוז אדנוזין סופי של 200 מיקרומטר וריכוז אנזים סופי של 10 ננומטר.</li>
	<li>חזור על הדילול עבור דגימות הבקרה על ידי הוספת 40 μL של הסרום המדולל או 1x PBS פקדים ו 160 μL של דילול אדנוזין 250 μM במשולש. זה גם יניב ריכוז אדנוזין סופי של 200 מיקרומטר אך ללא אנזים. הערה: ייתכן שיהיה מועיל להוסיף תחילה את כל דגימות האנזים והבקרה המדוללות בנפרד למיקרו-צלחת ולאחר מכן להוסיף את מצע האדנוזין עם מיקרופיפטה של 12 ערוצים כדי להפחית את זמן הטעינה הכולל. בנוסף, יש להשתמש בלוחות שקופים UV בשלב זה כדי למנוע מהצלחת עצמה לבלבל את אות הספיגה הנמדד.</li>
	<li>מדוד את הספיגה של כל באר ב 260 ננומטר במשך 30 דקות ב 37 ° C. לאחר שתסיים, יצא את הנתונים לגיליון אלקטרוני לניתוח נוסף.</li>
</ol>3. ניתוח נתוני קורא microplate
<ol><li>קבע את שיפוע האזור הליניארי של נתוני הספיגה כפונקציה של הזמן עבור הדקות הראשונות של נתוני המיקרו-לוחית. עבור הדגימות המדוללות בסרום, זה התאים ל~120 שניות הראשונות. עבור 1x PBS מדולל דגימות, זה התאים הראשון ~ 270 s. שיפוע זה של ערכי ספיגה יורדים יהיה בעל ערך מספרי שלילי ויהיו לו יחידות שינוי ביחידות הספיגה לשנייה (ΔA260/s).</li>
	<li>החסרו את שיפוע הבקרה השלילית המורכבת מסרום אנושי מאוגד מהשיפוע של נתוני האנזים + הסרום. בצע את אותה פעולה על האנזים + תערובות PBS 1x על ידי חיסור השיפוע של בקרת PBS 1x.</li>
	<li>נרמל את כל השיפועים המותאמים לשיפוע המקורי ב- t=0 h כדי לקבל את חלק הפעילות שנותר באמצעות משוואה 1. <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67216/67216eq01.jpg" style="margin: auto;">משוואה 1</li>
	<li>התווה את שבריר הפעילות שנותר לעומת הזמן.</li>
</ol>

<meta charset="utf8"></head><body>הערכת יציבות הסרום של HsADA1: גישה מבוססת מיקרו-צלחות

<ol><li>Valero, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+serum-stable+RNA+aptamer+specific+for+SARS-COV-2+neutralizes+viral+entry%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">A serum-stable RNA aptamer specific for SARS-COV-2 neutralizes viral entry.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 118 (50), e2112942118(2021).</li>
<li>Iannuzo, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+screening+identifies+synthetic+peptides+with+antibacterial+activity+against+mycobacterium+abscessus+and+serum+stability%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Omega%22%5BJournal%5D)">High-throughput screening identifies synthetic peptides with antibacterial activity against mycobacterium abscessus and serum stability.</a> ACS Omega. 7 (27), 23967-23977 (2022).</li>
<li>Ma, M. T., Jennings, M. R., Blazeck, J., Lieberman, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catalytically+active+holo+homo+sapiens+adenosine+deaminase+i+adopts+a+closed+conformation%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Crystallograph+Sect+D%22%5BJournal%5D)">Catalytically active holo homo sapiens adenosine deaminase i adopts a closed conformation.</a> Acta Crystallograph Sect D. 78 (1), 91-103 (2022).</li>
<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Determination+of+4+nucleosides+via+one+reference+compound+in+chinese+cordyceps+by+hplc-uv+at+equal+absorption+wavelength%5BTitle%5D)+AND+%22Natural+Prod+Comm%22%5BJournal%5D)">Determination of 4 nucleosides via one reference compound in chinese cordyceps by hplc-uv at equal absorption wavelength.</a> Natural Prod Comm. 18 (3), 1934578X231161410(2023).</li>
<li>Whitmore, K. V., Gaspar, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adenosine+deaminase+deficiency+-+more+than+just+an+immunodeficiency%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adenosine deaminase deficiency - more than just an immunodeficiency.</a> Front Immunol. 7, 314(2016).</li>
<li>Jennings, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+expression+and+purification+of+a+human+adenosine+deaminase+in+E.+coli+and+characterization+of+its+asp8asn+variant%5BTitle%5D)+AND+%22Prot+Express+Purificat%22%5BJournal%5D)">Optimized expression and purification of a human adenosine deaminase in E. coli and characterization of its asp8asn variant.</a> Prot Express Purificat. 213, 106362(2024).</li>
<li>Blazeck, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bypassing+evolutionary+dead+ends+and+switching+the+rate-limiting+step+of+a+human+immunotherapeutic+enzyme%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Catalysis%22%5BJournal%5D)">Bypassing evolutionary dead ends and switching the rate-limiting step of a human immunotherapeutic enzyme.</a> Nat Catalysis. 5 (10), 952-967 (2022).</li>
<li>Lu, J., Grenache, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+rapid%2C+microplate-based+kinetic+assay+for+measuring+adenosine+deaminase+activity+in+body+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Clinica+Chimica+Acta%22%5BJournal%5D)">Development of a rapid, microplate-based kinetic assay for measuring adenosine deaminase activity in body fluids.</a> Clinica Chimica Acta. 413 (19), 1637-1640 (2012).</li>
<li>Maciel, L. G., Dos Anjos, J. V., Soares, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+and+low-cost+evaluation+of+hydroxykynurenine+activity%5BTitle%5D)+AND+%22MethodsX%22%5BJournal%5D)">Fast and low-cost evaluation of hydroxykynurenine activity.</a> MethodsX. 7, 100982(2020).</li>
<li>Bokman, A. H., Schweigert, B. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-hydroxyanthranilic+acid+metabolism.+Iv.+Spectrophotometric+evidence+for+the+formation+of+an+intermediate%5BTitle%5D)+AND+%22Arch+Biochem+Biophys%22%5BJournal%5D)">3-hydroxyanthranilic acid metabolism. Iv. Spectrophotometric evidence for the formation of an intermediate.</a> Arch Biochem Biophys. 33 (2), 270-276 (1951).</li>
<li>Tanford, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aTanford%2C+C+%22Advances+in+protein+chemistry%22">Advances in protein chemistry</a>. 23, Academic Press. 121-282 (1968).</li>
<li>Tritsch, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Validity+of+the+continuous+spectrophotometric+assay+of+kalckar+for+adenosine+deaminase+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Validity of the continuous spectrophotometric assay of kalckar for adenosine deaminase activity.</a> Anal Biochem. 129 (1), 207-209 (1983).</li>
<li>Gracia, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+catalytic+site+structural+gate+of+adenosine+deaminase+allosterically+modulates+ligand+binding+to+adenosine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">The catalytic site structural gate of adenosine deaminase allosterically modulates ligand binding to adenosine receptors.</a> FASEB J. 27 (3), 1048-1061 (2013).</li>
<li>Kalckar, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+spectrophotometry+of+purine+compounds+by+means+of+specific+enzymes%3A+Iii.+Studies+of+the+enzymes+of+purine+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bio+Chem%22%5BJournal%5D)">Differential spectrophotometry of purine compounds by means of specific enzymes: Iii. Studies of the enzymes of purine metabolism.</a> J Bio Chem. 167 (2), 461-475 (1947).</li>
<li>Hartwick, R., Jeffries, A., Krstulovic, A., Brown, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+optimized+assay+for+adenosine+deaminase+using+reverse+phase+high+pressure+liquid+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatographic+Sci%22%5BJournal%5D)">An optimized assay for adenosine deaminase using reverse phase high pressure liquid chromatography.</a> J Chromatographic Sci. 16 (9), 427-435 (1978).</li>
<li>Paul, M. K., Grover, V., Mukhopadhyay, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Merits+of+hplc-based+method+over+spectrophotometric+method+for+assessing+the+kinetics+and+inhibition+of+mammalian+adenosine+deaminase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%22%5BJournal%5D)">Merits of hplc-based method over spectrophotometric method for assessing the kinetics and inhibition of mammalian adenosine deaminase.</a> J Chromatography B. 822 (1), 146-153 (2005).</li>
<li>Ubbink, J. B., Vermaak, W. J. H., Bissbort, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-performance+liquid+chromatographic+assay+of+human+lymphocyte+kynureninase+activity+levels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatography+B%3A+Biomed+Sci+Appl%22%5BJournal%5D)">High-performance liquid chromatographic assay of human lymphocyte kynureninase activity levels.</a> J Chromatography B: Biomed Sci Appl. 566 (2), 369-375 (1991).</li>
<li>Tsentalovich, Y. P., Snytnikova, O. A., Forbes, M. D. E., Chernyak, E. I., Morozov, S. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photochemical+and+thermal+reactivity+of+kynurenine%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Eye+Res%22%5BJournal%5D)">Photochemical and thermal reactivity of kynurenine.</a> Exp Eye Res. 83 (6), 1439-1445 (2006).</li>
<li>Demain, A. L., Vaishnav, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+recombinant+proteins+by+microbes+and+higher+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Adv%22%5BJournal%5D)">Production of recombinant proteins by microbes and higher organisms.</a> Biotechnol Adv. 27 (3), 297-306 (2009).</li>
<li>Gräslund, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+production+and+purification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Protein production and purification.</a> Nat Methods. 5 (2), 135-146 (2008).</li>
<li>Faber, M. S., Whitehead, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Data-driven+engineering+of+protein+therapeutics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Data-driven engineering of protein therapeutics.</a> Curr Opin Biotechnol. 60, 104-110 (2019).</li>
<li>Das, S., Zhao, L., Elofson, K., Finn, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enzyme+stabilization+by+virus-like+particles%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Enzyme stabilization by virus-like particles.</a> Biochemistry. 59 (31), 2870-2881 (2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>אדנוזין&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9251-25G</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>BioTek Synergy HT Microplate Reader</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf LoBind צינורות מיקרוצנטריפוגה: חלבון&nbsp;</td><td>פישר סיינטיפיק&nbsp;</td><td>13-698-795</td><td>2 מ"ל</td></tr><tr><td>גליצרול</td><td>פישר מדעי&nbsp;</td><td>G33-4</td><td>4 ליטר</td></tr><tr><td>HsKYNase66-W102H-T333N</td><td></td> סרום אנושי פנימי<td></td><td></td></tr><tr><td>, מאגר</td><td>MP ביו-רפואי</td><td>92931149</td><td>100 מ"ל</td></tr><tr><td>הידרוקסי-קינורנין</td><td>קיימן כימיקלים</td><td>27778</td><td></td></tr><tr><td>אינוזין&nbsp;</td><td>TCI</td><td>I0037</td><td>25 גרם</td></tr><tr><td>PBS, 1x&nbsp; pH 7.4+/- 0.1</td><td>קורנינג</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>פירידוקסל 5-פוספט מונוהידרט, 99%&nbsp;</td><td>Thermo Scientifc</td><td>228170010</td><td>1 גרם</td></tr><tr><td>UV-STAR MICROPLATE, 96 בארות, COC, F-bottom</td><td>Greiner Bio</td><td>&nbsp; </td><td></td>655801</tr><tr><td>אדנוזין דאמינאז אנושי מסוג Wildtype 1</td><td>בבית</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

קביעת יציבות הסרום של האנזים אדנוזין דמינאז 1 אנושי

Determining the Serum Stability of Human Adenosine Deaminase 1 Enzyme

הנתונים מראים את תוצאות הבדיקה שבוצעה עם Wildtype HsADA1. איור 3A,B ממחיש את עקומות הירידה בספיגה ב-260 ננומטר של הדגימות שמקורן בתערובות 1x PBS/סרום-אנזים עבור סוג הבר HsADA1 לאחר הוספת אדנוזין. ירידה זו בספיגה כפונקציה של נתוני זמן היא מה שהמשתמש עשוי לצפות עם סיום מוצלח של הבדיקה מבוססת microplate והוא דומה לנתוני ספיגה שיתעוררו לאחר הוספת כמויות מספיקות של HsADA1 פונקציונלי לאדנוזין. איור 3C,D מדגים את עקומות הספיגה של קבוצת הביקורת השלילית שנבדקה, אשר אינן מכילות אנזים לאחר הוספת אדנוזין. בהשוואה לדגימות האנזים בפועל, שינוי הספיגה של בקרות שליליות אלה הוא כמעט זניח. מאיור 3 ניתן לראות שהשיפועים של עקומות האנזים משתנים כפונקציה של זמן הדגירה. לדוגמה, השיפוע של נקודת הזמן של יום 0 תלול באופן דרסטי מנקודת הזמן של יום 5.
איור 4 ממחיש את חלק הפעילות שנשמר על-ידי טיפוס הבר HsADA1 כפונקציה של הזמן כאשר הוא מודגר ב-PBS 1x או בסרום אנושי משולב ב-37°C. באופן ספציפי, השיפועים של כל עקומות ירידת הספיגה באיור 3A,B מנורמלים לשיפועי יום 0 מהקבוצות שלהם. כפי שניתן לראות באיור 4, יש סטייה בפעילות שנשמרת עבור HsADA1 מסוג בר ב-1x PBS לעומת נסיוב אנושי מאוגם. באופן ספציפי, האנזים מאבד את פעילותו מהר יותר בסרום אנושי מאוגם, כאשר האנזים שומר על כ-10% מפעילותו המקורית ביום 5. אובדן פעילות עדיין ניתן לזהות כאשר HsADA1 מודגר ב-1x PBS, אם כי האנזים שומר על כ-75% מפעילותו. זה עולה בקנה אחד עם התוצאות של Jennings et al., גם דיווח על ירידה בפעילות לאחר דגירה עם סרום ב 37 ° C על ידי כמעט 40% לאחר 48 שעות6. Lu et al. הראו גם כי פעילות HsADA1 יורדת בנוזלי גוף פלאורליים, פריטוניאליים ומוחיים שדרתיים בטמפרטורת הסביבה (25 מעלות צלזיוס)8.
כדי להדגים את הגמישות של פרוטוקול זה, השתמשנו בו כדי לבדוק את יציבות הסרום של אנזים אחר ממקור אנושי, גרסה אנושית מהונדסת של kynureninase שנקראה בעבר HsKYNase66-W102H-T333N7. HsKYNase66_W102H-T333N מזרז ביעילות את ההמרה של OH-Kyn ל-OH-AA, בדומה לאנזים HsKYNase מסוג wildtype, למרות שלמעשה מדובר במוטציה של שתי חומצות אמינו של וריאנט kynureninase אנושי מהונדס עם ספציפיות סובסטרט שונה, כלומר, שמפרק ביעילות קינורנין לחומצה אנתראנילית7. OH-Kyn סופג חזק ב-379 ננומטר, בעוד OH-AA לא, וכתוצאה מכך הספיגה יורדת עם הוספת גרסת HsKYNase המהונדסת שלנול-OH-kyn 9,10. איור 5A,B מדגים את עקומות הירידה בספיגה ב-379 ננומטר של הדגימות שמקורן בתערובות 1x PBS/סרום-אנזים עבור HsKYNase לאחר הוספת OH-Kyn. איור 5C,D ממחיש את עקומות הספיגה של הבקרות שנבדקו שאינן מכילות אנזימים. כפי שניתן לראות עם HsADA1, יש הבדל ברור בשיפועים של עקומות הספיגה על פני דגימות. זה בולט במיוחד באיור 5A, שכן שיפוע נקודת הזמן של 0 שעות תלול בהרבה מנקודות הזמן של 3 שעות ו-24 שעות. איור 6 ממחיש את החלק המתאים של הפעילות שנשמר עבור HsKYNase שנבדק כפונקציה של זמן. כמו HsADA1, HsKYNase66-W102H-T333N מאבד פעילות בסרום מהר יותר מאשר PBS (~85% פעילות אבודה לעומת ~40% במהלך 24 שעות). בעוד יציבות הסרום של גרסה זו של אנזים זה לא נבדקה בעבר, היא עוקבת אחר המגמה הכללית כמו גרסאות HsKYNase אחרות, שגם איבדו את רוב פעילותם בתוך 24 שעות בסרום ב 37 ° C7. 
באופן כללי, אנזימים עלולים לאבד את פעילותם לאורך זמן בגלל שורה של גורמים, כולל pH, ריכוז מלחים, טמפרטורה ועוד11. לכן, תוצאה שאינה עוקבת אחר מגמה זו יכולה להיחשב חריגה. לדוגמה, אם הפעילות האנזימטית גדלה באופן דרסטי עם הזמן, הדבר עשוי להצביע על כך שהתוצאות אינן תקפות. זאת בהנחה שתנאי האנזימים אינם משתנים, ואנו מדברים אך ורק במובן של זמן.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig01.jpg"> איור 1: תרשים זרימה המפרט את שלבי הפרוטוקול עבור HsADA1. האיור מציג את השלבים שבוצעו בפרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig01large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig02.jpg"> איור 2: הגדרות קריאה קינטית של קורא מיקרו-לוחות. פרוטוקול קריאה קינטית נוצר כדי למדוד את הספיגה ב 260 ננומטר במשך 30 דקות ב 37 ° C עם מרווח מינימלי. האיור מתאר את ההגדרות שנבחרו להגדרת פרוטוקול זה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig02large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig03.jpg"> איור 3: ספיגה לעומת עקומות זמן עבור HsADA1 לאחר תוספת של אדנוזין של 200 מיקרומטר. (A) ספיגה לעומת עקומות זמן עבור HsADA מודגר בסרום1 לאחר תוספת של אדנוזין של 200 מיקרומטר. (B) 1x PBS מודגר HsADA1. (C) שליטה שלילית בסרום. (D) 1x PBS שליטה שלילית (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig03large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig04.jpg"> איור 4: שימור פעילות HsADA1. הפעילות מוערכת ב-1x PBS לעומת סרום אנושי משולב ב-37°C. נקבע חלק הפעילות המקורית שנשמרה עבור HsADA1 מודגר ב-1x PBS לעומת סרום אנושי מאוגד במשך 5 ימים (bars = mean ± SD, n=3). נעשה שימוש במבחן t דו-זנבי לא מזווג *p&lt;0.05, **p &lt; 0.01 ו- ***p &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig04large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig05.jpg"> איור 5: ספיגה לעומת עקומות זמן עבור HsKYNase66-W102H-T333N לאחר תוספת של 400 מיקרומטר OH-Kyn. (A) ספיגה לעומת עקומות זמן עבור HsKYNase מודגר בסרום לאחר תוספת של 400 מיקרומטר OH-Kyn. (B) 1x PBS מודגר HsKYNase. (C) שליטה שלילית בסרום. (D) 1x PBS שליטה שלילית (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig05large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67216/67216fig06.jpg"> איור 6: שימור פעילות HsKYNase66-W102H-T333N. הפעילות מוערכת ב-1x PBS לעומת סרום אנושי משולב ב-37°C. נקבע שבריר הפעילות המקורית שנשמרה עבור HsKYNase66-W102H-T333N שהודגר ב-1x PBS לעומת סרום אנושי מאוחד במשך 24 שעות (bars = ממוצע ± SD, n=3). נעשה שימוש במבחן t לא מזווג דו-זנבי; עמ' &lt; 0.001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/67216fig06large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.</a>
איור משלים 1: עקומה סטנדרטית של אדנוזין ואינוזין. העלילה צוירה עבור 0-200 מיקרומטר. אדנוזין או אינוזין נוסף ל-1x PBS בריכוזים שצוינו, ואז נמדדה הספיגה ב-260 ננומטר. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 2: עקומה סטנדרטית של OH-Kyn. העלילה צוירה עבור 0-400 מיקרומטר. OH-Kyn נוסף ל-1x PBS בריכוזים שצוינו, ואז נמדדה הספיגה ב-379 ננומטר. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%202.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 3: ספיגה לעומת עקומות זמן ב-260 ננומטר עם עלייה בריכוזים של HsADA1 לאחר תוספת של אדנוזין של 200 מיקרומטר. (A) עקומות תגובה לריכוזים משתנים של HsADA1. (B) שינוי קיפול בשיפוע האזור הליניארי של עקומות הבליעה ביחס לבקרת PBS 1x (עמודות = ממוצע ± SD, n=3). נעשה שימוש במבחן t דו-זנבי לא מזווג **p &lt; 0.01 ו- ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%203.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
איור משלים 4: ספיגה לעומת עקומות זמן ב-379 ננומטר עם ריכוזים הולכים וגדלים של HsKYNase מהונדס לאחר תוספת של 400 מיקרומטר של OH-Kyn. (A) עקומות תגובה עבור ריכוזים משתנים של HsKYNase מהונדס. (B) שינוי קיפול בשיפוע האזור הליניארי של עקומות הבליעה ביחס לבקרת PBS 1x (עמודות = ממוצע ± SD, n=3). נעשה שימוש במבחן t דו-זנבי לא מזווג ****p &lt; 0.0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%204.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>
תרשים משלים 5: ספיגה לעומת עקומות זמן ב-379 ננומטר באמצעות אנזים מנוטרל חום ב-400 מיקרומטר של OH-Kyn. אנזים HsKYNase מנוטרל חום נוסף ל-400 מיקרומטר של OH-Kyn ב-1x PBS, ואז נמדדה ספיגה של 379 ננומטר. (n=3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67216/Supplementary%20Figure%205.pdf" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להוריד קובץ זה.</a>

The concept of enzyme stability is typically used to refer to an enzyme's thermostability - its ability to retain structure and activity as temperature ...

determining-the-serum-stability-of-human-adenosine-deaminase-1-enzyme

Research

JoVE Journal

Bioengineering

הנדסה ביולוגית

שיטה להגדרה של פעילות קינאז אצטט מתואר. Assay זה מנצל תגובה ישירה לקביעת פעילות האנזים ועל קינטיקה של קינאז אצטט בכיוון אצטט יוצרי עם acceptors phosphoryl שונים. יתר על כן, שיטה זו יכולה להיות מנוצל עבור assaying פוספט אצטיל אחרים או אצטיל-CoA אנזימים ניצול.

זיהוי ישיר של פעילות Acetate יוצרי של קינאז Acetate אנזימים

במאמר זה אתאר את הליך סינתזה אנזים שונה hydrophobically Nafion immobilization קרום ואיך לשתק חלבונים ו / או אנזימים בתוך קרום ולבדוק הפעילות הספציפיים שלהם.

Nafion הידרופובי מלח, שונה עבור Immobilization האנזים ייצוב

סרטון זה מסביר שיטת כרומטוגרפיה נוזלית כמותית הפוכה בעלת ביצועים גבוהים (RP-HPLC) למדידת חילוף החומרים של אדנוזין ופורינים הקשורים הנוצרים על ידי צריכת AMP בסביבה חוץ-תאית של תאי סרטן לוקמיים. הפרוטוקול מתאר בדיקת RP-HPLC רגישה, ספציפית, אמינה וניתנת לשחזור, שפותחה ואומתה לכימות נוקלאוטידים ונוקלאוזידים פורין חוץ-תאיים המיוצרים על ידי תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית מטוהרים (CLL) בתנאי תרבית שונים.

מטבוליזם פורין חוץ-תאי: בדיקה מבוססת HPLC למדידת ייצור אדנוזין ומטבוליזם בתאים לוקמיים

כימית biomimetic הרדיקלי מבוססת הוחלה ספריות בניין עד נחוצות לפיתוח סמן ביולוגי.

רדיקלים חופשיים בביולוגיה כימית: מהתנהגות כימית לפיתוח סמנים ביולוגיים

PAD4 הוא אנזים האחראי להמרה של פפטידיל-ארגינין לפפטידיל-ציטרולין. חוסר ויסות של PAD4 מעורב במספר מחלות אנושיות. מתוארת בדיקת PAD4 מבוססת פלואורסצנטיות תואמת קלה ובעלת תפוקה גבוהה.

ניטור קרינה מבוססת פעילות PAD4 באמצעות אנלוגי מצע פרו-הקרינה

הפרוטוקול המתואר כאן מייצג שיטה קלה וניתנת לשחזור המשתמשת בכרומטוגרפיה נוזלית בעלת ביצועים גבוהים בשלב הפוך (RP-HPLC) כדי למדוד את חילוף החומרים של פורין על תאי לוקמיה לימפוציטית כרונית (CLL) שגודלו בתנאים שונים.

HPLC מבוססי Assay לפקח תאיים נוקלאוטיד / מטבוליזם nucleoside בתאי לוקמיה לימפוציטית כרונית

יציבות תרמית של פעילות אנזים נמדד בקלות על ידי טיטור איזותרמי calorimetry (ITC). כיום, רוב מבחני יציבות חלבון המשמש מדד חלבון התגלגלות, אבל אינם מספקים מידע אודות פעילות אנזימטיות. המרכז לטניס בישראל מאפשר קביעה ישירה ההשפעה של שינויים האנזים על היציבות של פעילות אנזים.

מדידת אנזימטי יציבות על ידי טיטור איזותרמי Calorimetry

באמצעות שיטת הסריקה (NADH)-ביחד התאמה ATPase הותאמה הקרנה חצי תפוקה גבוהה של מולקולה קטנה רירן מעכבי. זה שיטת הקינטי מופעל בפורמט 384-היטב אימונולוגיה עם כמויות התגובה הכולל של רק 20 μl לכל טוב. הפלטפורמה צריכה להיות ישימה כמעט כל הפקת האנזים.

הסתגלות למחצה בתפוקה גבוהה של מעכבי הנדח ביחד לסינון מולקולה קטנה

חמצון פוטוכימי מהיר של חלבונים היא טכניקה מתפתחת לאפיון מבני של חלבונים. תוספי ממס שונים ליגנדים יש תכונות שונות הידרוקסיל רדיקלי ים. כדי להשוות את מבנה החלבון בתנאים שונים, פיצוי בזמן אמת של רדיקלים הידרוקסיל שנוצר בתגובה נדרש כדי לנרמל את תנאי התגובה.

מתן אפשרות לפיצוי בזמן אמת בחומציות פוטוכימיות מהירות של חלבונים לקביעת שינויים בטופוגרפיה של חלבונים

פרוטוקול זה מתאר שיטה קולורימטרית להערכת השפעה אמינה של כימיקלים על פעילות דיאודינאז 1 (DIO1) במיקרוסומי כבד אנושי באמצעות תגובת סנדל-קולטוף. הוא כולל קריטריוני קבלה מוגדרים מראש ומדדי ביצועים סטטיסטיים ותומך במאמצים מתמשכים להכללת הנחיות מבחן ב-OECD.

הערכה קולורימטרית של פעילות דיאודינאז 1 במיקרוזומי כבד אנושי באמצעות תגובת סנדל-קולטהוף

חקור שיטות להערכת יציבות סרום של אנזימים לחיזוק פרופילים פרמקוקינטיים ויעילות טיפולית בסרטן. מחקר זה מנחה מהנדסת חלבונים עתידית לשיפור תרופות ביולוגיות.

קביעת יציבות הסרום של האנזים אדנוזין דמינאז 1 אנושי

גלה סרטונים נוספים