כימות של לויקוציטים דבקים המושרים על ידי סוכרת בכלי הדם ברשתית
24 בינואר 2025
אנו מדגימים שיטה לתיוג דפנות כלי הדם ברשתית ולויקוציטים דביקים. לאחר מכן ניתן לספור את הלויקוציטים הדבקים הללו במיקרוסקופ פלואורסצנטי כפרמטר לדלקת או לתגובה של דלקת זו לטיפולים.
מוקד המחקר במעבדה שלנו הוא ללמוד מה גורם לרטינופתיה בסוכרת וכיצד ניתן למנוע אותה. מספר מעבדות הראו כי הלויקוסטזיס, הצטברות יתר של תאי דם לבנים, בכלי הדם הקטנים של העין מגבירה את הסוכרת. וזה עשוי לתרום לחסימה וניוון של כלי הדם ברשתית בסוכרת. טכניקה זו מאפשרת הדמיה וכימות של חומרת הלויקוסטזיס בכלי הדם ברשתית. וניתן להשתמש בו במחקרים שרוצים להעריך את יעילותם של טיפולים שונים, כולל תרופות.
[מדריך] כדי להגדיר את אינפוזר הלחץ, חבר בסדרה את שקית המלח 0.9%. סט הצנתר התוך-ורידי, שסתום פקק ארבעה כיוונים ומחט הגאווג'. פתח את מערכת הזלוף ושטוף את הקווים והיציאות במי מלח למשך שתי דקות בקצב זרימה של 18 עד 20 מיליליטר לדקה כדי להסיר בועות אוויר. הניחו את העכבר המורדם על שלב הזילוף. זהה את תהליך ה- xiphoid באופן חזותי. עם המוסטט ביד הדומיננטית, אבטח ונעל את העור. לאחר מכן העבירו את המוסטט ליד הלא דומיננטית והרימו את העור. לאחר מכן, בעזרת מספריים, חותכים כתם עור בזווית של 90 מעלות לעמוד השדרה כדי לחשוף את דופן הבטן החיצונית. כאשר תהליך ה-xiphoid וכלוב הצלעות גלויים, נתח דו-צדדית דרך דופן הבטן, הימנע בזהירות מכל איבר או כלי דם עיקריים. כעת, דמיינו את חדרי הלב והריאות דרך הסרעפת. בעזרת קצה המספריים, בצע חתך בסרעפת בצד אחד ליד עמוד השדרה. חשוף את הלב בחלל בית החזה לאחר חיתוך עצם החזה. עם מלקחיים ביד הלא דומיננטית, אחוז בלב ליד קודקודו. בעזרת היד הדומיננטית, החזק את מחט הגוואג' המחוברת לצנתר התוך ורידי ונקב את קודקוד הלב. ודא שקצה הכדור של מחט הגאווג' בולט מעט ממקום הניקוב כדי למנוע ניקוב מלא של החדר השמאלי או כניסה לכלי הדם הריאתיים. לאחר מכן, פתח את תא העצירה כדי לאפשר זרימה של 0.9% מלח. במקביל, השתמש במספריים כדי לחתוך את האטריום הימני. המשך בזלוף במשך שתיים-שלוש דקות, הזז את המחט בעדינות מצד לצד ולמעלה ולמטה כדי למנוע כיווץ כלי דם ולהגביר את ניקוז הדם מהלב. לאחר הזלוף, סובב את ידית תא העצירה כדי לכבות את זרימת המלח ולאפשר זרימה מהמזרק למחט הגאווג'. לאחר מכן יש להחדיר ידנית 10 מיליליטר של תמיסת concanavalin A תוך 30 עד 35 שניות. לאחר החדרת ליבו של עכבר מורדם בתמיסת concanavalin A, סובב את העכבר על צדו. הנח את האצבע המורה של היד הלא דומיננטית על העפעף העליון ואת האגודל על העפעף התחתון. יש למשוך בעדינות את העפעפיים והעור שמסביב כדי לחזק את העין, ולאפשר לה לבלוט חלקית מהשקע. לאחר מכן, בעזרת המספריים המעוקלים ביד הדומיננטית, גרפו מתחת לעין בזווית של 45 מעלות. חתוך את חיבורי השרירים ואת עצב הראייה. בעזרת המספריים כמרית, העבירו את העין למיכל קטן. יש להניח את העין על שעווה דנטלית כדי להתכונן לפתיחת הגלובוס. מתחת למיקרוסקופ הניתוח, בעזרת מיקרו מלקחיים, החזיקו את הקפל הסקלרלי או את שאריות השריר המחוברים לחלק האחורי של העין וכוונו את העין כך שהקרנית פונה לצד אחד. בצע חתך מאחורי הלימבוס ובמקביל לו. השתמש במספריים מיקרו כדי להפריד את החלק הקדמי של העין, כולל העדשה סביב היקף העין, וודא שהרשתית מנותקת לחלוטין מהסקלרה. הוציאו את הרשתית מהסקלרה בעזרת המיקרו מרית. אם הרשתית עדיין מחוברת על ידי עצב הראייה, הכנס מספריים זעירים בין הרשתית לסקלרה כדי לנתק את עצב הראייה. הנח את הרשתית הלא קבועה על שקופית עם טיפת PBS. בצע ארבעה עד חמישה חתכים רדיאליים לתוך הרשתית, וצור דפוס עלה תלתן כך שהוא ישכב שטוח. התבונן ברשתית המותקנת השטוחה מתחת למיקרוסקופ בהגדלה של פי 100 באמצעות מטרה של פי 10. מיקרוסקופיה פלואורסצנטית של כלי הדם ברשתית הראתה כי רשתית סוכרתית הראתה לויקוסטזיס קל עם 3 עד 12 לויקוציטים לרשתית בהשוואה ל-1 עד 3 בבקרות שאינן סוכרתיות. אשכולות לויקוציטים משמעותיים נצפו במודלים דלקתיים מאותגרים על ידי ליפופוליסכרידים בניגוד לאשכול הקל בדגימות סוכרתיות.
צפו בתמליל המלא וקבלו גישה לאלפי סרטונים מדעיים
סקירה כללית
מחקר זה מציג שיטה לסימון כלי הדם ברשתית ולבנויות של לוקוציטים דבקים, המאפשרת את כימותם תחת מיקרוסקופיה פלואורסצנטית. טכניקה זו משמשת כפרמטר להערכת דלקת ויעילותן של התערבויות טיפוליות.
מרכיבי מפתח של המחקר
תחום מדע
- מדעי המוח
- רפואת עיניים
- מחקר דלקות
רקע
- רטינופתיה היא סיבוך נפוץ של סוכרת.
- לוקוסטזיס (leukostasis), או הצטברות של תאי דם לבנים, תורמת לניוון של כלי הדם ברשתית.
- הבנת הלוקוסטזיס יכולה לסייע בהערכת היעילות הטיפולית.
- ויזואליזציה וכימות של לוקוציטים בכלי הדם של הרשתית הם קריטיים לצורכי מחקר.
מטרת המחקר
- פיתוח טכניקה להדמיה של לוקוסטזיס ברשתית.
- כימות של הצטברות לוקוציטים ברשתיות סוכרתיות.
- הערכת ההשפעה של טיפולים שונים על דלקת ברשתית.
שיטות שנעשה בהן שימוש
- ביצוע פרפוזיה לעכברים מורדמים עם תמיסת מלח (saline) ו-concanavalin A.
- ניתוח של העין לצורך בידוד הרשתית.
- הכנת הרשתית עבור מיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- כימות של לוקוציטים ברשתית של עכברים סוכרתיים וביקורת.
תוצאות עיקריות
- רשתות ססנתיות (retinas) סוכרתיות הראו לוקוסטזיס (leukostasis) קל, עם 3 עד 12 לוקוציטים לרשתית.
- רשתות ססנתיות של קבוצת הביקורת הראו 1 עד 3 לוקוציטים.
- צבירי לוקוציטים משמעותיים נצפו במודלים דלקתיים.
- שיטה זו מאפשרת הערכה יעילה של תגובות טיפוליות.
מסקנות
- הטכניקה שפותחה יעילה לחקר דלקת ברשתית.
- כימות של לוקוציטים יכול לספק תובנות לגבי רטינופתיה סוכרתית.
- ניתן להחיל שיטה זו להערכת אסטרטגיות טיפוליות שונות.
שאלות נפוצות
רלוונטיות תעשייתית למנהלים
הערכה כמותית של לוקוסטזיס (leukostasis) המושרה על ידי סוכרת בכלי הדם של הרשתית נותנת מענה לפער קריטי במחקר טרום-קליני על דלקות, ומאפשרת הערכה אובייקטיבית של נטל הדלקת בכלי הדם. שיטה זו תומכת בהסרת סיכונים מכניסטיים ובתיקוף מטרות עבור טיפולים המיועדים לרטינופתיה סוכרתית וסיבוכים וסקולריים קשורים. כימות אמין של לוקוציטים דבקים מסייע לגילוי מוקדם ולקבלת החלטות תרגומיות בפורטפוליו של מחקרים בתחומיB עיקר הרפואה של העין והדלקות.
יישומים אסטרטגיים במחקר ופיתוח בביופארמה
גילוי מוקדם ותיקוף מטרה
- מאפשר מדידה ישירה של היצמדות לוקוציטים כסמן ביולוגי מכניסטי לדלקת כלי דם.
- תומך בתיקוף תפקודי של מטרות טיפוליות המעורבות בפתוגנזה של רטינופתיה סוכרתית.
- מסייע במחקרים מונחי-השערה על מסלולים דלקתיים במערכות רלוונטיות למחלה.
סריקה ופיתוח בדיקות (Assay)
- מספק קריאה סטנדרטית וכמותית להערכת היעילות של תרכובים נוגדי דלקת in vivo.
- קובע קריטריונים הניתנים לשחזור עבור פיתוח בדיקה המבוססת על כימות במיקרוסקופיה פלואורסצנטית.
- מאפשר השוואה בין מחקרים שונים של חומרת הלוקוסטזיס (leukostasis) תחת תנאים ניסיוניים או טיפוליים שונים.
מחקר תרגומי ופרה-קליני
- מתאים מודלים של דלקת בשלב הפרה-קלניי עם נקודות סוף רלוונטיות למחלה עבור רטינופתיה סוכרתית.
- תומך בפיתוח ביומרקרים תרגומיים על ידי קישור כימות לוקוסטזיס לתוצאות וסקולריות.
- מספק מידע לקידום מותאם סיכונים של טיפולים מועמדים המכוונים לדלקת ברשתית.
שילוב תהליכי עבודה וצנרת נתונים
שיטת כימות זו משתלבת ברצף שבין שלב הגילוי לשלב הפרה-קליני, ומגשרת בין מחקרים מכניסטיים למחקר תרגומי על דלקות באופתלמולוגיה.
- ביולוגיה של הגילוי: מאפשרת בדיקת השערות על אינטראקציות בין לוקוציטים לאנדותל ומנגנונים דלקתיים במודלים של סוכרת.
- סריקה: מספקת בדיקה כמותית חסונה להערכת התערבויות מועמדות המכוונות לדלקת כלי דם.
- אנליטיקה: מספקת נתונים אובייקטיביים של ספירת לוקוציטים להשוואה בין קבוצות מחלה, ביקורת וטיפול.
- מחקר תרגומי: מקשרת נקודות קצה של לוקוסטזיס פרה-קליניות לרלוונטיות קלינית במחקר של רטינופתיה סוכרתית.
- שימוש חוזר בארגון: מציעה פלטפורמה לשימוש חוזר לכימות דלקת במגוון מודלים של מחלות כלי דם ומחלות עיניות.
השפעה תפעולית וארגונית
- ערך מדעי: מגביר את הביטחון בחיזוי בתהליכי תיקוף מטרות והסרת סיכונים מנגנוניים עבור דלקת כלי דם.
- ערך תפעולי: מבצע סטנדרטיזציה של הכימות של לוקוציטים נצמדים, ובכך משפר את השחזוריות והיכולת להרחבת קנה המידה.
- ערך אסטרטגי: מאפשר קבלת החלטות מושכלת של המשך או הפסקת פיתוח (go/no-go) עבור טיפולים אנטי-דלקתיים ומכווני כלי דם.
- השפעה על פורטפוליו: תומך בתעדוף מועמדים מותאם סיכון בקווי פיתוח של עיניים ודלקות.
שיקולי יישום
- דורש מומחיות בביצוע פרפוזיה בבעלי חיים קטנים, דיסקציה של הרשתית ומיקרוסקופיית פלואורסצנציה.
- מחייב גישה לפלטפורמות דימות מתוקפות ולכלים לניתוח כמותי.
- מחייב סטנדרטיזציה בין צוותים של פרוטוקולי הפרפוזיה והצביעה לצורך הדירות (reproducibility).
- התאמה למערכות כלי דם אחרות או למודלים של מחלות עשויה לדרוש אופטימיזציה של הפרוטוקול.
- כימות ידני עלול להגביל את התפוקה ולהביא לשונות בין מבצעים.
